从小鼠胚胎肾脏生肾区分离和培养细胞

本实验的总体目标是从发育中的肾脏中分离出肾源区细胞，并建立其原代培养体系。首先，取第17.5天的胚胎，解剖分离出肾脏；接下来的步骤是去除肾脏包膜。

随后对器官进行有限的酶消化，以从生肾区分离出帽状间充质细胞和皮质间质细胞。该实验方案的最后一步是将细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，并在无血清培养基中进行培养。最终，可通过特定标志物的免疫染色获得结果，证明得到纯化的生肾区细胞群体。

尽管该方法可用于研究细胞信号传导，也可用于理解细胞扩展的底物需求。例如，在进行移植技术时，将由本实验室的技术员 Derek Adams 和本实验室的博士后 Aaron Brown 演示该操作流程。在按照书面方案准备好所需溶液并处理组织培养皿后，通过在 E 17.5 时期处死母鼠，开始小鼠胚胎肾脏的解剖。

根据您所在机构的指导原则，取出子宫并将其放入含有数毫升二十二烷酸盐（docos sate）、缓冲盐水或含钙镁的DPVS的培养皿中。在解剖显微镜下，使用钟表匠镊子取出每个胚胎，并用另一对镊子进行断头处理。当整窝胚胎均从子宫中取出并完成断头后，将胚胎转移至一个洁净的培养皿中，其中加入足量的含钙镁的DPBS，以完全覆盖胚胎。

尽可能保留每个胚胎的血液和组织碎片，用镊子在脐部水平的腹壁做环形切口。然后将胚胎仰卧放置，用一组镊子固定肩部。用另一组镊子将从肺部到膀胱的内脏器官取出。

肾脏将附着在内脏团块的后部。接下来，轻轻地将肾脏与其他器官分离，注意保持两侧肾脏相互连接。

然后用一把镊子夹住肾脏之间的组织，用另一把镊子夹住附着在其中一个肾脏被膜上的肾上腺。轻轻将被膜从肾脏上剥离，注意不要损伤肾脏。

务必去除肾脏上残留的任何包膜，如果仍有附着，还需去除输尿管。对另一侧肾脏重复此操作。最后，将移液管剪裁至合适直径，轻柔地将肾脏转移至含有5毫升HBSS的聚苯乙烯管中。

对每个胚胎重复肾脏分离操作，并在无菌环境中将最多八个肾脏汇集至同一离心管中。开始酶消化过程：首先用移液器从含有肾脏的5毫升离心管中移除HBSS溶液，注意避免接触肾脏，随后立即加入1.5毫升胶原酶（collagenase），即胰蛋白酶消化液。

对每管肾脏样品重复上述操作并盖紧管盖。随后将样品置于37°C摇床培养箱中振荡15分钟。在孵育即将结束前，为每个需要进行消化反应的样品，在新的5毫升聚苯乙烯管中加入3微升浓度为1单位/微升的DNase。

孵育结束后，迅速将消化液从培养箱中取出，加入75微升胎牛血清，轻轻颠倒混匀三次，室温静置两分钟。然后将1.4毫升细胞悬液转移至含有DNA混合物的5毫升聚苯乙烯管中，放入37°C培养箱内的摇床中孵育10分钟。

孵育结束后，将每种细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，在325 × g条件下离心5分钟。随后，弃去上清液，将离心管在325 × g条件下再次离心5分钟。用移液器上下吹打5至6次，将沉淀重悬于1毫升5% FBS-HBSS中。

在处理下一个样本前，先将每支试管盖紧。离心后，移除SNAT，并在所有试管均添加培养基后，向每支试管中加入500 µL含添加剂的KSFM。使用1 mL微量移液器轻轻吹打细胞沉淀5至6次，使细胞重悬。将所有细胞悬液合并至一支新的5 mL聚苯乙烯试管中。

现在将细胞悬液通过预先润湿的40微米细胞筛帽过滤，并将滤过液收集到新的聚苯乙烯管中。当所有滤过液收集完毕后，避免移液器吸头接触滤筛。使用新的预先润湿的细胞筛帽，将滤过液再次过滤一次。

取出滤网，并用新试管中的新鲜无菌盖子盖紧试管。计数细胞，并以每平方厘米100,000至200,000个细胞的密度，将细胞接种于含添加剂的KSM培养基中，置于纤维编码培养板中。将生肾区细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育2至4小时，使其恢复并贴壁，之后再进行实验刺激。

图中显示的是相差显微镜下20倍放大的图像，细胞为肾源区细胞，接种密度为每平方厘米200,000个细胞，培养24小时。在此图像中，肾源区细胞经抗PAX2抗体染色，该抗体特异性标记肾单位祖细胞，呈红色；细胞核用DAPI复染，呈蓝色。

在40倍放大倍数下显示了一个肾单位祖细胞簇的相差显微图像。为进一步验证特异性，从胚胎中分离出肾源区细胞，这些胚胎携带在FoxD1启动子控制下表达的laxy基因，该启动子在间质细胞群中表达。随后，对发育中肾脏肾源区的细胞进行染色，其中DAPI Titan用于将细胞核染成蓝色，F-肌动蛋白染成绿色，抗β-半乳糖苷酶抗体染成红色。

掌握该技术后，可在约两小时内建立肾源区细胞的单层原代培养体系。此类培养体系有利于对肾单位前体细胞发育过程中的细胞信号通路进行快速、高通量的研究，且非常适合病毒转导、重组蛋白处理以及小分子化合物处理。此外，还可结合细胞分选技术，从这些培养物中分离特定的细胞类型。