Name: 修改ES / OP9共培养协议，提供增强造血后代的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学习利用mStrawberry OP9共培养系统将小鼠胚胎干细胞分化为造血谱系的方法。该技术可完整评估所有ES衍生后代，用于研究造血发育及相关缺陷，无需使用胚胎。

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我们感谢 U. Ganapati 在建立和测试 mStrawberry OP9 细胞系方面所做的工作。此外，我们感谢 H. Shafifor 在共培养实验中的协助。H.P. 获得了美国国家心肺血液研究所（F31HL087714）提供的博士前奖学金支持（H.P.）。本研究内容仅由作者负责，不一定代表美国国家心肺血液研究所或美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。加州大学洛杉矶分校（UCLA）流式细胞术核心设施得到了 NIH（CA-16042 和 AI-28697）、Jonsson 癌症研究中心、UCLA 艾滋病研究所以及 UCLA 医学院的支持。

1. ES 细胞的制备
<ol>
	<li>根据您特定细胞系的标准方案培养ES细胞。确保准备足量的ES细胞，用于在第0天接种至表达mStrawberry的OP9细胞上（ES细胞接种密度为每平方厘米1×10^3个细胞）。2 在第0天</li>
</ol>
2. OP9 细胞的准备
<ol>
	<li>在培养mStrawberry OP9细胞前，先准备好OP9生长培养基 
	OP-9 细胞培养基 
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>储备液</td>
				<td>最终浓度</td>
				<td>体积（mL）</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>aMEM</td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>39.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>FBS（经OP-9细胞测试）</td>
				<td>100%</td>
				<td>20%</td>
				<td>10</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>L-谷氨酰胺</td>
				<td>100倍（200 mM）</td>
				<td>2 mM</td>
				<td>0.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>50 mL</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	储存于 4°C 并在配制后一周内使用</li>
	<li>为维持 mStrawberry OP9 细胞的生长，需每 2 天更换一次培养基，并在细胞达到汇合前进行传代（传代时细胞汇合度为 70–90%）。mStrawberry OP9 细胞培养物的汇合度不得超过 90%，否则将导致其分化为脂肪细胞。参见图 3。
	<ol class="lalpha">
		<li>用 PBS 洗涤细胞 2 次（或用 PBS 洗涤 1 次，再用 0.1% 胰蛋白酶-EDTA 洗涤 1 次）进行细胞传代</li>
		<li>添加 预热的 0.1% 胰蛋白酶-EDTA 37°C 5 分钟（或直至细胞脱落）</li>
		<li>当细胞脱落后，加入 OP-9 生长培养基。将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中。</li>
		<li>在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。 弃去上清液。</li>
		<li>在新鲜的 mStrawberry OP9 生长培养基中重悬细胞</li>
		<li>以每平方厘米至少10个细胞的密度接种4细胞/厘米²2</li>
		<li>从实验第0天、第5天或第8/9天前3天开始，将mStrawberry OP9细胞培养至汇合，以用于后续与胚胎干细胞的共培养</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ES/mStrawberry OP9 共培养
<ol>
	<li>准备共培养分化培养基 
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>储存液</td>
				<td>终浓度</td>
				<td>体积 (mL)</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>aMEM</td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>39.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>FBS</td>
				<td>100%</td>
				<td>20%</td>
				<td>10</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>L-谷氨酰胺</td>
				<td>200 mM</td>
				<td>2 mM</td>
				<td>0.5</td>
			</tr>
			<tr>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td> </td>
				<td>50 mL</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>mStrawberry OP9 细胞（第 –3 天）
	<ol class="lalpha">
		<li>务必在第 –3 天对 OP9 细胞进行传代培养，以确保在共培养第 0 天时获得融合的 mStrawberry OP9 细胞层。参见图 4b。将 mStrawberry OP9 细胞以 1×104/cm2 的密度接种，以实现在第 0 天达到融合状态。务必额外传代培养部分细胞，用于第 5 天及第 8/9 天的共培养延续。</li>
	</ol>
	</li>
	<li class="jove_content">ES/mStrawberry OP9 共培养体系建立（第 0 天）
	<ol class="lalpha">
		<li class="jove_content">用 PBS 洗涤 ES 细胞 2 次</li>
		<li>使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 ES 细胞，于 37°C 孵育 5 分钟</li>
		<li>向细胞中加入共培养分化培养基</li>
		<li>在室温下以 400×g 离心 5–7 分钟，收集细胞沉淀，弃去上清液</li>
		<li>用共培养分化培养基重悬细胞</li>
		<li>移除 mStrawberry OP9 细胞中的培养基</li>
		<li>向 mStrawberry OP9 培养瓶中加入共培养分化培养基</li>
		<li>以 1×103 ES 细胞/cm2 的密度将 ES 细胞接种至 mStrawberry OP9 培养瓶中。于 37°C、5% CO2 及饱和湿度条件下培养细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mStrawberry OP9 细胞（第 2 天）
	<ol class="lalpha">
		<li>对 mStrawberry OP9 细胞进行传代培养，以确保在共培养第 5 天时获得融合的 mStrawberry OP9 细胞层。以 1×104/cm2 的密度接种 mStrawberry OP9 细胞，使其在第 5 天达到融合状态（同步骤 3.2）。必要时，额外传代培养部分细胞用于第 8/9 天（同步骤 2.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ES/mStrawberry OP9 共培养（第 3 天）
	<ol class="lalpha">
		<li>小心移除共培养体系中的旧培养基，并更换为新鲜的共培养分化培养基</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	 ES/mStrawberry OP9 共培养（第 5 天） 
	<ol class="lalpha">
		<li>用 PBS 小心洗涤共培养细胞 2 次</li>
		<li>使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞</li>
		<li>用共培养分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来</li>
		<li>在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液</li>
		<li>向细胞中加入共培养分化培养基。 使用 21 号钝头针重悬细胞，确保形成单细胞悬液</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞。ES 细胞数量应较第 0 天增加 100–150 倍。</li>
		<li>将 6.48×104/cm2 – 7.76×104/cm2 的共培养细胞重新接种至新的一层融合的 mStrawberry OP9 细胞上</li>
		<li>第 5 天检测——剩余的共培养细胞可用于流式细胞术分析、细胞涂片（30,000 个细胞）、ChIP 实验等</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ES/mStrawberry OP9 共培养（第 8/9 天和第 12 天）
	<ol class="lalpha">
		<li>移除培养瓶中的分化培养基并保存。用 PBS 洗涤单层细胞 1 次，以去除悬浮的造血细胞。切勿丢弃造血细胞。</li>
		<li>使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞</li>
		<li>用 ES 分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，并加入至悬浮的造血细胞中 =</li>
		<li>在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液</li>
		<li>向细胞中加入共培养分化培养基或 PBS。 使用 21 号钝头针重悬细胞，确保形成单细胞悬液，然后使用血细胞计数板计数细胞。</li>
		<li>共培养可延续至第 14 天，以评估更成熟的造血祖细胞：在第 8 或第 9 天将共培养细胞重新接种至新的一层融合的 mStrawberry OP9 细胞上，并在第 12 天再次传代。根据检测当天所需的细胞回收量，优化接种细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ES 来源子代细胞的评估（第 1–14 天）。可通过流式分选 mStrawberry 阴性细胞（ES 来源子代细胞）在共培养的任意一天对 ES 来源子代细胞进行评估。
	<ol class="lalpha">
		<li>移除培养瓶中的分化培养基并保存。用 PBS 洗涤单层细胞 1 次，以去除悬浮的造血细胞。切勿丢弃造血细胞。</li>
		<li>使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞</li>
		<li>用共培养分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，并加入至悬浮的造血细胞中</li>
		<li>在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀，弃去上清液</li>
		<li>使用 21 号钝头针重悬细胞并计数</li>
		<li>ES 来源子代细胞（mStrawberry 阴性细胞）可从 mStrawberry 阳性的 OP9 细胞中通过流式分选获得。随后可通过流式细胞术分析、细胞涂片、ChIP 实验等方法对 ES 来源子代细胞进行表征。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="小鼠ES/mStrawberry OP9共培养时间线；细胞收获与传代天数；研究示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. ES/mStrawberry OP9 共培养系统 我们实验室使用一种 体外 ES细胞共培养系统模拟造血发育。在此共培养系统中，ES细胞在第5天分化为成血管母细胞，此时将其接种于汇合的mStrawberry OP9细胞层上。随着共培养的进行，第8天出现造血前体细胞，至第14天则出现终末分化的造血细胞系。箭头指示ES细胞衍生物需传代至新的汇合mStrawberry OP9细胞层的分化时间点。
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="造血分化阶段，显微镜图像；细胞发育，血血管母细胞阶段，前体细胞" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠胚胎干细胞的正常分化。在分化第 0 天，将胚胎干细胞（ES 细胞）接种至 mStrawberry OP9 细胞的融合单层上。从分化第 3 天开始，可观察到 ES 细胞来源的子代细胞，表现为边界清晰的细胞簇，或开始形成漩涡状结构。在第 5 天，应出现血血管母细胞（hemangioblast），即内皮细胞系和造血细胞系共同的中胚层前体细胞，表现为成堆的漩涡状细胞结构。若共培养时间超过五天，ES 细胞来源的子代细胞应表现为造血细胞簇。在共培养第 6 至第 7 天，应出现由两到四个细胞组成的细胞簇，并在第 8 至第 9 天逐渐发育为更大的细胞簇。其他由 ES 细胞衍生的子代细胞也紧密附着于贴壁的基质细胞层上。
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="成血管母细胞形成，第5天，显微镜图像，发育异常模式，细胞研究分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 胚胎干细胞分化失败。 本共培养结果反映了胚胎干细胞分化异常。请注意，在第5天时，源自胚胎干细胞的后代细胞未呈现漩涡状排列。细胞缺乏漩涡状排列表明成血管母细胞形成异常。若成血管母细胞未能正常发育，则后续共培养将导致造血谱系分化受阻。此类成血管母细胞形成异常的共培养体系应予以弃用。
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="mStrawberry OP9 培养物，显微镜图像，非融合与融合细胞生长对比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. mStrawberry OP9 细胞培养物。（A）mStrawberry OP9 细胞在 70–90% 融合度时进行传代培养。（B）为实现有效分化，需将 ES 细胞及 ES 细胞衍生的后代细胞接种至高度融合的 mStrawberry OP9 细胞层上。
<img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="流式细胞术分析，散点图，mStrawberry+ 细胞分选，SSC-A 与 FSC-A 数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 典型的 ES/mStrawberry OP9 共培养流式图谱。 所有由 ES 细胞产生的子代细胞均为 mStrawberry 阴性细胞，可从 mStrawberry 标记的 OP9 细胞中通过流式分选获得。mStrawberry 阴性细胞门控范围通过传统的 ES/OP9 共培养体系确定。

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
<li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
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<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells%3A+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Embryonic+stem+cells+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cells : methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在融合的mStrawberry OP9细胞层上，胚胎干细胞（ES细胞）的适当分化可在共培养第5天产生Flk1+血管生成样细胞。血管生成样细胞应呈现为成堆的细胞漩涡状结构，如图1所示。在后续共培养过程中，可见的ES细胞来源后代应表现为造血细胞簇（图1）。在共培养第6/7天，应出现2至4个细胞簇，并在第8/9天发展为更大的细胞簇（包括贴壁生长和悬浮生长的细胞簇）。其他ES细胞来源的后代也紧密地存在于贴壁的基质细胞层内。
尽管方案中未列出，但对胚胎干细胞（ES）生长培养基、mStrawberry OP9 生长培养基以及 ES/mStrawberry OP9 分化培养基中所用的胎牛血清（FBS）进行预测试至关重要。经过适当测试的血清应能确保 mStrawberry OP9 细胞的正常生长，以及在共培养条件下胚胎干细胞直至分化第5天的正常分化。作为 mStrawberry OP9 细胞的替代或补充，OP9 细胞可在达到汇合度（7.8×104 个细胞/cm2）接种前接受 8000 rads 的照射。对 OP9 细胞进行照射可避免重复传代操作，并几乎完全消除下游实验中残留的污染性旧 OP9 细胞。
通过使用含有CMV启动子调控的mStrawberry基因的慢病毒载体（pRRLsin-CMV载体，UCLA病毒核心实验室）对OP9细胞进行转导，使OP9细胞被改造为表达mStrawberry蛋白，转导时病毒载体浓度为3 µg/mL。
标准的ES/OP9共培养方案包括将ES细胞接种至融合的OP9细胞层上，并在第5天进行重新接种，以减少传代过程中残留的老旧污染性OP9细胞。此外，仅收集悬浮状态的造血细胞用于评估ES细胞分化的子代细胞。然而，由于存在重新接种步骤且仅收获悬浮细胞，可能会遗漏大量正在发育的ES来源造血细胞。当需要表征与基因敲除ES细胞系相关的造血缺陷时，这一问题尤为关键。为克服此局限，本实验室采用了一种改良的共培养方法，即使用表达mStrawberry的OP9细胞。该方法可确保在第5天将所有ES来源的子代细胞转移至后续共培养体系，并在后续实验中收获全部ES来源的子代细胞。这一改进为评估和表征人和小鼠ES细胞系来源的造血前体细胞提供了有力工具。
该ES-mStrawberry OP9共培养模型可重现原始和定型造血过程的各个阶段。在研究造血发育的最早阶段时，许多人使用BL-CFC（类胚体集落形成细胞）检测法，以评估从胚胎干细胞发育而来的血管成血细胞。尽管BL-CFC检测法在研究早期造血发育过程中是一种有用的工具，但mStrawberry-ES共培养系统具有更高的应用价值，因为它不仅可以评估血管成血细胞，还能评估更接近成体的造血细胞谱系。
既往研究采用传统的OP9/ES和EB分化方案表明，可能需要额外因子（例如HoxB4的过表达）才能在体外获得具有长期重建造血功能的造血干细胞。in vitro。尚需进一步研究以评估经分选的mStrawberry阴性ES来源细胞群体中是否含有真正的造血干细胞。

<table><tbody><tr><td colspan="4">OP-9 细胞维持培养基储备成分</td></tr><tr><td>aMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB01</td><td>预测试</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C I</td><td>&lt;u&gt;200nM&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ES/OP-9 细胞分化培养基储备成分</td></tr><tr><td>aMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070</td><td>预测试</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td>200mM</td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr></tbody></table>

改良的 es/op9 共培养方案可更有效地表征造血后代

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

的 体外 将胚胎干细胞向造血细胞命运分化在研究难以获取的细胞群体时具有重要应用价值 体内 并可用于鉴定参与造血过程的最早期基因，而无需处理胚胎致死性问题。ES/OP9 共培养系统最初设计用于生成造血祖细胞，同时避免巨噬细胞的过度产生，因为 OP9 基质细胞系来源于缺乏功能性 M-CSF 的骨硬化症突变小鼠的颅骨。 体外 ES/OP9 共培养系统可用于重现早期造血发育过程。当胚胎干细胞（ES细胞）在OP9基质细胞上培养时，可分化为Flk-1+血管生成母细胞、造血祖细胞，并最终生成成熟且终末分化的细胞谱系。标准的ES/OP9共培养方案包括将ES细胞接种于汇合的OP9细胞层上，并通过周期性重铺板步骤以清除陈旧且具有污染性的OP9细胞。此外，现有方案通常仅评估悬浮状态下的造血细胞，而未针对分化过程中每一天的ES细胞衍生物进行优化分析。然而，由于重铺板操作及仅收集悬浮细胞的方法，可能遗漏大量ES来源的子代细胞及正在发育的造血细胞。当需要表征与基因敲除ES细胞系相关的造血缺陷时，这一问题尤为关键。本文介绍一种改良的ES/mStrawberry OP9共培养方法，可有效去除下游实验中的污染性OP9细胞。该方法实现了对共培养各阶段所有ES来源子代细胞的全面评估，从而获得更直接对应胚胎内所观察到的造血分化模式的造血分化特征。

mStrawberry OP9 细胞可用于共培养体系中所有胚胎干细胞来源后代的完整评估。

改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

体外诱导胚胎干细胞向造血细胞命运分化在研究体内难以获取的细胞群体时具有重要意义。

以下实验的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为多种原始和确定的造血谱系。为了表征所有胚胎干细胞的子代细胞，通过将胚胎干细胞置于融合的、荧光标记的M草莓OP9基质细胞层上，实现小鼠造血细胞的分化。分化的每一天或共培养的每一天均代表造血发育的各个阶段，并在适当的时间点进行收获。通过细胞分选，可将分化后的 ES 细胞后代与 M 草莓 OP 九号基质细胞系分离。该 ES 细胞分化方案可重现体内观察到的原始和确定性造血过程，可用于在无需使用胚胎的情况下，表征与基因敲除 ES 细胞系相关的造血缺陷。您好，欢迎来到加州大学洛杉矶分校约翰逊综合癌症中心 Judith Gassen 博士的实验室。我的名字是 he Alicia Poz。与现有的 ESO 九种共培养方法相比，我今天要向您展示的这项技术的主要优势在于，该方案允许所有第 5 天和第 8 天的细胞传代，并且能够完全分离所有源自 ES 的后代细胞。九种基质细胞 M 草莓 OP 九细胞在 OP 九细胞培养基中培养，该培养基必须每两天更换一次。OP9 细胞应在需要用于共培养前 3 天进行传代。需要注意的是，在维持培养期间，OP9 细胞的密度绝不能超过 90% 融合度。首先用 PBS 洗涤细胞 2 次，然后加入预热的 0.1% 胰蛋白酶 EDTA，作用 5 分钟，待细胞脱落。加入 OP9 细胞培养基，将细胞转移至 50 毫升锥形管中。离心后，在室温下以300 G离心5分钟收集管底细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于新鲜的M草莓OP九细胞培养基中。在共培养实验开始当天，以每平方厘米至少10的4次方个细胞的密度接种细胞。3天前传代的OP九细胞应已达到汇合状态。胚胎干细胞（ES细胞）应根据您特定细胞系的标准操作流程进行培养。用 PBS 洗涤 ES 细胞两次，加入含 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液，于 37°C 孵育 5 分钟。接着，向 ES 细胞中加入共培养分化培养基，并将其转移至 15 毫升锥形管中。于室温下以 400 ×g 离心 5 至 7 分钟，收集 ES 细胞沉淀。去除上清液后，用共培养分化培养基重悬 ES 细胞。使用21号钝端针头获得单细胞悬液。用台盼蓝和血细胞计数板计数细胞。现在从培养箱中取出M草莓的OP九细胞培养瓶。吸去OP九细胞的培养基，并向培养瓶或培养板中加入共培养分化培养基。每平方厘米接种一乘以十的三次方个ES细胞至每瓶M草莓OP九细胞中，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下培养细胞。此为第零天，共培养物应呈现此状态。ES细胞与M草莓OP九细胞共培养开始后第三天。通常可见边界清晰的大型扁平状胚胎干细胞（ES）衍生物细胞簇，部分细胞开始形成漩涡状结构。自共培养开始后第五天，小心移除共培养体系中的培养基，并更换为新鲜的分化培养基。在汇合的M草莓OP9细胞层上，胚胎干细胞应正常分化为血岛样细胞团，表现为成堆的细胞团块。该实验操作最关键的环节是确保在共培养的第五天获得适当的分化。此时，不仅可以在显微镜下，还可以肉眼观察到血红样细胞集落。用 PBS 小心洗涤共培养物两次，用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 在冰上消化细胞，再用 ES 细胞分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，转移至离心管中，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。离心后，弃去上清液并加入新鲜培养基。然后使用21号钝端针头重悬细胞，确保形成单细胞悬液，使用血细胞计数板计数细胞。从第0天开始，胚胎干细胞数量应增加100至150倍。在第8或第9天以及第12天，将重新接种的共培养细胞传代至新的汇合度M草莓OP9细胞层上，再次计数细胞。移除含有造血细胞的培养基，并保留备用。用 PBS 洗涤单层细胞一次，以去除悬浮的造血细胞；保留细胞。在胰蛋白酶消化后，向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，用 ES 细胞分化培养基将贴壁细胞从培养瓶上冲洗下来，并与悬浮液中的造血细胞合并，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟。最后，使用 21 号钝头针重新悬浮细胞并进行细胞计数。此时细胞已准备好用于传代培养或后续实验分析。ES M草莓OP九共培养系统可用于模拟所概述的造血发育过程。以下是共培养时间进程的概览，其中标明了需要将分化的ES后代转移至新的M草莓OP九细胞的时间点。在汇合的M草莓OP九细胞层上，ES细胞的正常分化将产生flick one阳性细胞。在共培养的第5天，人血管母细胞作为内皮细胞系和造血细胞系共同的中胚层前体细胞，应如本图所示呈现为成堆的细胞团。随着共培养的进行，在第6至第7天应出现由两到四个细胞组成的细胞簇，并逐渐发育为更大的细胞簇。到第8至第9天，造血前体细胞已经存在；而终末分化的造血细胞系则在第14天出现。相比之下，若ESL分化不当，则共培养体系在第5天时将产生不呈现世界格局（world pattern）的ES来源后代。缺乏世界格局的细胞表明GIO成胚体形成异常。若共培养中出现成胚体（eblast）形成异常，最终将导致造血谱系分化受阻，应根据本改良的ES OP9共培养方案予以弃用。ES 细胞分化的子代细胞为 mStrawberry 阴性，可通过流式分选从 MStrawberry 阳性细胞中分离。共培养期间任意一天均可收集 OP9 细胞进行评估。此处展示的是一个代表性实验的结果。以往发表的ES OP九种共培养方案仅关注非贴壁悬浮细胞的传代与评估。在本改进方案中，所有胚胎干细胞来源的细胞，包括贴壁和非贴壁细胞，均可进行传代并用于评估。这能够提高造血细胞的产量，有助于鉴定稀有细胞群体，并实现对所有胚胎干细胞子代（包括造血和非造血细胞）的全面表征。

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科研

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Biology

生物学

修改ES / OP9共培养协议，提供增强造血后代的表征

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本视频介绍了将白血病细胞与骨髓基质细胞进行长期二维共培养的技术，用于研究白血病细胞与骨髓微环境之间的相互作用。该二维共培养模型利用急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞或成骨细胞，以观察后者对肿瘤细胞表型的影响。本研究将有助于揭示在化疗药物作用下，骨髓微环境支持白血病细胞存活的相关机制。...

白血病细胞与骨髓基质细胞的二维共培养：一种获取白血病细胞亚群的方法

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro...

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

本文描述了永生化多能耳源性前体细胞（iMOP）的培养维持及耳源性分化现有方案。重点介绍了可指示向感觉上皮和螺旋神经节神经元（SGN）分化的培养条件与分子标志物。...

启动永生化多能耳源性祖细胞的分化

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

本方案描述了利用培养的主动脉-性腺-中肾组织进行表达分析、检测培养物和脾脏中的集落形成单位，以及长期重建造血，以确定调控因子和信号通路对造血干细胞发育的影响。该系统已被证明是研究造血干细胞生物学特性与功能的有效体系。...

主动脉-性腺-中肾区外植体培养系统在发育性造血中的应用

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本方案概述了一种诱导来源于患者骨髓和外周血单个核细胞的人类造血干细胞和祖细胞分化的实验流程。该检测采用支持红系和髓系谱系定向的半固体培养基，并结合标准化的定量指标，对集落进行可重复的分类，用于临床前药物表征。...

适用于患者来源的骨髓和外周血单个核细胞的集落形成单位检测

学习利用mStrawberry OP9共培养系统将小鼠胚胎干细胞分化为造血谱系的方法。该技术可完整评估所有ES衍生后代，用于研究造血发育及相关缺陷，无需使用胚胎。

改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

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