改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

以下实验的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为多种原始和确定的造血谱系。为了鉴定所有胚胎干细胞的后代，通过将胚胎干细胞置于融合的、荧光标记的M草莓OP9基质细胞层上，实现小鼠造血细胞的分化。分化的每一天或共培养的每一天均代表造血发育的各个阶段，并在适当收获时间进行分析。

通过细胞分选，可将分化后的胚胎干细胞（ES细胞）后代与M草莓OP九基质细胞系分离。该ES细胞分化方案可重现体内观察到的原始和确定性造血过程，可用于表征与基因敲除ES细胞系相关的造血缺陷，而无需使用胚胎。您好，欢迎来到加州大学洛杉矶分校约翰逊综合癌症中心Judith Gassen博士的实验室。

我的名字是Alicia Poz。与现有的ESO九种共培养方法相比，我今天要展示的这项技术的主要优势在于，该方法允许所有第五天和第八天的细胞传代，并且能够将所有源自ES的后代细胞与九种基质细胞完全分离。M草莓OP九细胞在OP九细胞培养基中培养，该培养基必须每两天更换一次。

OP9 细胞应在共培养所需时间的前三天进行传代。需要注意的是，在维持培养期间，OP9 细胞的密度绝不能超过 90% 融合度。首先用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入预热的含 0.1% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液，作用 5 分钟，待细胞脱落。加入 OP9 细胞培养基，将细胞转移至 50 毫升锥形管中。

离心后，在室温下以300 ×g离心5分钟收集管底细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于新鲜的M草莓OP9细胞培养基中。在共培养实验开始当天，以每平方厘米至少10⁴个细胞的密度接种细胞。3天前传代的OP9细胞应已达到汇合状态。胚胎干细胞（ES细胞）应根据您特定细胞系的标准操作流程进行培养。

用 PBS 洗涤 ES 细胞两次，加入含 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液，于 37°C 孵育 5 分钟。接着，向 ES 细胞中加入共培养分化培养基，并将其转移至 15 毫升锥形管中。在室温下以 400 ×g 离心 5 至 7 分钟，使 ES 细胞沉淀。

吸去上清液后，用共培养分化培养基重悬 ES 细胞。使用 21 号钝端针头制备单细胞悬液。用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数。

现在从培养箱中取出 M 草莓的锥形瓶。取出 OP 九细胞，弃去培养基，并向锥形瓶培养板中加入共培养分化培养基。

每平方厘米接种一乘以十的三次方个ES细胞至每瓶M草莓OP九细胞中，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下培养细胞。此为第零天，共培养物应呈现此状态。ES细胞与M草莓OP九细胞共培养开始后第三天。

通常可见边界清晰的大型扁平状胚胎干细胞（ES）衍生细胞簇，部分细胞开始形成漩涡状结构。在共培养开始后的第五天，小心移除共培养体系中的培养基，并更换为新鲜的分化培养基。胚胎干细胞在汇合的M草莓OP9细胞层上正常分化应形成血岛样结构，表现为成堆的细胞团。

该操作最关键的一步是确保在共培养的第五天获得适当的分化。此时，不仅可以在显微镜下，还可以用肉眼观察到血岛样细胞集落。用 PBS 小心清洗共培养物两次，用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 在冰上消化细胞，用 ES 细胞分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，转移至离心管中，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟收集细胞。

离心后，弃去上清液并加入新鲜培养基。然后使用21号钝端针头重悬细胞，确保形成单细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞。从第0天重新接种的胚胎干细胞至第8或第9天，细胞数量应增加100至150倍。在第12天再次计数细胞。吸出含有造血细胞的培养基并保留。

用 PBS 洗涤单层细胞一次，以去除悬浮的造血细胞；保留悬浮细胞。在胰蛋白酶消化贴壁细胞后，向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，用 ES 细胞分化培养基将细胞从培养瓶上冲洗下来，并与之前保留的悬浮造血细胞合并，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟。最后，使用 21 号钝头针重新悬浮细胞并进行细胞计数。此时细胞已准备好用于重新接种或后续实验分析。

ES M草莓OP九共培养系统可用于模拟所概述的造血发育过程。以下是共培养时间进程的概览，其中标明了需将分化的ES后代转移至新的M草莓OP九细胞的时间点。在M草莓OP九细胞融合层上对ES细胞进行适当分化，将产生flick one阳性细胞。

在共培养的第五天，人血管母细胞作为内皮细胞系和造血细胞系共同的中胚层前体细胞，应如本图所示呈现为成堆的细胞团。随着共培养的进行，在第六至第七天应出现由两到四个细胞组成的细胞簇，并逐渐发育为更大的细胞簇。到第八至第九天，造血前体细胞已经存在；而终末分化的造血细胞系则在第14天出现。

相比之下，若ESL分化不当，则共培养体系在第5天时将产生不呈现世界格局（world pattern）的ES来源后代。缺乏世界格局的细胞表明GIO成胚结构形成异常。若共培养中出现成胚结构（eblast）形成异常，最终将导致造血谱系分化受阻，此类培养物应根据本改良的ES OP9共培养方案予以弃用。

ES 细胞分化的子代细胞为 mStrawberry 阴性，可通过流式分选从 MStrawberry 阳性细胞中分离。共培养期间任意一天均可收获 OP9 细胞进行评估。此处展示的是一个代表性实验的结果。

既往发表的ES OP9共培养方案仅关注非贴壁漂浮细胞的传代与评估。在本改良方案中，所有来源于胚胎干细胞的细胞，包括贴壁和非贴壁细胞，均可进行传代并被评估。这能够提高造血细胞的产量，有助于鉴定稀有细胞亚群，并实现对所有胚胎干细胞后代（包括造血和非造血细胞）的全面表征。