改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

以下实验的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为多种原始和确定的造血谱系。为了表征所有胚胎干细胞的子代细胞，通过将胚胎干细胞置于融合的、荧光标记的M草莓OP9基质细胞层上，实现小鼠造血细胞的分化。分化的每一天或共培养的每一天均代表造血发育的各个阶段，并在适当的时间点进行收获。

通过细胞分选，可将分化后的 ES 细胞后代与 M 草莓 OP 九号基质细胞系分离。该 ES 细胞分化方案可重现体内观察到的原始和确定性造血过程，可用于在无需使用胚胎的情况下，表征与基因敲除 ES 细胞系相关的造血缺陷。您好，欢迎来到加州大学洛杉矶分校约翰逊综合癌症中心 Judith Gassen 博士的实验室。

我的名字是 he Alicia Poz。与现有的 ESO 九种共培养方法相比，我今天要向您展示的这项技术的主要优势在于，该方案允许所有第 5 天和第 8 天的细胞传代，并且能够完全分离所有源自 ES 的后代细胞。九种基质细胞 M 草莓 OP 九细胞在 OP 九细胞培养基中培养，该培养基必须每两天更换一次。

OP9 细胞应在需要用于共培养前 3 天进行传代。需要注意的是，在维持培养期间，OP9 细胞的密度绝不能超过 90% 融合度。首先用 PBS 洗涤细胞 2 次，然后加入预热的 0.1% 胰蛋白酶 EDTA，作用 5 分钟，待细胞脱落。加入 OP9 细胞培养基，将细胞转移至 50 毫升锥形管中。

离心后，在室温下以300 G离心5分钟收集管底细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于新鲜的M草莓OP九细胞培养基中。在共培养实验开始当天，以每平方厘米至少10的4次方个细胞的密度接种细胞。3天前传代的OP九细胞应已达到汇合状态。胚胎干细胞（ES细胞）应根据您特定细胞系的标准操作流程进行培养。

用 PBS 洗涤 ES 细胞两次，加入含 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液，于 37°C 孵育 5 分钟。接着，向 ES 细胞中加入共培养分化培养基，并将其转移至 15 毫升锥形管中。于室温下以 400 ×g 离心 5 至 7 分钟，收集 ES 细胞沉淀。

去除上清液后，用共培养分化培养基重悬 ES 细胞。使用21号钝端针头获得单细胞悬液。用台盼蓝和血细胞计数板计数细胞。

现在从培养箱中取出M草莓的OP九细胞培养瓶。吸去OP九细胞的培养基，并向培养瓶或培养板中加入共培养分化培养基。

每平方厘米接种一乘以十的三次方个ES细胞至每瓶M草莓OP九细胞中，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下培养细胞。此为第零天，共培养物应呈现此状态。ES细胞与M草莓OP九细胞共培养开始后第三天。

通常可见边界清晰的大型扁平状胚胎干细胞（ES）衍生物细胞簇，部分细胞开始形成漩涡状结构。自共培养开始后第五天，小心移除共培养体系中的培养基，并更换为新鲜的分化培养基。在汇合的M草莓OP9细胞层上，胚胎干细胞应正常分化为血岛样细胞团，表现为成堆的细胞团块。

该实验操作最关键的环节是确保在共培养的第五天获得适当的分化。此时，不仅可以在显微镜下，还可以肉眼观察到血红样细胞集落。用 PBS 小心洗涤共培养物两次，用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 在冰上消化细胞，再用 ES 细胞分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，转移至离心管中，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。

离心后，弃去上清液并加入新鲜培养基。然后使用21号钝端针头重悬细胞，确保形成单细胞悬液，使用血细胞计数板计数细胞。从第0天开始，胚胎干细胞数量应增加100至150倍。在第8或第9天以及第12天，将重新接种的共培养细胞传代至新的汇合度M草莓OP9细胞层上，再次计数细胞。移除含有造血细胞的培养基，并保留备用。

用 PBS 洗涤单层细胞一次，以去除悬浮的造血细胞；保留细胞。在胰蛋白酶消化后，向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，用 ES 细胞分化培养基将贴壁细胞从培养瓶上冲洗下来，并与悬浮液中的造血细胞合并，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟。最后，使用 21 号钝头针重新悬浮细胞并进行细胞计数。此时细胞已准备好用于传代培养或后续实验分析。

ES M草莓OP九共培养系统可用于模拟所概述的造血发育过程。以下是共培养时间进程的概览，其中标明了需要将分化的ES后代转移至新的M草莓OP九细胞的时间点。在汇合的M草莓OP九细胞层上，ES细胞的正常分化将产生flick one阳性细胞。

在共培养的第5天，人血管母细胞作为内皮细胞系和造血细胞系共同的中胚层前体细胞，应如本图所示呈现为成堆的细胞团。随着共培养的进行，在第6至第7天应出现由两到四个细胞组成的细胞簇，并逐渐发育为更大的细胞簇。到第8至第9天，造血前体细胞已经存在；而终末分化的造血细胞系则在第14天出现。

相比之下，若ESL分化不当，则共培养体系在第5天时将产生不呈现世界格局（world pattern）的ES来源后代。缺乏世界格局的细胞表明GIO成胚体形成异常。若共培养中出现成胚体（eblast）形成异常，最终将导致造血谱系分化受阻，应根据本改良的ES OP9共培养方案予以弃用。

ES 细胞分化的子代细胞为 mStrawberry 阴性，可通过流式分选从 MStrawberry 阳性细胞中分离。共培养期间任意一天均可收集 OP9 细胞进行评估。此处展示的是一个代表性实验的结果。

以往发表的ES OP九种共培养方案仅关注非贴壁悬浮细胞的传代与评估。在本改进方案中，所有胚胎干细胞来源的细胞，包括贴壁和非贴壁细胞，均可进行传代并用于评估。这能够提高造血细胞的产量，有助于鉴定稀有细胞群体，并实现对所有胚胎干细胞子代（包括造血和非造血细胞）的全面表征。