Name: 切片的制备，组织器官型培养，并记录在视交叉上核时钟基因活性的荧光素酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学习制备小鼠视交叉上核脑片并进行器官型培养，利用荧光素酶报告基因技术连续记录生物钟基因表达的昼夜节律振荡。该方法为神经科学和昼夜节律研究提供了高时间分辨率的体外分析手段。

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本工作由瑞典医学研究理事会（K2009-75SX-21028-01-3，K2008-61X-20700-01-3）、FONCICYT 000000000091984、Jeansson基金会、Söderström Königska sjukhemmet基金会、Märtha Lundqvist基金会以及Sigurd och Elsa Goljes Minne基金会和瑞典医学学会SLS-95151资助。感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）Gene D. Block教授对稿件提出的宝贵意见。我们感谢Michael Andäng博士和Helena Johard博士提供HCN通道阻滞剂，感谢Abdel El-Manira教授提供视频显微镜。
伦理考量：
所有动物实验均依照卡罗林斯卡学院和“斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会”的指南与规定进行。所有动物实验均以尽量减少动物可能遭受的应激或不适为目的而开展。

1. 溶液配制
<ol>
<li>具有空气缓冲能力的培养基
<ol>
<li>取一个1升的瓶子，加入约800 mL无菌H2O（经高压灭菌的milliQ H2O）。</li>
<li>在搅拌的同时，依次加入并混合以下成分：1瓶不含碳酸氢钠和酚红的低糖无血清DMEM 2902粉末（酚红会干扰生物发光信号），20 mL 50倍浓缩的B27添加剂，4.7 mL 7.5% NaHCO3溶液（或0.35 g NaHCO3），10 mL 1 M HEPES，2.5 mL 10,000 U/mL青霉素-链霉素溶液，以及3.5 g D-葡萄糖。持续搅拌培养基，直至所有成分完全溶解。 
最终培养基（1升）的组成为： 
1× DMEM，1× B27添加剂，4.2 mM NaHCO3，10 mM HEPES，25 U/mL青霉素，25 U/mL链霉素，以及19 mM D-葡萄糖。</li>
<li>使用NaOH降低或HCl升高pH值，将pH调节至7.2，并用无菌H2O定容至1升。</li>
<li>通过H2O（降低渗透压）或D-葡萄糖（升高渗透压）调节渗透压。渗透压应在285–315 mOsm/kg之间，最佳范围为300–310 mOsm/kg。培养基稀释程度不得超过5%。</li>
<li>在无菌操作台中使用Corning无菌真空过滤装置（例如：2 × 500 mL，孔径0.22 μm）过滤培养基。将培养基保存于4°C，并用铝箔包裹避光。建议在3个月内使用完毕。</li>
</ol>
</li>
<li>含添加剂的Hank's平衡盐溶液（HBSS）缓冲液（用于切片）
<ol>
<li>取一个1升玻璃瓶，加入约600 mL无菌（高压灭菌的milliQ）H2O，并加入以下成分：100 mL 10倍浓缩的HBSS储备液，10 mL 10,000 U/mL青霉素-链霉素溶液，5 mL 7.5% NaHCO3溶液，以及10 mL 1 M HEPES。 
最终切片用溶液的组成为： 
1× HBSS，10 mM HEPES，4.5 mM NaHCO3，100 U/mL青霉素，以及100 U/mL链霉素。</li>
<li>检测pH值，必要时调节至7.2，并用无菌H2O定容至1升。</li>
<li>检测渗透压，渗透压必须在285–315 mOsm/kg之间。</li>
<li>将HBSS冷却至4°C。在切片过程中，HBSS缓冲液必须保持极低温（4°C），以降低组织代谢速率，维持组织活性。</li>
</ol>
</li>
</ol>
2. 切片与培养前的准备工作
<ol>
<li>将组织置于温暖干燥的培养 chamber 中，无需 CO2 环境。为防止培养物干燥，需使用封口胶将盖玻片密封于培养皿上。为此，使用硅基真空脂填充 5 mL 注射器。在注射器尖端覆盖小块铝箔，并进行高压灭菌。同时，对滤纸（用于切片过程）也进行高压灭菌。</li>
<li>在开始切片前，将已灭菌的真空脂涂抹于 35 mm 培养皿的顶部环形表面。每个脑片培养需准备单独的培养皿。</li>
<li>在开始切片操作前，所有非无菌器械，如剃须刀片、振动切片机刀片、盖玻片以及用于切片和培养过程的其他材料均需灭菌。用 70% 乙醇喷洒所有非无菌设备，并将器械和涂有真空脂的培养皿置于无菌操作台内接受紫外线照射至少 30 分钟，然后方可进行培养。</li>
<li>同时，取一 Falcon 管加入气相平衡培养基（每份培养计 1.2 mL；例如 8 份培养则准备 10 mL 培养基），并加入 freshly thawed 荧光素（0.1 M 储存液；Promega, Madison, WI）（每 10 mL 培养基加入 10 μL 荧光素；终浓度为 0.1 mM）。</li>
<li>荧光素对光敏感，其储存液及含荧光素的培养基均需避光保存。将含有荧光素的 Falcon 管置于黑暗环境中，并在 36–37°C 的加热 chamber 中预热。如条件允许，也可在切片时直接将荧光素加入培养皿中。若未添加荧光素，则荧光素酶与荧光素之间无法发生发光反应，因而组织不会产生信号。</li>
<li>紫外线照射结束后，将无菌刀片安装至振动切片机上。</li>
</ol>
3. 视交叉上核切片操作步骤
以下步骤描述了对成年（通常为2至4月龄）C57/BL6小鼠进行脑切片的操作。请注意：切割操作以及在夜间对动物进行光照可能会不同程度地重置视交叉上核（SCN）的相位。为避免此影响，切割和培养操作应在光照时段进行，最好在ZT 6-12之间，此时操作不会引起明显的相位偏移12。若必须在黑暗条件下取样SCN，则步骤3.1和3.2需在红光下或佩戴夜视镜进行，以避免光照诱导的相位偏移。
<ol>
<li>首选使用异氟烷（Baxter）在玻璃容器中对小鼠进行麻醉。当动物失去痛觉反射（通过用指甲轻捏足部检查），但尚未停止呼吸（以尽可能长时间维持氧气供应）时，迅速用剪刀或类似工具将头部剪下。 
请注意：在一些国家，仍允许使用 CO2 暴露（高碳酸血症）作为麻醉方法，但已有报道指出其可能引发动物焦虑。此外，剪除头部前可能需要先进行颈椎脱位。实施动物安乐死时，请遵循当地法律法规。</li>
<li>用剪刀将眼睛从头部移除，以防止视神经受到牵拉和进一步兴奋，从而避免视交叉上核（SCN）受损。</li>
<li>若仍有残留，用剪刀移除最后一节颈椎，剥去皮肤（图1a），然后使用精细剪刀（例如虹膜剪）在颅骨两侧各做一条切口，形成一个可移除的“盖片”。</li>
<li>使用微型咬骨钳工具打开颅骨（也可使用精细解剖剪处理小鼠），去除所有骨组织直至可见嗅球。操作时应自下而上进行，切勿用工具压迫脑组织，以防损伤腹侧视交叉上核（SCN）（图1b）。</li>
<li>使用精细的微型解剖弹簧剪，在嗅球与大脑半球之间小心剪断视神经。确保神经被完全切断，因为视神经的牵拉可能导致 SCN 损伤及脑片破裂。</li>
<li>将头部倒置，使完整的大脑自然脱落（若大脑仍通过其他颅神经与头骨相连，可能需要在视神经后方切断这些神经），落入盛有 50–100 mL 冷 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）的容器中（例如直径约 10 cm 的玻璃培养皿），以实现大脑的快速冷却。理想情况下，两条视神经应保持完整（图1c）。将大脑在 HBSS 中保留 30–60 秒，以确保充分冷却。</li>
<li>使用勺子或类似工具，将冷却后的大脑背侧朝上放置于无菌切割表面（例如倒置的玻璃培养皿盖）。为制备冠状切面，使用无菌剃刀刀片或手术刀在大脑半球与小脑之间做一垂直切口，从而移除小脑。</li>
<li>在振动切片机（vibratome）配套的干燥平台上涂抹少量速干胶。</li>
<li>用尖头弯镊插入大脑前端，夹取大脑（不含小脑和嗅球的大脑半球），并在无菌滤纸上轻轻吸干 HBSS 液体，同时继续用镊子夹持大脑。（也可使用一小块无菌滤纸代替镊子插入，以固定并转移大脑。）</li>
<li>将大脑半球固定在涂有胶水的平台上，前端朝上，腹侧靠近切割刀片。将平台安装至振动切片机（例如 Campden Instruments，英国）的夹持装置中，并立即注入冷 HBSS。若垂直切口操作得当，大脑半球应垂直立起，从而为包含双侧 SCN 的冠状切片提供合适角度。</li>
<li>为达到目标 SCN 区域，先以振动切片机的高或最高速度切去较厚的脑片（500–800 μm）。在接近下丘脑前，刀片移动可较快；但当视交叉开始可见时，应减慢速度。（高频振动刀片并缓慢水平移动可减少切片过程中的细胞损伤，从而提高脑片活性。）当视交叉变大（变宽）且前连合变小时，将切片厚度减至 100 μm。为获得包含中段 SCN 的切片，继续向后（尾侧方向）切片，直至两个 SCN 核团开始显现。可能需要使用放大镜以观察核团。请注意：小鼠脑中的 SCN 位置相比大鼠更靠尾侧。</li>
<li>当达到理想的 SCN 水平位置时（此时 SCN 呈现为更清晰、圆形或杏仁形的结构；图1d；小鼠 SCN 中心区域大约位于前囟后 -0.46 至 -0.70 mm13，大鼠为前囟后 -0.92 至 -1.40 mm14），切下 SCN 切片（图1e）。小鼠切片适宜厚度为 250 ± 50 μm；大鼠为 350 ± 50 μm。</li>
<li>使用软毛刷将 SCN 切片轻轻提起，并转移至盛有冷 HBSS 的中等大小培养皿盖中，置于解剖显微镜或体视镜下。在放大条件下检查双侧 SCN 是否清晰可见。若选择中段 SCN 区域（虽未必是唯一“最佳”切片水平，但被认为是最易于标准化切片流程并减少变异的方法），应至少在一侧切片上清晰可见。若切口过于靠前，需再切一片并在放大镜下检查 SCN。</li>
</ol>
4. 视交叉上核器官型培养
<ol>
<li>在含有 HBSS 的培养皿盖中，使用一对无菌解剖刀在解剖显微镜下将双侧视交叉上核（SCN）以约 1.5 mm 每边的方形组织块完整分离出来。分离的组织块会附带一小段视交叉，但不应包含其他核团。切割时应尽可能靠近目标区域，但不得切除 SCN 组织本身。</li>
<li>若实验设计需要，可将双侧 SCN 组织块沿中线切开，获得两个单侧 SCN。其中一个单侧 SCN 可作为对照组使用（图 2a）。</li>
<li>向一个直径约 35 mm 的培养皿中加入 1200 μL 荧光素培养基，并将一张培养膜（Milli-CM 0.4 μm，Millipore，Bedford，MA）轻轻放置于液面之上（图 2b）。培养基的体积至关重要，必须确保培养膜能稳固地贴附在培养皿底部，不得漂浮或晃动11。注意检查膜下是否有气泡残留。操作过程中应避免荧光素暴露于不必要的光照条件下。</li>
<li>由于组织块较小，难以直接操作，建议使用 1000 μL 移液器及配套吸头将 SCN 组织吸入吸头内，再轻柔吹打至培养膜表面。若组织块过大而难以进入 1000 μL 吸头（例如大鼠 SCN 或小鼠双侧 SCN），可用无菌工具剪切吸头末端以扩大开口。随后用移液器吸除膜上多余的 HBSS。进行荧光素酶记录时，每个培养皿仅放置一个 SCN 组织块（图 2b），因为记录管会检测皿中所有发射的光子，无法区分来自不同组织的信号。</li>
<li>使用盖玻片（直径约 40 mm，Menzel-Gläser，德国）和真空脂（Dow Corning Corp，USA）11 将培养皿密封。确保密封严密（图 2c），如有泄漏，需补充真空脂加强密封。</li>
<li>将密封后的培养皿转移至 36–37°C 的避光培养室中，并立即开始光电倍增管（PMT）记录。</li>
</ol>
5. 通过记录生物发光测量荧光素酶活性
利用安装在密闭暗室内的光电倍增管（PMT）检测装置，可检测并放大来自微小SCN组织的荧光素酶诱导的生物发光信号。PMT通常置于培养皿上方约1-2 cm处8。PMT记录系统可自行搭建，也可使用 commercially available 装置11。
<ol>
<li>将培养皿置于光电倍增管（PMT）下（PMT 产生的热量可去除盖玻片上的冷凝水），然后关闭培养 chamber。确保 chamber 完全避光，因为用于 SCN 组织的 PMT 暗电流极低（小于 20 光子/分钟），PMT 能够检测到极其微弱的漏光。</li>
<li>启动数据采集，使用专用软件进行（例如 LumiCycle；Actimetrics Inc.，Wilmette，IL，USA）。光子计数以 1–10 分钟为间隔进行积分，以获得基因/蛋白质表达的高分辨率数据。</li>
<li>记录完成后，可使用适当的软件（Origin，OriginLab，Northampton，MA，USA；ClockLab，Actimetrics；LumiCycle，Actimetrics Inc.；Chrono，Till Roenneberg，慕尼黑大学，德国慕尼黑）分析所获得的基因/蛋白质昼夜节律表达，以确定节律的相位、周期（一个循环所需的时间）和振幅。通常将基因或蛋白质的峰值表达作为参考点，定义为一个周期内最高的光子计数。在进行相位、周期和振幅分析前，可对数据进行平滑处理，尤其是在信噪比较低的情况下。有时基线会发生变化，需在分析前进行基线扣除。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
本文以振荡的 PER2::LUC 表达作为评估培养组织活力与状态的读数指标。在最佳条件下，若组织存活，PER2::LUC 表达将呈现如图3所示的昼夜节律性振荡。SCN 中的 PER2 通常在昼夜时间 12-13（ZT 12 表示 12:12 小时光暗循环中的熄灯时刻）达到表达高峰。活体组织越大，光子计数越高。然而，为了维持组织的存活能力，器官型培养组织的尺寸和厚度应保持较小，最好不超过 15 mm2 11，厚度不超过 500 μm 7。若按照本文所述方法分离 SCN 组织，且取自纯合型 PER2::LUC 动物，则其光子计数通常在每分钟 10,000–40,000 之间。在器官型 SCN 培养中，第一个振荡周期的振幅通常明显高于后续周期。目前尚不完全清楚为何首个周期具有如此高的振幅。一种可能的解释是，在初次切割和培养后，组织中有相当一部分细胞可能迅速死亡，因此在第一个周期之后不再利用荧光素底物。此外，切割操作本身可能引起过度兴奋，从而在第一个周期内放大荧光素酶信号。
图3显示了SCN切片的生物发光信号轨迹，其中一条轨迹（红色）来自最初不健康的切片。死亡或不健康的组织具有较低的光子计数基线。（此外，死亡组织常在培养皿中发生解离，无法完整地从膜上取出。）
本报告所述技术可有益地应用于药理学实验。图4显示了我们在第1天至第2天期间使用HCN通道阻断剂（ZD7288，10 μM）处理的培养样本的记录结果。如图所示及先前文献报道15，该阻断剂显著降低了PER2昼夜振荡的振幅；然而，在用正常培养基洗脱后，振荡恢复，表明该阻断剂影响了分子钟，但组织仍保持活性且健康。

 <img src="/files/ftp_upload/2439/2439fig1.jpg" alt="SCN切片操作；小鼠脑组织解剖；解剖学分析；视交叉上核研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 切片操作流程 
A) 已处死并去头的小鼠头部，眼球和皮肤已被移除。B) 使用微型咬骨钳去除颅骨。操作时应自下而上进行，切勿用工具向下压迫脑组织。C) 脑组织倒置显示（腹面朝上），嗅球已被移除。可见白色的视交叉及两条完整的视神经。视交叉上核（SCN，红色标记为边界）位于视交叉附近。D) 在振动切片机中，将脑组织冠状切面固定于载物台上，位置对应于SCN层面。E) 包含视交叉（OC）、第三脑室（3V）以及双侧视交叉上核（SCN）的冠状脑切片（厚度为250 μm）。
 <img src="/files/ftp_upload/2439/2439fig2.jpg" alt="器官型组织培养装置；外植体视图及用于体外培养和分析的培养皿。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 器官型组织培养。 
A) 从所示脑片中分离出的两个单侧视交叉上核（SCN）核团（插图）。B) 培养皿（35 mm 培养皿）内含培养膜、培养基和外植体，但未使用真空脂和盖玻片。培养基（1.2 mL）可见为培养皿与膜之间的液体。一个单侧 SCN 核团被放置在培养膜上。小块组织中最亮的部分为视交叉的一段（插图）。C) 培养皿及其培养膜和 SCN 组织，用真空脂密封，并加盖圆形盖玻片。
 <img src="/files/ftp_upload/2439/2439fig3.jpg" alt="生物发光曲线图；健康状态比较；黑色、红色、蓝色线条；天数 vs. 每分钟计数" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 来自健康与非健康 SCN 组织培养物的生物发光记录。 
从小鼠的视交叉上核（SCN）脑片中获得的 PERIOD2::LUCIFERASE（PER2::LUC）表达的生物发光记录示例，这些小鼠饲养在 12 小时光照：12 小时黑暗的循环条件下。PER2::LUC 蛋白以昼夜节律（约 24 小时）振荡表达，其蛋白表达峰值出现在授时因子时间 12-13。因此，该基因节律的相位取决于动物在处死前所在的光暗周期。通常情况下，按照本方案所述方法分离的单侧 SCN 组织培养物的生物发光信号每分钟光子计数约为 10,000–40,000。该图显示了来自一个健康（黑色）SCN 培养物、一个非健康（红色）SCN 培养物，以及一个在第 4 天打开密封培养皿后未正确重新密封导致干燥（蓝色）的 SCN 培养物的记录轨迹（箭头所示）。
 <img src="/files/ftp_upload/2439/2439fig4.jpg" alt="生物发光强度随时间变化的曲线图；数据显示在10天实验周期内的峰值信号结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 药物处理期间及之后的生物发光记录。 
HCN通道阻断剂（ZD7288，10 μM）作用前后，培养物中PER2::LUC的表达情况。第一个箭头表示加入阻断剂的时间点，第二个箭头表示洗脱操作，即用条件化对照培养基替换含药物的培养基。注意在药物处理2天后振幅降低，第4天时振荡消失，以及洗脱后蛋白质节律迅速恢复。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

荧光素酶报告基因技术的优点与缺点
与……相比 离体 方法，例如 RT-PCR， 原位 杂交和蛋白质印迹等需要在多个不同时间点采集组织样本（通常时间分辨率为2-4小时，取决于采样频率）以研究基因和蛋白质表达的昼夜变化的技术相比，荧光素酶报告基因技术可在同一标本中实现持续多天的高时间分辨率（1-10分钟）昼夜节律振荡研究。因此，该方法可显著减少实验动物的使用数量，并能够对节律的相位和周期变化进行细致分析，而这些通常是采用低时间分辨率的传统采样技术难以实现的。然而，尽管该技术可用于节律相对振幅的测定，但必须强调的是，报告基因技术并非定量方法，因此不能用于测定基因转录或蛋白质翻译的实际含量。
组织记录可在培养后立即开始并进行分析，这一优势非常有利于直接研究分子效应 体内 应激 体内 光诱导的相位偏移等。利用器官型视交叉上核（SCN）培养技术，可在含有完整成熟突触网络的成年脑组织中进行长期（数周）的药理学干预，而荧光素酶报告基因技术则可实现持续数周的稳定记录。因此，获得健康培养组织并不依赖于新生或早期出生后阶段的脑组织，且与急性脑片相比，可进行慢性药物处理。与细胞培养中质粒报告基因转染无法将DNA整合入基因组不同，在研究表观遗传学改变时，转基因荧光素酶动物模型（以及慢病毒转染）更具优势。在此还应指出，目前利用高灵敏度CCD相机已可实现生物发光成像。 11，使得即使在单个视交叉上核神经元（~ 6-10 μm）及其他细胞类型中也能进行记录，已被研究昼夜节律的主要实验室广泛采用。最后，多位昼夜节律研究者常通过其他报告基因（如绿色荧光蛋白）监测分子表达，以研究生物钟基因/蛋白的振荡。 16-19.
切片厚度的相关方面
建议的SCN切片厚度（200–300 μm）可根据需要适当减小或增加。然而，尽管组织在培养数天后会在膜上自然展平，但初始切割的切片厚度不建议超过500 μm，以维持组织的存活能力7。由于机械操作和实际操作上的原因，厚度小于100 μm的切片难以处理。由于SCN组织具有异质性，切片厚度可能影响荧光素酶输出信号的相位，因为SCN内不同区域（例如“核心”与“壳区”，以及背侧与腹侧区域）的振荡相位不同20，在相位偏移后的再同步过程也存在差异21。切片厚度还会影响光子计数的基线水平，因为更多的组织会发射更多的光子。因此，外植体的大小可能间接影响分子振荡的振幅。基于上述原因，对照组和处理组的培养物必须保持相同的尺寸、厚度，并包含相同的SCN区域，以确保其以相同的相位和振幅进行振荡。另一方面，只要振动切片机的切割方向是水平而非倾斜的（这取决于小脑与两个半球之间分离切口是否垂直于台面），两侧单侧核团便会彼此同相振荡，且振幅相似。进行SCN培养的研究人员可能会遇到不同SCN培养物之间振荡不同步的情况。通过练习并标准化切片技术，即始终在SCN相同的前后水平位置进行切片，可改善实验结果。
关键步骤
<ol>
<li>氧气供应至关重要。 
由于脑组织需要大量氧气22，切片操作必须迅速（从步骤3.1至3.10控制在约5-6分钟内为佳，以保持组织健康）。</li>
<li>视交叉上核（SCN）对温度变化和培养基更换敏感。 
SCN对温度敏感，较大的温度波动可能导致生物钟相位偏移并引起实验假象23。若在实验过程中更换或添加培养基，例如在体外培养数天后施加药物时，所添加的培养基或溶液必须预先加热至36-37°C（与培养腔室内温度一致）。在涉及培养基更换的药理学实验中，始终应使用预平衡的细胞培养基。使用新鲜未平衡的培养基进行添加或洗脱，可能引起SCN分子节律24以及其他细胞类型培养物的相位偏移25。</li>
<li>培养基成分。 
组织培养过程中维持正确的pH值和渗透压至关重要。空气缓冲型培养基含有较大量的HEPES，其在pH 6.8-8.2范围内具有最佳缓冲能力，适用于缓冲细胞呼吸可能引起的pH变化。然而，与培养基中少量添加的碳酸氢钠相比，HEPES对温度变化更为敏感。碳酸氢钠在较低pH范围（5.1-7.1）内具有更强的缓冲能力26，因此适用于CO2培养环境。但在空气缓冲型培养基（DMEM 2902）中增加碳酸氢钠含量会显著提高渗透压，不可直接添加而不同时稀释培养基，否则将导致氨基酸、维生素和离子成分比例失衡。 
培养基配制建议：
<ol>
<li>配制培养基时务必精确、谨慎。</li>
<li>仅使用新鲜或 freshly thawed 的储备液。</li>
<li>若渗透压过高，则不宜通过稀释调整；稀释程度超过5-6%的培养基很可能无效。若渗透压过低，可使用D-葡萄糖进行调节。</li>
</ol>
</li>
<li>制备时间引起的相位偏移 
切片制备的时间点至关重要。若切片操作在ZT 6-12期间进行，则对节律相位的影响最小或可忽略不计12。为减少因制备间相位差异带来的误差，所有脑片解剖操作应在昼夜节律或昼夜节律周期的同一相位进行。</li>
</ol>
可能的修改
<ol>
<li>进行急性视交叉上核（SCN）电生理实验时，切片必须使用经氧气饱和（95% O2，5% CO2）的人工脑脊液（ACSF）缓冲液进行。在整个切片过程中，需持续向缓冲液中通入氧气，因为神经元的电活动和突触活动直接依赖于氧气供应22。</li>
<li>视交叉上核（SCN）的水平切片和矢状切片也可成功制备并用于培养。作者具有在水平切片中进行荧光素酶记录的经验，根据我们的观察，与冠状切片相比，其昼夜节律振荡的振幅较低。</li>
<li>视交叉上核（SCN）在前后方向上长约1 mm，本文所述的切片技术旨在获取位于中枢区域的SCN切片。然而，从小鼠和大鼠脑中可获得多个SCN切片，从而允许研究SCN核不同前后水平上的昼夜节律基因/蛋白表达差异。</li>
<li>也可制备来自更年轻动物、出生后幼鼠甚至胚胎的脑切片培养。请注意，非常年幼的幼鼠其脑组织和颅骨极为柔软且敏感。此外，视神经纤细且尚未完全发育。在解剖幼鼠脑组织时应格外小心，避免损伤SCN区域。例如，不可使用显微咬骨钳打开幼鼠颅骨，因其尺寸过大；使用精细剪刀剪开幼鼠柔软的组织即可。</li>
<li>本文所述基于盖玻片的培养技术也可用于通过CCD/EM-CCD相机成像检测生物发光信号，包括单个SCN神经元中的发光信号。</li>
<li>来自转基因PER2::LUC动物的其他中枢神经系统区域及外周器官组织亦可轻松获取、培养并分析其分子振荡特性，因为PER2::LUC的表达在多种其他组织和细胞类型中亦可持续振荡数天10。大多数此类外周组织（例如肝脏）无需使用膜支撑即可存活，而是直接浸没在培养基中进行培养11。请注意，由于切割、培养和换液所引起的相位偏移可能与SCN组织的规律不同。</li>
</ol>
意义
在转基因小鼠和大鼠品系（mPER2::LUC；mPer1-luc 8, 10, 27）中，荧光素酶活性可反映蛋白质或基因表达的节律，可通过生物发光记录进行检测。荧光素酶产生的生物发光信号较弱，但背景发光接近于零，使该方法具有优势。此外，由于荧光素酶分子不稳定且迅速降解，因此不会产生长期激发照明过程中可能出现的光毒性 28。综上所述，这些特性使得实验可长期进行，从而使荧光素酶报告基因技术在昼夜节律研究中具有显著优势。

<table><tbody><tr><td>B27 添加剂 50倍</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>培养膜</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>低糖 DMEM，不含酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>1L 用粉末</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>过滤装置</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>孔径 0.22 &amp;#x03BC;m，聚醚砜</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumont #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10倍</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>甲虫荧光素，钾盐</td></tr><tr><td>微型咬骨钳</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液 10,000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>光电倍增管（PMT）</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>11号</td></tr><tr><td>真空滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

下丘脑视交叉上核钟基因活性的脑片制备、器官型组织培养及荧光素酶记录

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

位于下丘脑前部的视交叉上核（SCN）中存在一个核心的昼夜节律（约24小时）生物钟，该生物钟协调生理与行为的日常节律。此生物钟通过视网膜和视神经直接接收光信号而实现同步。昼夜节律振荡由若干所谓“时钟基因”及其蛋白质产物之间的负反馈环路相互作用产生，包括 周期 (每) 基因。核心生物钟还依赖于膜去极化、钙离子和cAMP 1下丘脑视交叉上核（SCN）在时钟基因表达、代谢活性及自发性电活动方面均表现出昼夜节律性振荡。值得注意的是，这种内源性节律活动在成年动物的SCN脑片中仍可持续存在。 2-4通过这种方式，可轻松研究生物钟 体外，从而可对起搏功能进行分子、电生理和代谢方面的研究。
SCN 是位于视交叉正上方的一个微小且结构明确的双侧性结构 5在大鼠中，每个核团约含有 8,000 个神经元，其尺寸约为 947 μm（长度，前后轴）× 424 μm（宽度）× 390 μm（高度） 6要分离出视交叉上核（SCN），必须在能够识别SCN的特定脑区水平切取脑片。本文描述了SCN的解剖与切片操作步骤，该方法在小鼠和大鼠脑组织中基本相同。此外，我们还展示了如何将分离的组织在膜上进行器官型培养。 7，一种由Yamazaki开发的用于SCN组织培养的技术 等 8最后，我们展示了如何利用转基因组织，通过动态荧光素酶报告技术检测生物钟基因/蛋白质的表达水平，该方法最初由Geusz用于昼夜节律的测量 等 9我们在此使用由Yoo制备的转基因敲入型PERIOD2::LUCIFERASE小鼠的SCN组织 等 10小鼠体内含有一种PERIOD（PER）2与萤火虫荧光素酶（LUCIFERASE）的融合蛋白。当PER2表达时，在荧光素酶底物即荧光素（luciferin）存在的情况下，荧光素酶可催化荧光素的氧化反应，从而通过生物发光检测PER2的表达水平。所发射的光子数量与生成的PER2蛋白量呈正相关，且生物发光节律与PER2蛋白节律一致。 体内 10通过这种方法，可以连续多天实时监测PER2表达的周期性变化。我们所采用的组织培养和实时生物发光记录方案已由Yamazaki和Takahashi详尽描述。 11.

本文报道了制备包含成年小鼠下丘脑视交叉上核（SCN）的脑切片的方法，以及在器官型培养条件下快速培养SCN组织的技术。此外，还描述了利用动态荧光素酶报告技术检测振荡性生物钟基因蛋白表达的方法。

位于下丘脑的视交叉上核（SCN）中存在一个中枢昼夜节律（约24小时）时钟，负责协调生理和行为的每日节律。

本实验的总体目标是演示如何从转基因小鼠中切取并分离视交叉上核，并对示意图所示的组织进行培养，以记录由生物发光诱导的钟基因或蛋白表达所产生的荧光素酶信号。该过程首先从携带钟基因或蛋白荧光素酶报告基因的转基因小鼠中取出脑组织，然后制备包含视交叉上核的脑切片。实验的第二步是从脑切片中分离出两侧微小的视交叉上核组织。该实验步骤的第三步是在含有培养基、培养液和荧光素的培养皿中，将示意图所示的细胞核外植体在膜上进行培养。实验的最后一步是在避光加热的腔室内，利用光电倍增管通过检测生物发光来记录荧光素酶活性。最终可获得显示钟控基因或蛋白质昼夜节律振荡的结果。我的名字是 Sergey IV，我在 Gabrielle Re Club 工作。我的名字是 An SoFi Johansson，我在 Gabriella 的团队工作。我的名字是 Gabriel Quist。我是神经科学系的一名首席研究员，我叫Ka LaShon，我也是瑞典医学神经科学中心的一名博士研究生，并与Gabriella合作。该技术相较于现有的方法（如Western Blot、RT-PCR以及双杂交技术）的主要优势在于，可以在同一组织中连续数天以约一分钟的高时间分辨率持续监测钟控基因或蛋白的表达，从而实现对昼夜节律周期、振幅和相位的详细分析。由于SEN切片和解剖步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。感觉神经非常细小，识别起来可能较为困难。本次操作演示将由我的研究团队中的博士后研究员 Dr.Sge Velia 进行。配制好所需溶液后，使用一支预先装有五毫升高压灭菌真空润滑脂的注射器，准备实验中将要使用的培养皿。在35毫米培养皿的顶环表面涂抹润滑脂。每个切片需准备一个独立的培养皿。在Falcon管中加入10毫升空气和缓冲培养基。此培养基可制备八份培养物。加入10 µL freshly thawed luciferian。luciferian对光敏感，因此需将Falcon管置于避光的37 °C加热培养箱中，以保护含luciferian的培养基免受光照。接下来，对所有器械、盖玻片及其他将在实验中使用的材料进行灭菌。用70%乙醇喷洒所有非无菌设备。将器械和涂有润滑脂的培养皿置于无菌操作台内，经紫外线照射至少30分钟。另一个准备步骤是安装振荡器并固定无菌剃须刀片。现在设备已为手术操作准备就绪。将小鼠麻醉并断头后，用剪刀从头部取出眼球。这可以防止刺激或兴奋视神经，从而有助于避免对视交叉上核（SCN）造成损伤。使用精细的剪刀去除最后一节颈椎骨并去除皮肤。在颅骨两侧沿颅骨各做两个切口，从而形成一个可移除的骨盖。使用微型 Ron Jre 工具打开颅骨。操作 RJ 时应采用向上动作，切勿将工具向下压在脑组织上。为防止损伤视交叉上核（SCN），需去除所有骨质，直至可见嗅球为止。使用精细的显微解剖弹簧剪，小心地在半球与嗅球之间的视神经处剪断。请将一个培养皿盛装50至100毫升冰冷的HBSS，置于小鼠头部下方。将头部翻转至倒置位置，使完整的大脑开始自然脱落。根据需要，在对侧切断视神经以外的其他脑神经。脑组织离断后会落入培养皿中，从而迅速冷却大脑。使用勺子将冰冷的大脑转移至无菌的切割表面，例如倒置的玻璃培养皿盖。使用无菌剃须刀片在半球与小脑之间做垂直切割，去除小脑。将少量超级胶水涂抹在切片机的干燥平台上。将一把尖头弯镊插入脑组织的头端部分，用镊子夹住脑组织并将其提起。用无菌滤纸小心吸干 HBSS。将半球形组织固定在平台的胶上，确保头端朝上，腹侧面向切割刀片最近。将平台安装到振动切片机的持片架上，并立即注入冷的 HBSS。如果垂直切割操作得当，脑半球应能直立。目标是使用振动切片机的最大速度，切出包含双侧视交叉上核（SCN）中段区域的冠状切片。从脑半球开始，切去500至800微米厚的组织层，直至到达联合部。观察。随着视交叉逐渐变宽，并将切片厚度减少至100微米，继续沿尾侧方向进行切片，同时减慢刀片的水平手动移动速度，直至两个视交叉上核（SCN）核团开始显现。当达到SCN水平时，如有必要可使用放大镜观察核团。切取厚度为250微米的SCN切片。使用软毛刷将冰冷的HBSS填充至中等大小的培养皿盖中。提起并转移视交叉上核脑组织切片至培养皿中。将培养皿置于解剖显微镜下。下一步是将视交叉上核（SCN）从脑片中分离出来。使用显微镜确认至少在一侧切片中双侧SCN清晰可见。使用一对无菌手术刀切下一块约每边1.5毫米的方形组织，其中包含双侧SCN。尽可能靠近视交叉上核（SCN）进行切割。在不移除SCN组织的前提下，离体组织上必须保留一小段视神经，但不应包含其他任何核团。将含有双侧SCN的组织沿中线切开，得到两个单侧SCN。可在无菌操作台中使用单侧 SCN 作为对照。关闭光源后，向直径为 35 毫米的培养皿中加入 1200 微升的荧光素培养基，然后将培养膜置于液面之上。确保膜下无气泡存在。植入物非常微小，难以拾取。因此，使用1000微升移液器并配以吸头，将SEN外植体吸入吸头内，然后将其挤出至培养膜上。弃去多余的HBSS，用于荧光素酶检测时，每个培养皿中仅放置一个SEN。用直径为40毫米的盖玻片密封油脂培养皿。若密封不严，需添加更多油脂。将培养皿转移至置于36至37摄氏度避光加热室中的铝循环装置内。开始培养时，注意观察位于发光周期培养箱内部的培养皿和光电倍增管检测组件。将培养皿放置在光电倍增管下方，距离约一至两厘米。光电倍增管用于检测并放大由生物发光诱导产生的荧光素酶信号。Luma Cycle 软件工具用于数据采集。通过整合一到十分钟时间间隔内的光子计数，以获得高分辨率的基因蛋白表达信息。通过分析基因蛋白的昼夜节律性表达，确定节律的相位、周期和振幅。该图显示了健康与非健康 SCN 组织培养物的生物发光记录。这些小鼠在取出 SCN 组织前，维持在 12 小时光照、12 小时黑暗的环境中。黑色线条表示周期蛋白 2 萤光素酶表达的生物发光记录的昼夜节律。在健康的 SCN 脑片中，该蛋白的表达随昼夜节律发生振荡，蛋白表达量的峰值出现在光照-黑暗周期的第12至13小时，即黑暗开始时（ze gabar时间）。因此，该基因节律的相位取决于动物在处死前饲养时所处的明暗循环周期。蓝色线条显示的是来自一个 SCN 培养物的生物发光记录，该培养物在第4天（箭头所示）打开培养皿后因未正确重新密封而导致培养液干涸。红线显示来自非健康SCN培养物的生物发光记录。该图展示了一个SCN培养物在药理学实验中的结果。图中轨迹来自一个在第一个箭头所示时间点施加了HCN离子通道阻断剂的培养物。在两到三天内，离子通道阻断剂使昼夜节律振荡在第二个箭头处减弱并最终停止。随后洗去药物，并更换为条件培养的对照培养基。在尝试此操作时，务必牢记要迅速而谨慎地操作，以保持SEN组织的活性。标准化Vibram切片过程也很重要，以确保每次获得相同水平的SEN。观看本视频后，您应充分了解如何切片和分离SEN培养物、通常位于膜上的SCN器官，并通过培养物中发光诱导的荧光素酶来监测时钟基因或蛋白质的表达。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

切片的制备，组织器官型培养，并记录在视交叉上核时钟基因活性的荧光素酶

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来源： Sabado, V., 等人， Nagoshi, E. 单细胞分辨率荧光活体成像 黑腹果蝇 幼虫脑培养中的昼夜节律钟 J. Vis. Exp. (2018).

包埋 果蝇 用于昼夜节律钟神经元延时成像的脑组织三维基质培养法

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平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。...

体内 利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

本实验方案的目的是建立 离体果蝇...

单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。...

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

本报告介绍了一种利用开源软件 RStudio 中的 R...

大规模数据集的用户友好型高效 R 分析

学习制备小鼠视交叉上核脑片并进行器官型培养，利用荧光素酶报告基因技术连续记录生物钟基因表达的昼夜节律振荡。该方法为神经科学和昼夜节律研究提供了高时间分辨率的体外分析手段。

下丘脑视交叉上核钟基因活性的脑片制备、器官型组织培养及荧光素酶记录

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