Name: 多鼠神经解剖学磁共振成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习使用磁共振成像技术对小鼠进行高通量表型分析的方法，涵盖活体与离体成像流程。该技术可完整保存脑部解剖结构，支持三维全脑覆盖，为研究基因与疾病表型关系提供高效工具。

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本工作是多伦多病童医院和多伦多大学小鼠影像中心（MICe）的一部分。

1. 多只小鼠 体内 脑成像：
在对活体动物进行成像时，整个成像过程中必须具备以下几个关键要素：1）安全的麻醉方法，2）环境控制，以及3）生理监测。此外，在同时对多个受试动物进行成像时，还需考虑准备过程的便捷性和速度，以及动物体位的可重复性，以利于图像配准。因此，设计并制作了三个主要的定制组件：用于将小鼠插入磁共振成像仪射频线圈的装载系统，用于辅助准备的诱导麻醉室，以及带有嵌入式监测导联的平台，以标准化动物体位。
上样系统：
小鼠装载系统由两个主要部分组成：“小鼠蜂巢”和“装载阵列”。“小鼠蜂巢”的主要功能是在磁体孔内将七个Millipede射频线圈（Varian NMR Systems，Palo Alto，CA）排列成六边形阵列。装载阵列用于固定并运输多个小鼠，这些小鼠被安置在50毫升离心管中，管尖钻有小孔，以便麻醉气体进入。在磁体附近的准备区域对小鼠实施麻醉并连接监测设备后，将其插入经改造的离心管中，并安装到装载阵列上。所有小鼠安装完毕后，将装载阵列运送并插入磁体中，并定位在导轨系统上。该导轨系统允许阵列在推入磁体孔时与“小鼠蜂巢”对接。当完全插入磁体后，离心管会与射频线圈内的麻醉输送系统对接。由“小鼠蜂巢”端通过每根线圈轴向的管道向样本输送混合氧气的异氟烷。这种麻醉气体混合物流入离心管，流经小鼠周围，并由连接在装载阵列后部的主动废气收集装置收集（图1）。
诱导室：
由于成像时间可能长达三小时，最大限度缩短动物准备时间对于减少小鼠暴露于麻醉剂的时间至关重要。因此，我们开发了一种定制的诱导室以简化准备流程（图2）。该定制诱导室为多只小鼠的麻醉诱导和操作提供了一个统一的环境。诱导室由透明丙烯酸材料制成，配有可自动闭合的硅胶虹膜端口，以减少麻醉气体泄漏，并允许操作者无需使用特殊手套即可接触内部环境。与传统用于单只小鼠的面罩和回路系统相比，该诱导室足够大，可容纳多达二十只小鼠，并可在无需连接笨重的管路和面罩的情况下自由操作小鼠。设备通过被动废气清除系统收集废气，并持续供应麻醉气体。腔室底部装有电阻加热元件，用于加热腔室地板，以在准备过程中维持动物的体温。
雪橇：
为小鼠进行磁共振成像（MRI）准备时，最繁琐且耗时的步骤之一是安装心电图（ECG）电极和直肠温度探头。此外，许多传统电极（如套筒式和针式电极）会改变动物的正常体位，导致体位标准化困难。因此，我们设计了一种定制的、与动物体型贴合的定位平台，内置心电图、呼吸和温度探头，称为“滑板”（'sled'，美国专利 7,146,936）（图3）。使用尼龙搭扣固定装置作为运动限制部件，以限制头部移动。
多只小鼠 体内 脑成像步骤：
<ol>
<li>所有小鼠实验均需获得当地动物护理委员会（ACC）、机构动物护理与使用委员会（IACUC）或同等机构的批准，方可进行小鼠操作。</li>
<li>动物识别与称重等所有操作均应在生物安全柜（BSC）内及MRI单元中进行。动物被转移至可高压灭菌的塑料容器中，并运送至MRI麻醉诱导舱。</li>
<li>小鼠在预加热的诱导舱中使用4%异氟烷和4 L/min氧气进行麻醉。当动物对足垫夹捏无反应时，表明已完全麻醉。如有必要，使用脱毛剂（NAIR）去除胸部毛发，以确保与定制载具中集成的心电图（ECG）和体温监测设备良好接触。眼部涂抹Eve软膏（Tears Naturale P.M.）以防止干燥，并皮下注射约0.3 mL生理盐水以维持水合状态。</li>
<li>如需增强对比效果，可使用Gd-DTPA-BMA（Omniscan）。若使用Gd-DTPA，应将其溶于生理盐水（终体积300uL），并在MRI扫描前通过腹腔注射（IP）给予单次剂量1 mmol/kg。</li>
<li>随后将小鼠装入各自的载具中，用头部固定带固定，并滑入开口式50 mL锥形管（图3）。每次最多可同时扫描7只活体小鼠。所有动物装载完毕并连接生理监测设备后，将磁体孔道内的异氟烷浓度设为2%，氧气流速设为8 L/min。</li>
<li>锥形管被安装至对接系统（图1），该系统可将每只小鼠均匀地定位至磁体孔道中心的射频线圈内。装载完成后，可将异氟烷浓度降低至0.9–2%。在整个扫描过程中持续监测每只动物的心电图和体温，并通过加热空气保持动物体温。</li>
<li>每次三维扫描的持续时间约为3小时。具体参数如下：快速自旋回波序列，TR为2300 ms，有效TE（TEeff）为36 ms，回波链长度为8，信号平均次数为1次。最终成像分辨率为125 μm（图4）。</li>
<li>扫描完成后，将动物从磁体中取出，并转移至充满100%氧气的温控诱导舱中卸载。动物被转移至密封塑料容器，并在BSC下运送。随后将其置于温暖无风的笼具中，使其从麻醉状态中恢复。</li>
</ol>
2. 多只小鼠 离体 脑成像：
由于不受运动伪影影响，固定样本磁共振成像的分辨率高于活体成像。高分辨率的三维数据集在提取定量信息方面具有最大的灵活性，并支持自动化图像分析。为实现对固定在颅内的小鼠脑组织进行高分辨率磁共振成像，开发了一种定制的射频线圈阵列，可在过夜扫描期间并行采集16组高分辨率磁共振数据集。
16线圈 离体 脑成像阵列：
定制构建了一个16线圈螺线管阵列，用于同时成像16个样品。该设计改进了早期用于在60 mm插入式梯度系统中同时成像3个样品的原型。该8匝螺线管线圈在两端过绕，可在26 mm长度范围内提供优于10%的均匀灵敏度，并各自屏蔽于模块化腔室中（Idziak和Haeberlen，1982）。16个线圈腔室组装在一个框架上（图5），该框架将线圈定位在梯度系统内，并通过气动气囊夹紧固定，以最大限度减少移动。
多只小鼠 离体 脑成像步骤：
<ol>
<li>打开胸腔，将针头（或安全型带翼输液器，25G × 3⁄4）插入经腹腔注射戊巴比妥（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉的小鼠左心室，剪开右心耳。</li>
<li>以约 100 mL/hr 的流速，经心脏灌注冲洗 30 mL 室温 1× PBS + 1 μL/mL 肝素（1000 USP 单位/mL）+ 2 mM ProHance。</li>
<li>以 100 mL/hr 的流速，灌注 30 mL 4% PFA（室温）+ 2 mM ProHance 进行固定。</li>
<li>断头，去除皮肤、下颌、耳朵及软骨性鼻尖。</li>
<li>将剩余颅骨结构置于 4% PFA + 2 mM ProHance 中，4°C 下过夜固定。</li>
<li>转移至 1× PBS + 0.02% 叠氮化钠 + 2 mM ProHance 溶液中保存。</li>
<li>灌注后 4 天至不超过 2.5 个月内，进行 7 特斯拉高分辨率三维 MRI 扫描。将脑组织置于 16 通道螺线管线圈阵列中（图 5）。</li>
<li>成像参数如下：快速自旋回波序列，TR 为 325 ms，有效 TE 为 30 ms，回波链长度为 6，信号平均次数为 4。最终图像各向同性分辨率为 32 μm（图 6），扫描时间约为 12 小时。</li>
<li>扫描完成后，将颅骨置于 10% 甲醛 + 2 mM ProHance 中以长期保存。</li>
</ol>

3. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig1.jpg" alt="用于实验室研究中实验分离的离心机设置示意图，包含离心管。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠装载系统。“装载阵列”与“小鼠蜂巢”通过共用的玻璃纤维导轨系统连接。
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig2.jpg" alt="麻醉室装置；虹膜端口，加载阵列；控制气体输送的操作设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 诱导室。
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig3.jpg" alt="啮齿类动物实验装置：A. 带有心电图电极的固定系统，B. 用于动物操作的注射器。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. a) 实验滑车，显示嵌入的监测传感器和头部固定装置。b) 一只麻醉小鼠置于带有头部固定装置的滑车上。滑车组件可轻松插入离心管中。
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig4.jpg" alt="MRI扫描序列显示脑部横断面，医学影像分析，诊断方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图4. 代表性 体内 一次持续3小时的三维扫描获取的多幅脑部图像。
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig5.jpg" alt="用于光学激发研究的多通道光谱系统，配备传感器阵列。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 用于扫描16个固定脑样本的16通道电磁线圈阵列。
<img src="/files/ftp_upload/2497/2497fig6.jpg" alt="MRI脑部扫描显示冠状面、矢状面和横断面切片；神经影像学研究解剖图示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 代表性 离体 脑部图像。

<ol><li>Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-mouse+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple-mouse MRI.</a> Magn. Reson. Med. 49, 158-167 (2003).</li>
<li>Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mouse+biological+loading+and+monitoring+system+for+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI.</a> Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).</li>
<li>Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+revealed+in+the+structure+of+the+mouse+brain+using+three-dimensional+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging.</a> NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).</li>
<li>Idziak, S., Haeberlen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+high+homogeneity+rf+coil+for+solid-state+multiple-pulse+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR.</a> J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

两者 体内 和 离体 小鼠成像系统可同时对多个受试对象进行成像，从而在不增加成像时间的情况下显著提高成像研究的通量。来自两者的脑部图像 体内 和 离体 多只小鼠成像技术具有高质量，分别适用于小鼠大脑主要结构和次要结构的表型分析。
为尽量减少多个样本的动物准备时间，流程的并行化至关重要。例如，诱导室的开发使得多个样本可同时进行诱导，而载物滑板则实现了心电图和温度探针的同步应用，同时标准化了动物体位。此外，我们的 离体 成像系统使我们能够一次性获取16个固定全脑的高分辨率三维图像，非常适合高通量表型研究。
我们研究的可能局限性 体内 成像系统的局限性包括无法对每只小鼠单独控制麻醉和温度。如有需要，可通过为每只小鼠配备独立的麻醉蒸发器来实现个体化的麻醉控制。该系统的另一局限性在于 体内 成像系统的限制在于扫描对象仅限于体重小于约32克的小鼠。然而，目前已有计划通过增大线圈尺寸以适应更大的动物。

<table><tbody><tr><td>异氟烷，USP（AErrane）</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>CA2L9108</td><td></td></tr><tr><td>NAIR</td><td>教堂 &amp;amp; Dwight Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>爱尔康</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Omniscan（钆喷酸葡胺注射液 USP） </td><td>GE Healthcare</td><td>J-110A</td><td></td></tr><tr><td>定制雪橇 </td><td>Dazai 研究仪器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的 PBS </td><td>Wisent 公司</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>肝素 10000USP/10ml </td><td>加拿大制药合作伙伴</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>ProHance（钆特醇注射液 USP）</td><td>Bracco 诊断</td><td>11181</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr></tbody></table>

多只小鼠神经解剖磁共振成像

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

利用磁共振成像（MRI）对小鼠进行表型分析的研究领域正在迅速发展，其推动力来自于对改进人类疾病小鼠模型表征与评估工具的迫切需求。MRI 是研究基因修饰动物的理想手段，能够实现全脑覆盖，可用于活体（in vivo）检测，并提供多种对比机制，以探究神经解剖学和生理学的不同方面。随着高场强扫描仪的出现以及可同时扫描多只小鼠的技术进步，新型突变的快速表型分析已成为可能。
有效的小鼠 MRI 研究需要关注实验设计的诸多方面。本文将介绍利用在同一磁体中共用屏蔽式发射/接收射频（RF）线圈同时成像小鼠的系统，获取用于小鼠表型分析的高质量图像的一般方法（Bock 等，2003）。我们特别关注解剖表型分析，这是本影像中心在多种小鼠模型中已展现出高影响力潜力的重要且易于实施的应用。在详细介绍图像采集步骤之前，需首先考虑以下重要的实际问题，涉及 体内 脑成像（Dazai 等，2004）和 离体 脑成像（Spring 等，2007）中应予以注意。以下将对此进行讨论。

磁共振成像（MRI）已成为研究基因改造小鼠表型的日益流行的工具。本文阐述了利用多只小鼠同时进行MRI扫描，以实现对基因改造小鼠高通量表型分析所必需的方法。

小鼠表型分析领域正随着磁共振成像（MRI）技术的快速发展而不断拓展，其发展动力源于对更优工具的需求，以更精确地表征和……

本实验的总体目标是利用多只小鼠脑部 MRI 技术，对活体或固定的小鼠实现高通量表型分析。首先，对每只小鼠进行麻醉处理。随后，在进行活体扫描时，将每只小鼠放置于尺寸合适的滑板上，再将其装入载入阵列，并定位至磁体孔道内。或者进行离体成像时，执行心脏灌注，分离颅骨结构并将其放入成像管中，随后将成像管置于磁体孔内的16通道螺线管线圈阵列中。最终可获得三维磁共振成像体积数据，显示出高质量的小鼠脑部图像，适用于表型分析以及小鼠大脑中主要和次要结构的观察。该技术相较于组织学等现有方法的主要优势在于，能够保留标本在颅骨内的大体解剖结构，并实现全脑覆盖及三维分析。该方法有助于解答生物医学领域的关键问题，例如在疾病小鼠模型中，基因与代表表型的解剖学差异之间的关系。通常，初次接触该技术的研究人员会发现，开发用于高通量脑成像的定制小鼠装载装置和射频线圈阵列具有一定难度。在开始本方案之前，必须首先获得所在机构的动物护理委员会、地方动物护理与使用委员会或相应机构对所有批量处理操作的批准，并完成个体识别、体重测量等初步操作。应在生物安全柜内对动物进行记录。随后，将动物转移至可高压灭菌的塑料容器中，运送到 MRI 诱导室。在预热的诱导室中，使用 4% 异氟烷和每分钟 4 升氧气对需扫描的动物进行麻醉。当动物对足部夹捏无反应时，即表示已完全麻醉。如有必要，可使用脱毛剂（如nare）去除胸部毛发，以确保与定制滑板中集成的心电图和体温监测设备更好地接触。同时，应在眼睛上涂抹ISV（如天然PMM人工泪液），以防止角膜干燥，并通过皮下注射给予约0.3毫升生理盐水。为动物补充水分。现在将小鼠分别放置在带有嵌入式心电图、呼吸和温度探针的个体滑板上。注意将小鼠的前后肢准确放入滑板上的凹槽中。当需要进行心电图监测时，确保小鼠腹侧无毛区域与心电图探头对齐，使用头部固定带和鼻部固定带将每只动物固定，然后将每个载物 sled 滑入一个开口的 50 毫升锥形管中。一次成像过程中最多可同时准备七只活体小鼠。接下来，将锥形管安装到装载阵列上。所有动物装载完毕后，务必连接全部生理监测导线。将磁体孔内的异氟烷浓度设为2%，氧气流速设为每分钟8升。现在将装载装置移至磁体旁，并将其放置在导轨系统上。使用轨道系统将装样阵列与小鼠巢穴连接，后者用于将小鼠均匀地定位至磁体孔道中心的各个射频线圈中。当完全插入磁体时，离心管会与射频线圈内的麻醉输送系统对接，如图所示，来自小鼠巢穴的异氟烷氟气与氧气的混合气体通过沿每个独立线圈轴向布置的管道输送至样本。该麻醉气体混合物流经小鼠所在的管路后，由连接在装样阵列后端的主动废气收集装置收集。根据动物的生理读数（如呼吸和体温），异氟烷（isof）和氟化物水平应设置在0.9%至2%之间。现在，使用快速bin回波序列对动物进行扫描。每次三维扫描的持续时间约为三小时，最终图像分辨率为125微米。在扫描过程中，务必持续监测每只动物的心电图（ECG）读数、呼吸和体温。扫描过程中，应使用暖空气气流保持动物体温。扫描完成后，将装载阵列从磁体中取出，并放入充满100%氧气的温暖诱导舱内。将动物从管中卸下，并转移至密封的塑料容器中，运送至生物安全柜。最后，将动物置于温暖无风的笼子中，使其从麻醉状态中恢复，以进行离体动物成像。首先，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪的混合物，使动物完全麻醉。在开始灌注前，通过脚趾或脚掌夹捏来评估麻醉的手术平面。打开胸腔，将针头或安全型带翼输液器插入心脏的左心室，然后剪开右心房以开始经心脏灌注。首先以每小时约100毫升的流速，用30毫升室温的1×磷酸盐缓冲液（含1微升/毫升肝素和2毫摩尔普罗帕酮）进行灌注冲洗。此步骤大约需要20分钟。接下来使用30毫升室温的4%多聚甲醛与2毫摩尔的pro hands混合液，以每小时100毫升的流速进行第二次固定灌注。现在处死动物，去除皮肤、下颌、耳部以及软骨性鼻尖。然后将剩余的颅骨结构置于含有2毫摩尔pro hands的4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定过夜。次日，将样本转移至含有0.02%叠氮化钠和2毫摩尔pro hands的1×磷酸盐缓冲液中保存。高分辨率三维磁共振成像（7特斯拉）扫描应在固定后至少4天进行，但不得超过两个半月。灌注后，将待成像的脑组织置于16通道螺线管线圈阵列中，并将该阵列放入扫描仪。随后使用快速自旋回波序列对样本进行扫描。该扫描持续时间约为12小时，最终图像将具有32微米的各向同性分辨率。扫描完成后，从成像线圈中取出样本，并将每个颅骨置于含2毫摩尔普鲁卡因的10%福尔马林溶液中以进行保存，以代表体内状态。此处展示的是通过一次三小时扫描获得的多个小鼠脑部成像图像。该图展示了所扫描的七只小鼠中每只小鼠的三个观察轴向。此处为一幅具有32微米各向同性分辨率的离体脑组织图像。在此，我们可以看到一幅离体图像体积的三维重建结果，一旦掌握该技术即可实现。如果操作得当，这种体内技术可在三到四小时内完成。许多生物医学领域的研究人员均可使用该技术，在小鼠模型中研究狼疮、亨廷顿病和阿尔茨海默病等疾病。观看本视频后，您将充分掌握如何对活体和固定样本进行成像，以利用磁共振成像（MRI）获得高质量的脑部图像。感谢观看。

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