通过流式细胞术对GLUT4向质膜转位进行定量测量

本实验的总体目标是检测胰岛素刺激下 GLUT4 向哺乳动物细胞质膜的转位。首先将血清饥饿的成肌细胞接种于 24 孔培养板中，这些细胞内的 GLUT4 蛋白仅存在于胞内囊泡中；随后加入针对 GLUT4 外部表位的抗体，该抗体事先已与荧光标记的二抗进行预孵育，接着再加入胰岛素。

细胞表面的胰岛素受体被激活后，会引发葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）向质膜表面转位。随后，培养基中的抗体可识别GLUT4。此时，可对细胞进行固定，并通过流式细胞术检测荧光染色的强度。

该方法可用于研究 GGL4 转位和葡萄糖代谢，也可应用于其他系统，例如通过细胞膜表面 CD107a 的暴露来检测 NK 细胞脱颗粒。进行此操作时，应使用处于活跃生长期或汇合度为 60% 至 80% 的细胞，并在实验前经血清饥饿处理过夜。用胰酶消化收集细胞后，用常规培养基洗涤并重悬细胞，浓度为每毫升 200,000 个细胞，在 24 孔板中每孔加入 500 微升，每孔接种 10 万个细胞。随后将细胞在 37°C 下孵育 1 小时，以使细胞从胰酶消化中恢复。

在此期间，将抗谷胶蛋白四抗体与 Alexa Fluor 488 标记的二抗（鸡抗小鼠 IgG）按 5:1 的比例混合，计算所需终体积，注意每个样本孔将使用 10 微升抗体混合液。将抗体混合液于室温避光孵育 10 分钟。在抗体混合液孵育的同时，用生长培养基将胰岛素稀释至所需浓度，配制为 2 倍工作浓度的储备液。

细胞孵育一小时后，将其从培养箱中取出。向每孔细胞中轻柔加入10 µL抗体溶液。注意至少保留一个孔不进行染色。

此阴性样本将用于后续流式细胞仪的设置。接下来，向每个孔中加入500微升的两倍胰岛素储备液，以诱导GLUT4向细胞表面转位，并将培养板在37°C避光条件下孵育30分钟。从培养箱中取出细胞后，通过向每孔加入1毫升含1%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞，并在室温避光条件下孵育20分钟。使用细胞刮轻轻将固定的细胞从孔底刮下，并将每孔中的细胞分别转移至对应的流式管中。

离心试管以沉淀细胞，然后涡旋并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞进行洗涤，再次离心。重复洗涤一次，共洗涤两次，每次洗涤之间弃去上清液。

最后，将洗涤后的细胞重悬于400微升含1%多聚甲醛的PBS中。此时，细胞可用于流式细胞仪检测GLUT4的表面表达水平。将样本送至流式细胞仪后，首先采集未染色对照样本的数据。

使用前向散射和侧向散射参数定义一个宽泛的活细胞门控。然后调整FL1通道的电压设置，使阴性峰位于直方图的显示范围内。参数设定完成后，对每个实验样本进行检测，每管至少记录10,000个活细胞事件。

该直方图显示了暴露于 0、1、10 或 100 纳摩尔胰岛素的成肌细胞表面 Glu4 染色的上调情况。相比之下，来自胰岛素抵抗个体的成肌细胞在 100 纳摩尔胰岛素刺激下未能上调 Glu4。如果将刺激细胞的平均荧光强度归一化至未刺激细胞的荧光强度，则可直接比较健康个体与胰岛素抵抗个体成肌细胞的 MFI 值。

通过此方法，可对混合细胞群体中的细胞进行额外的表面或胞内标志物染色，以鉴定不同的细胞亚群。