Name: 线虫的积极丁酮学习，短期，长期联想记忆检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习利用C. elegans模型通过丁酮趋化性检测评估短期与长期联想记忆的方法。该方案结合食物条件化训练，为认知衰老和神经退行性疾病研究提供关键工具。

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我们感谢 W. Ryu 对我们初始成像装置的建议，Z. Gitai 提议使用 ImageJ13 来计数线虫，以及 J. Ashraf 在使用 Google SketchUp 方面提供的帮助。CTM 是生物医学科学 Pew 学者、McKnight 学者和 Keck 学者。

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-515 (1993).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).</li>
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<li>Mori, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+chemotaxis+and+thermotaxis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+induce+aversive+olfactory+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 438, 179-179 (2005).</li>
<li>Kauffman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+dietary+restriction+differentially+influence+the+decline+of+learning+and+memory+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age.</a> PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).</li>
<li>Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+integrates+the+signals+of+butanone+and+food+to+enhance+chemotaxis+to+butanone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone.</a> J Neurosci. 27, 741-741 (2007).</li>
<li>Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CREB+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CREB and memory.</a> Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+image+transformations+for+an+automatic+screening+of+cervical+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears.</a> J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-71 (1974).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensionality+and+dynamics+in+the+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans.</a> PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

C. elegans 的嗅觉关联学习与记忆检测方法可区分集中式学习、间隔式学习、短期记忆和长期记忆等不同过程。这些检测依赖于线虫感知环境中食物和化学气味的能力，以及在两者之间建立正向关联的能力1,26。因此，该检测对起始动物群体的饥饿状态极为敏感，必须格外注意确保线虫在训练前后均处于充分喂养状态。单次集中训练可产生短期关联记忆。与其它生物类似，增加训练次数并采用间隔训练范式，对于在 C. elegans 中获得长期关联记忆至关重要6,8。或许可对该检测方法进行改进，以生成不同条件刺激与非条件刺激之间关联的长期记忆。
我们的关联学习与记忆检测方法可用于比较野生型与衰老或遗传突变动物的学习和记忆能力。例如，尽管在衰老的野生型线虫中，关联学习能力和长期关联记忆能力均会下降，但胰岛素信号减弱的动物随着年龄增长，其学习能力维持时间更长；而在热量限制的动物中，学习和记忆能力随年龄增长的维持时间更长。6 这些检测方法同样适用于对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行RNA干扰（RNAi）处理或药物干预。例如，用针对daf-2基因的RNAi处理线虫可改善其短期和长期关联记忆；相反，在间隔训练期间使用药物（分别为放线菌素D和环己酰亚胺）阻断基因转录和蛋白质合成，则会破坏长期记忆的形成。6
长期记忆是所有动物生存过程中至关重要的一个过程，而对经典条件反射记忆所涉及的分子机制似乎从线虫到哺乳动物都具有高度保守性6。利用这些嗅觉检测方法能够区分并检验关联学习、短期记忆和长期记忆的能力，使 C. elegans 成为深入研究记忆机制的优良模型系统，并可能为导致人类学习与记忆丧失的神经退行性过程提供重要见解。

<table><tbody><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>用蒸馏水配制 1 M 浓度溶液</td></tr><tr><td>190 证明乙醇</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>DSP-CT-18</td><td>&amp;gt;95% 乙醇可能含有干扰趋化实验的杂质</td></tr><tr><td>2-丁酮 99+%</td><td>Acros Organics</td><td>14967-0010</td><td></td></tr><tr><td>Basler IEEE-1394/FireWire 面扫描 CMOS 相机</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-683</td><td></td></tr><tr><td>InfiniMite 视频镜头 &amp;#8211; Alpha Industrial</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-202</td><td></td></tr><tr><td>Dolan-Jenner MI-150 光纤照明器</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT55-718</td><td></td></tr><tr><td>8&amp;#8221; x 8&amp;#8221; 背光源</td><td>Schott AG</td><td>A08927</td><td></td></tr><tr><td>标准悬臂支架</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-120</td><td></td></tr><tr><td>3/4&amp;#8221; 悬臂支架接头适配器</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-124</td><td></td></tr><tr><td>标准固定式 1/4-20 安装板</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-122</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans 正向丁酮学习、短期和长期关联记忆检测

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

对经历和所学信息的记忆对于生物体做出有利于其生存的选择至关重要。C. elegans 通过特定神经元对食物和化学气味的感知来导航其环境1, 2，并能够将营养状态与化学气味3、温度4以及食物来源的致病性5相关联。
本文介绍了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的关联学习以及短期和长期关联记忆的检测方法。我们对一种已有的厌恶性嗅觉学习范式6进行了改良，使其产生正向反应；该检测方法包括将约400条线虫饥饿处理后，在AWC神经元感知的挥发性化学吸引物丁酮存在的情况下进行喂养，丁酮浓度选择为仅引起较低趋化指数的水平（类似于Toroyama et al.7 的方法）。随后通过标准的群体趋化性检测1，可在训练后立即或数分钟至数小时后检测线虫对气味物质的趋化吸引力。
经过条件化处理后，野生型动物对丁酮的趋化性增加约0.6个趋化指数单位，即其“学习指数”。这种联合学习依赖于训练过程中食物与丁酮的同时存在。将食物与丁酮配对进行一次条件化处理（“集中训练”）可产生持续约2小时的短期联合记忆。而多次条件化处理并中间间隔休息期（“分散训练”）则可形成长期联合记忆（&lt;40小时），该过程依赖于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）6，CREB是一种在多种物种中均必需的长时程记忆相关的转录因子8。
本方案还包括用于快速、准确测定趋化性指数的图像分析方法。通过MatLab中的线虫计数软件，采集并分析趋化性实验平板上动物的高对比度图像。该软件采用形态学顶帽变换校正背景不均匀问题9。随后使用Otsu方法确定阈值，以区分线虫与背景10。软件自动去除极小颗粒，通过手动选择去除较大的非线虫区域（如平板边缘或琼脂打孔区域）。接着，软件通过忽略超过指定最大尺寸的区域，并计算剩余区域的中位尺寸，来估算单条线虫的大小。最后，将被识别为线虫占据的总面积除以单条线虫的估算尺寸，从而估计线虫数量。
我们发现，学习能力以及短期和长期记忆可以被区分开来，且这些过程与高等生物共享相似的关键分子。6,8 我们的检测方法能够快速验证在 C. elegans 中影响学习以及短期或长期记忆的新候选基因或分子，这些发现具有跨物种的相关性。

本文描述了测试秀丽隐杆线虫（C. elegans）关联学习以及短期和长期关联记忆的方法。这些群体实验利用了线虫向挥发性气味物质趋化的能力，通过将食物与趋化吸引剂丁酮配对，使线虫形成正向关联。增加训练周期的次数可诱导形成长期记忆。

C. elegans 正向丁酮学习、短期和长期关联记忆检测

经历和所学信息的记忆对生物体做出有利于其生存的选择至关重要。C. elegans 在其环境中进行导航……

以下实验的总体目标是利用秀丽隐杆线虫作为模型，检测其对食物与趋化吸引物丁烷之间所形成的学习性正向关联的短期和长期记忆。该目标通过首先将同步化、营养充足且处于年轻成虫期的线虫饥饿处理一小时来实现。接下来，通过在食物存在下对线虫进行丁酮训练，以诱导短期和长期的关联记忆：短期关联记忆采用单次训练（massed conditioning），长期关联记忆则采用间隔重复训练（spaced conditioning）。训练结束后，检测线虫对丁酮的趋化性，并与未经训练的对照组趋化性进行比较。为研究记忆保持能力，通过学习指数的变化，获得结果以显示线虫对食物-丁酮关联的短期和长期关联记忆的持续时间。该方法有助于回答认知老化与疾病研究领域中的关键问题，例如在正常老化和神经退行性疾病状态下，哪些遗传通路对于神经元功能是必需的，以及如何改善学习与记忆能力。在认知功能受损的条件下，采用标准方法在100毫米高浓度培养基平板上制备线虫，每板加入1毫升OP50大肠杆菌。每板使用约5,000条或更少密度的年轻成虫。通过将M9缓冲液轻轻倒入培养皿中并轻轻旋转，使线虫脱离培养基表面，从而收集线虫。操作过程中应尽量减少震荡，以免将不需要的细菌从培养基上冲下。接着，倾斜培养皿，从培养皿的角落吸取含有线虫的缓冲液混合物。使用 P1000 移液器。将线虫转移至 15 毫升锥形管中。注意不要将线虫吸到管壁上，如果线虫仍留在培养皿上，则需小心操作。重复此步骤一到两次。让蠕虫通过重力沉降到管底。为获得最佳效果，不建议进行离心。静置后，用真空法去除上清液，并用至少三到四毫升 M9 缓冲液洗涤。操作需迅速，以防止细胞饥饿。重复此步骤两次，共洗涤三次。此时，可保留一组线虫作为后续趋化性实验中的 naive 组。向离心管中加入三到四毫升 M9 缓冲液，将线虫在室温下饥饿处理一小时。通过在已接种了 500 微升 OP50 大肠杆菌的 60 毫米 NGM 平板盖内侧划线加入两微升 10% 丁烷的 95% 乙醇溶液，来制备条件化平板。移除饥饿线虫管中的上清液，使用 P1000 移液器将 100 至 200 微升线虫转移至每个条件化平板中。条件化完成后，在室温下将条件化平板孵育一小时。用约一毫升 M9 缓冲液冲洗平板上的线虫，并转移至 15 毫升锥形管中。重复此前展示的轻柔洗涤方法，直至缓冲液变得澄清。洗涤完成后，可取出部分线虫用于趋化性实验，作为一次摩尔浓度关联学习的时间零点组，以建立代表其他时间点的平板。将100至200微升的线虫转移至已接种的60毫米NGM平板上。在室温下将这些处理后的平板孵育0.5、1或2小时。每个时间点结束后，轻轻将线虫从平板上冲洗至15毫升锥形管中，重复1至2次。使用M九缓冲液，按照相同的轻柔洗涤步骤，通过趋化性实验检测短期关联记忆，该实验将在后续演示。按照短期训练所示方法制备诱导培养板和线虫，但仅让线虫在室温下孵育30分钟。孵育结束后，按前述方法收集线虫。将它们转移到未接种的60毫米NGM平板上。在室温下将线虫置于未接种的平板上饥饿处理30分钟。线虫饥饿处理后，用M9缓冲液洗涤，并重新放入15毫升锥形管中。重复这些步骤，直至完成总共七个诱导阶段和六个饥饿阶段。当诱导完成后，将线虫从诱导平板冲洗回锥形管中。如前所述，可在诱导后立即使用一批线虫来检测七次间隔关联学习能力。将剩余的线虫群体转移至含有1毫升OP50的100毫米HGM平板上。再次将每板100至200微升的线虫接种，以确保有足够的细菌支持其种群生长。将条件化后的平板在20°C下培养16–24小时或40小时，代表长期关联记忆的时间点，用于检测线虫对食物丁酸的已知关联的长期关联记忆。用15毫升锥形管轻轻冲洗平板上的线虫，并在每个时间点后用M9缓冲液洗涤一至两次，随后将线虫用于趋化性实验检测。为准备趋化性分析平板，在未铺琼脂的100毫米NGM平板底部靠近边缘处标记三个位置，如图所示。在气味源点和对照点各加一微升一摩尔的叠氮化钠。加样时间距离实验开始不得超过15分钟，以尽量减少麻痹试剂的扩散。接下来，在已标记的检测板上相应的位点，分别加入一微升95%乙醇和一微升10%丁酮。加在先前点样的叠氮化钠上方。尽可能去除已沉淀线虫管中的M9缓冲液。使用带有预切尖端的 P20 移液器，分三次、每次 5 微升，共 15 微升，将线虫加样至检测平板的起始点。接着，将 Kim 擦拭纸的角落捻成细小尖端，用于吸去多余的 M9 缓冲液，注意避免刺破琼脂。去除多余的缓冲液可使线虫释放到检测平板上。如果使用成像方法计数线虫，释放后立即拍摄起始点的图像，即可获得该检测平板上的动物总数。将趋化性检测平板在室温下孵育一小时后，计数位于起始点、乙醇和丁酮斑点处的线虫数量，以及检测平板上总的线虫数量。通常情况下，被叠氮化钠麻痹的线虫会位于点样位置一厘米半径范围内，并呈现笔直僵硬的状态。当大量动物个体相互堆叠时，可手动计数，也可使用成像与分析软件进行定量。出于操作简便性和结果可靠性的考虑，我们更倾向于采用后一种方法。在对起始位置的乙醇和丁酮斑点处的线虫进行定量后，按此处所示计算 KeyAx 指数。野生型线虫对 10% 丁酮的典型天然趋化指数约为 0.2。嗅觉训练或间隔训练通常可使趋化指数在训练后即刻（0 时）提高至 0.7 到 0.8，从而获得约 0.6 的学习指数。初级趋化性对线虫的正常培养条件高度敏感。该图展示了充分喂食与饥饿状态下的初级线虫在趋化指数（CI）上的显著差异，突显了正确操作技术的重要性。记忆保持能力体现在当野生型动物的学习指数为零时，趋化指数恢复至初级水平所需的时间。短期关联记忆在约两小时的集中训练后一小时即开始下降，且与转录因子kreb无关。相比之下，长期关联记忆通常在长达40小时的间隔训练后16小时才开始显著下降，且依赖于Creb。在进行该实验操作时，需注意化学趋向性实验可能受到环境中的饥饿状态或过强气味的影响，同时需注意记忆和线虫的行为可能因过度的物理扰动而受到干扰。

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