在接触耳蜗内毛细胞的传入神经树突上进行突触后记录：监测带状突触的多囊泡释放

本实验的总体目标是记录内毛细胞传入突触的突触后活动。首先，暴露刚从断头大鼠中取出的耳蜗的听觉上皮组织；其次，将切除的耳蜗顶回置于经改造的盖玻片上，并转移至记录室中。

该操作流程的第三步是定位传入神经棒并用记录电极对其进行接触。流程的最后一步是与传入神经纤维膜形成紧密封接，随后破裂该膜，建立膜片钳技术的全细胞构型。最终，可通过全细胞膜片钳电生理记录获得结果，显示来自单个带状突触的突触后事件或电位。

该方法的可视化演示至关重要，因为耳蜗组织的解剖和制备过程难以掌握，且细小的传入纤维难以辨认和接触。在开始解剖前，需预先制备一个改良的盖玻片，用于在记录过程中固定样本。取直径8至12毫米的圆形玻璃盖玻片，在其边缘处滴加一滴半固化的Sylgard胶。

将细小昆虫针的粗端放在盖玻片上，用手将昆虫针紧贴玻璃。用镊子夹住密封圈，将其在加热的线圈上加热以定型。

按照随附文本所述，制备10至20根微电极。使用微电极拉制仪进行火焰抛光后，微电极的尖端外径应约为1微米。在对一只三周龄大鼠实施麻醉和断头后，微电极管壁的最终厚度约为三分之一微米。

开始解剖时，先切开头皮并移除脑组织，以暴露颞骨。将两侧颞骨均取出，并分别置于盛有标准细胞外液的洁净解剖皿中。下一步是去除包裹颞骨的骨质，以暴露耳蜗。

用镊子牢固地夹住颞骨底部。辨认圆窗、卵圆窗和耳蜗。调整耳蜗的方向，使卵圆窗和耳蜗的螺旋侧朝上。

去除耳蜗周围的多余骨质。使用第二把精细镊子从耳蜗表面直接凿除骨质，先从较其他部位更透明的区域开始，此处骨质较薄，更容易去除。

继续从顶回周围去除骨质。使用显微解剖剪剪开顶回下方的基底膜，然后将顶回与耳蜗的下部回旋分离。

注意保护顶回线圈，切勿牵拉或拉伸。最后，在不严重撕裂组织的情况下，将顶回从耳蜗中取出。

使用精细镊子去除其余的骨骼。下一步是去除眼部的 STR 和基底膜。小心地去除眼部的 STR，即位于毛细胞区域外侧的有光泽的条状组织。

务必避免移除感觉毛细胞，因为它们很容易随眼器的前庭嵴（STR）一同脱落。接下来，使用精细镊子分离端膜。位于感觉毛细胞上方的闪亮半透明膜即为端膜，现在用镊子修剪多余的组织和骨骼，并将制备物压平。

这是为了使组织能够均匀地置于固定针下。解剖至此完成。将制备好的样本置于已准备好的盖玻片上，并用固定针固定，注意在解剖完成后，将固定针远离毛细胞放置。

使用镊子将制备物转移至记录室，同时在承载耳蜗组织的盖玻片上保留一滴细胞外液，并立即开始用细胞外溶液灌流。为确保制备物更好的存活状态，使用显微镜的 10 倍物镜或 40 倍水浸 DIC 物镜进行观察。为定位制备物，应调整其方向，使记录电极能够以垂直于内毛细胞侧壁的角度接近细胞。

如果由于制备物卷曲导致内毛细胞基底区域的可见度受限，可使用记录电极将制备物的外缘向下推压至玻璃盖玻片上，注意避免压迫内毛细胞本身。在此制备物中，上方的电极用于将制备物外缘压紧，下方的电极则标记传入棒状突触（afferent batons）的位置。

作为参考，NC 70 Nuv Con 相机将耳蜗放大图像显示在监视器上，以评估内毛细胞区域的组织是否健康。以静纤毛束作为参考点，向下调焦以寻找细胞核。继续向内毛细胞底部及其传入神经末梢方向调焦，然后回调，直至在监视器上达到细胞核所在层面。

现在在内毛细胞基部周围寻找传入神经棒状突起。这些棒状突起呈球形或椭球形，直径约一微米，颜色较浅，具有光泽。通过上下调节焦距即可找到它们。

下一步是使用尖端为一微米、内含细胞内溶液的记录电极，清除通往传入神经纤维的路径。施加正压，并利用显微操作器将电极移动至制备组织处。用该电极在内毛细胞基部水平对制备组织进行切口。

使用正压将电极推入支持细胞薄层与内毛细胞之间，开辟一条通往内毛细胞底部区域的通路。小心取出电极，并更换为尖端直径一微米、充满细胞内溶液的新电极。通过施加正压以保持电极尖端清洁，将记录电极经由通路穿过邻近支持细胞，朝向传入棒状突触（afferent baton）移动。

确保电极尖端正对传入神经末梢的棒状突起，这些棒状突起对移液管移动的阻力比支持细胞和内毛细胞膜更大。当移动移液管时，可通过触感察觉这一差异，上下移动并轻推移液管，以确认是否带动了棒状突起。此现象表明移液管尖端与棒状突起处于同一聚焦平面，且电极已紧贴传入神经末梢的棒状突起。同时释放正压并施加负压，以形成吉欧姆（giga ohm）封接。

施加轻柔的吸力脉冲，使电极内的膜破裂，以获得全细胞记录。如果所记录的细胞是传入杆状细胞，则在全细胞记录模式下可观察到较小的电容性瞬变。该图显示了从传入纤维记录到的典型瞬变信号。

开始记录突触活动。如果传入纤维未表现出自发活动，可通过施加钾离子浓度较高的细胞外溶液来去极化毛细胞。该图左侧显示传入纤维典型的电流-电压关系，右侧显示内毛细胞典型的电流-电压关系。

在–84毫伏的保持电位下记录电流-电压关系，电压步阶从–124毫伏至+36毫伏，以10毫伏为增量。部分曲线右侧显示了来自传入纤维的电流-电压关系。请注意，在大多数电压步阶期间，兴奋性突触后电流（EPCs）均存在。

EPCs在约正六毫伏处发生反转。该记录是在存在河豚毒素（tetra to toxin）的条件下进行的，以阻断电压门控钠电流；若无此阻断剂，记录中将额外出现快速激活的钠内向电流，从而可将该记录识别为传入神经纤维记录。注意在超极化电压下出现的缓慢激活的内向电流。

这种电流在内毛细胞或支持细胞中不存在，因此可以很好地表明记录来自传入神经纤维。这些记录显示了内毛细胞的电流-电压关系。箭头指向正电位处快速激活的外向钾电流。

随后出现的延迟整流钾电流是由于移液管直径较窄且接入电阻较高所致。此处显示的内毛细胞电流小于预期，以获得准确的内毛细胞电流记录。应使用接入电阻较低的移液管。

然而，此处展示的记录结果表明，内毛细胞和传入神经纤维的电流-电压关系可以被明确区分。该图显示了从传入神经纤维记录到的突触电流。请注意兴奋性突触电流（EPCs）在大小和形状上的可变性。

记录在室温下进行，并使用苯妥英阻断电压门控钠电流。该图显示了来自内毛细胞及其相接触的传入棒状突起的同步记录。通过电压阶跃使内毛细胞去极化，相应地在内毛细胞中记录到内向钙电流，钙离子内流导致神经递质释放，并在传入棒状突起中激活兴奋性突触后电流（EPCs）。

注意，在尝试该操作过程中，内毛细胞去极化50毫秒期间会出现突触抑制。在分离和制备耳蜗组织时，务必小心谨慎，并在尝试记录传入神经末梢信号时保持耐心和乐观态度。