分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

以下实验的总体目标是分析含有独特肽基tRNA的纯化核糖体的结构与功能。该目标通过使用释放因子耗竭的无细胞提取物和生物素标记的mRNA进行体外翻译实验来实现，从而生成停滞的肽基tRNA-核糖体复合物，并使其与生物素标记的mRNA结合。第二步，将链霉亲和素包被的顺磁性微珠与体外翻译反应混合，使其与mRNA中的生物素分子发生相互作用。

随后，利用磁场提取磁珠，将停滞的肽基-tRNA-核糖体复合物连同其结合的mRNA从总反应体系中分离出来。接下来，可将纯化的肽基-tRNA-核糖体复合物与释放因子、翻译抑制性抗生素或化学修饰试剂等翻译因子混合，以分析其功能。通过肽基转移酶活性检测或使用SDS-Tris丙烯酰胺凝胶进行的翻译终止实验，以及利用尿素聚丙烯酰胺凝胶进行的修饰保护实验，获得的结果显示肽基-tRNA的水解受到抑制，并且该抑制效应与核糖体的结构变化相关。

与差速离心等现有方法相比，该技术的主要优势在于所分离的样品主要包含仅带有一种肽基-tRNA群体的核糖体。该方法有助于回答基因表达领域中的关键问题，例如新生多肽的性质以及抗生素如何通过调控翻译过程来影响核糖体功能。开始此操作前，需从对数生长期培养物中获取两克干燥的大肠杆菌菌体沉淀。

将菌体沉淀用一升缓冲液重悬进行洗涤，随后在4°C下以5,000 ×g离心五分钟。完成两次洗涤后，将所得的细菌沉淀重悬于40毫升缓冲液中，并使用法国压菌器在6,000 PSI压力下裂解细菌细胞。该压力对应于使用一英寸活塞时的600个单位。

将破碎后的悬液收集到一个50毫升的洁净玻璃管中。用一毫摩尔的DIO三醇或DTT处理破碎后的悬液，然后在30,000 ×g下离心30分钟。弃去所得上清液，并重复离心步骤。

保存第二次离心后获得的上清液，将最终上清液分装至微量离心管中。最后，使用干冰乙醇混合物或液氮迅速冷冻等分试样，并将样品储存在负60或负80摄氏度条件下。

通过将4.5毫升蛋白A Spheros 4B混悬珠与5毫升抗RF2抗血清混合，开始制备去除RF2的无细胞提取物。在室温下于旋转轮上旋转混合物1小时。在2,500 ×g下离心混合物，以分离珠子与抗血清。

弃去上清液。此时磁珠已结合抗RF二抗，称为抗RF二抗磁珠。用一毫升缓冲液B重悬磁珠以洗涤。

然后像之前一样离心磁珠，以分离抗 RF 二磁珠与缓冲液 B。重复此洗涤步骤两次。洗涤磁珠后，将一毫升无细胞提取物与 150 微升抗 RF 二磁珠混合，并在 4°C 下于旋转仪上孵育两小时。孵育结束后，将混合物在 10,000 ×g 离心，以分离无细胞提取物与磁珠。

弃去上清液，再加入150微升抗RF二珠子进行处理，并重复孵育和沉淀一次。将最终去除RF二的无细胞提取液分装至微量管中，每管100微升。使用干冰乙醇混合物或液氮冷冻分装样品，并于-60或-80摄氏度保存。

通过将含有待转录序列的质粒模板、寡核苷酸脱氧核苷酸、dNTPs、完整的DNA聚合酶以及策略性PCR缓冲液混合，来制备PCR反应体系。PCR样品制备完成后，进行扩增反应，并通过加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠（pH 5.2）和两倍体积的冰乙醇沉淀DNA，以纯化PCR产物。重复沉淀步骤一次后，将所得DNA溶解于100微升焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水或双蒸水（dsy处理水）中。

通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的完整性。通常，该程序可获得100微克长度为600个碱基对的DNA产物。在经去深度处理的水中配制100微升体外转录反应体系，将5微克PCR扩增的DNA片段与生物素标记的UTP核糖核苷酸及T7酶混合物混合。

将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 3 小时。为了定量获得的 mRNA 量，通过加入无 RNA 酶的 DNase 去除 DNA 模板。将反应物在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

为纯化mRNA产物，加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠（pH 5.2）和两倍体积的冷乙醇，将RNA沉淀两次，然后将沉淀的mRNA重悬于100微升经DEPC处理的水中。通过琼脂糖凝胶电泳检测生物素标记的mRNA产物的完整性。通常该方法可获得1至2毫克长度为600个核苷酸的生物素标记mRNA产物。开始分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体时，使用DEPC处理的水配制500微升体外翻译反应体系。

首先，配制随附书面方案中所述的缓冲反应混合液，然后向其中加入除将被放射性氨基酸替代之外的每种氨基酸至终浓度为 75 M。接着，向含有氨基酸的缓冲溶液中加入 20 至 50 微升的 RF 二缺失无细胞提取物。将混合物在室温下孵育 5 分钟，以激活核糖体。

核糖体激活后，向样品中加入10至15微克生物素标记的mRNA。将反应体系在37摄氏度孵育10分钟。

同时，在缓冲液 C 中制备三毫升链霉亲和素磁珠（streptavidin paramagnetic beads）或 SMB。孵育结束后，将 SMP 悬液加入翻译反应混合物中，在室温下孵育 10 分钟。使用磁力分离架施加磁场，将 SMB 从混合物中分离出来。Resus。

将SMB重悬于缓冲液C中，使用磁力架再次分离磁珠。重复此洗涤步骤两次后，将磁珠重悬于500 µL缓冲液C中。将悬浮液置于冰上保存，并立即进行下一步操作。为观察肽基-tRNA，取10 µL悬浮在缓冲液C中的SMB与10 µL上样缓冲液混合，通过在10% Tris-三（羟甲基）氨基甲烷-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离结合在磁珠上的组分。

使用真空凝胶干燥仪干燥凝胶。然后将干燥后的凝胶暴露于X射线胶片，以验证肽-tRNA的完整性和纯度。为分析核糖体RNA，将190 µL用DEPC处理水配制的2 mM EDTA溶液、200 µL经水饱和的苯酚以及10 µL珠悬浮液混合。

通过剧烈涡旋混合所得悬浮液。在室温下以10,000 ×g离心3分钟，分离无机相与有机相，收集上层水相至新的微量离心管中。向水相中加入十分之一体积的3 mol/L乙酸钠（pH 5.2）、1 μL 20 mg/mL的糖原溶液以及两倍体积的预冷乙醇，沉淀RNA。将沉淀的RNA重悬于10 μL经DEPC处理的水中。

通过硝酸纤维素凝胶电泳验证核糖体RNA的完整性。通常50微升的裂解液可获得1微克核糖体RNA。此处展示了一系列分析结果，用于评估分离得到的正在翻译的核糖体的质量与功能活性。

在聚丙烯酰胺凝胶中观察到一条独特的条带，表明存在与结合在SMB上的生物素标记mRNA结合的多肽。核糖体RNA的纯化。通过此方法还可确认核糖体与这些生物素标记的mRNA结合的存在。

加入嘌呤霉素（一种可激活核糖体肽基转移酶活性的抗生素）会导致新生肽链-tRNA发生断裂。这一现象在聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为分离出的多肽迁移模式的改变。综合这些数据表明，连接在SMB上的生物素标记mRNA含有具有功能活性的核糖体及肽链-tRNA复合物。

分离含有特定肽基-tRNA的正在翻译的核糖体，可用来研究肽基-tRNA、抗生素及其他分子对核糖体功能和核糖体结构的影响。在本文所示的例子中，抗生素链霉素以及氨基酸色氨酸可抑制释放因子RF2对新生TNAC-tRNA肽基-tRNA的水解性切割反应，该反应发生在分离的核糖体中。

色氨酸或斯巴霉素与核糖体的相互作用也会诱导构成正在翻译的核糖体23 S rRNA的某些核苷酸发生结构变化。若操作得当，掌握该技术后，其主要步骤可在五小时内完成。此外，还可采用冷冻电镜等其他方法进行进一步的结构分析，以探究含有特殊肽链和RNA的核糖体结构相关问题。