Name: 解剖鼠标眼的视网膜色素上皮的全山 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 学习小鼠眼球解剖技术以获取视网膜色素上皮全标本，用于研究视网膜发育与疾病。该方法为神经科学与眼科学研究提供高质量组织样本制备方案。

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本工作由环境卫生科学国家研究所 [K22ES012264 至 A.J.R.B.] 和美国癌症协会机构研究拨款 [ACS-IRG-00-173-04] 试点项目资助 [授予 A.J.R.B.]。我们还感谢 Bishop 实验室成员对稿件的审阅以及对视频提出的建议，特别感谢 Adam Brown 提供了反面示例。感谢 Greehey 儿童癌症研究所的 Donald McEwen 博士允许我们使用其解剖显微镜/摄像系统拍摄解剖视频。感谢 Corte Instruments 的 Daron Brown 对我们的显微解剖工具进行修磨和维护。

1. 去除眼球外部的多余组织
<ol>
	<li>将1× PBS倒入35 mm培养皿的皿盖中，液面应略低于皿盖边缘。</li>
	<li>使用直头镊子将眼球从储存管转移至35 mm培养皿中。眼球浸入PBS中有两个原因：1. 多余组织会“漂浮”离开眼球，便于观察和清除；2. 在解剖过程中，眼球在悬浮状态下能自然维持其球形结构，使操作顺应其形态而非对抗。</li>
	<li>使用两把弯头镊子（45°和15°），尽可能轻柔地去除肌肉和结缔组织，撕扯方向应逆着组织纹理（即朝向角膜方向）。部分结缔组织可能仍会残留。操作中应尽量减少对眼球的挤压。</li>
	<li>将15°镊子换为弹簧剪。用45°镊子固定眼球，同时使用弹簧剪剪除残留的肌肉和结缔组织，以及视神经。*提示：用剪刀外侧边缘将组织逆纹理方向（朝向角膜-巩膜交界处）推挤，然后修剪。重复操作直至眼球上所有多余组织被完全清除。</li>
</ol>
2. 去除角膜和晶状体
<ol>
	<li>角膜朝上，用45°镊子在角膜中央夹起一个小褶皱。</li>
	<li>使用弹簧剪在褶皱基部做一小切口，然后松开褶皱。</li>
	<li>用镊子固定眼球，将剪刀的下刃垂直插入切口，并向角膜-巩膜交界处方向剪开。尽量使下剪刀刃位于虹膜下方，以同时剪开角膜和虹膜。注意不要一直剪到角膜-巩膜交界处。保持剪刀插入眼内。</li>
	<li>用45°镊子小心旋转眼球，使剪刀与角膜-巩膜交界平行，进行小切口。缓慢旋转眼球360°，沿周围连续做小切口。同样，尽量保持弹簧剪的下刃在虹膜下方，以同时切开虹膜和角膜。将虹膜和角膜从眼球其余部分上掀起并弃去。</li>
	<li>将眼球侧置，轻轻按压眼球后半部，使晶状体挤出，弃去晶状体。剩余的眼杯内壁由神经视网膜衬覆，应呈现光滑且不透明的外观。</li>
</ol>
3. 将所得的眼杯分为四等份，形成一个具有4个“花瓣”的花状结构
<ol>
	<li>应将眼球放置成使其杯口与身体垂直。使用45°镊子固定并调整眼杯的位置。</li>
	<li>将弹簧剪刀持于身前，使其与身体垂直，将剪刀的下刃插入打开的眼杯顶部边缘。使用45°镊子仔细对齐眼杯，以便从角膜-巩膜分界处向视神经乳头进行一次单一、笔直的切割。所有切割均应垂直于角膜-巩膜分界，除非另有说明，切割应尽可能接近视神经乳头，但不得切入其中。</li>
	<li>将眼杯旋转180°，同时保持其与身体的垂直关系。采用步骤3.2中的技术进行第二次垂直切割。</li>
	<li>继续旋转眼杯，并重复步骤3.2中所述技术，再进行两次切割。四次切割应尽可能相互间隔约90°。需注意眼球并非完美的球形，因此存在一定变异。</li>
</ol>
4. 将四个“花瓣”中的每一个均切成两半，形成一个具有八个花瓣的花状结构
<ol>
	<li>将四等分的巩膜杯从35 mm培养皿转移至干净的载玻片上。将巩膜杯朝上放置，用45°角的镊子从其下方轻轻托起，小心地将其从液体中取出，并放置在干净的载玻片上。</li>
	<li>使用两对角镊子，轻轻展开眼球，使神经视网膜朝上。切勿移除神经视网膜——它有助于维持眼球的部分球形结构，避免操作时对抗其自然形态。此外，在后续操作中，它还能保护视网膜色素上皮（RPE）免受意外损伤。</li>
	<li>旋转载玻片，使其中一个瓣片与身体方向垂直。</li>
	<li>使用15°角的镊子，轻轻夹住瓣片的角部。该角部应为角膜组织，而非神经视网膜或RPE。轻柔地提起角部，使其保持原有的曲率。</li>
	<li>将弹簧剪刀的下部刀片插入瓣片与载玻片之间。调整剪刀位置，使其能够从角膜-巩膜交界处向视神经乳头方向进行一次笔直、垂直的切割。尽可能靠近视神经乳头处切割，但切勿切入其中。松开瓣片，使其平铺在载玻片上。</li>
	<li>将载玻片旋转90°，使下一个瓣片与身体方向垂直。重复步骤4.5。</li>
	<li>再重复两次步骤4.5和4.6。最终结构应呈现为一个八瓣花状形态。</li>
</ol>
5. 去除神经视网膜
<ol>
	<li>用移液器将 100–200 μL 的 1× PBS 加入样本上，以防止在剥离神经视网膜时其粘附于视网膜色素上皮（RPE）。</li>
	<li>通常情况下，神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）的连接较为疏松。然而，仅去除神经视网膜而不损伤 RPE 需要一定的练习和技巧。用一对弯头镊子轻轻夹住神经视网膜的一瓣，同时用另一对弯头镊子固定（压住）眼球其余部分以保持稳定，然后将神经视网膜从眼球其余部分轻轻拉离。重复此操作，直至完全去除整个神经视网膜。*提示：可将 15° 镊子的尖端插入视神经乳头以固定眼球，再用 45° 镊子从神经视网膜下方扫入并将其掀起移除。通常建议从视神经乳头向角膜-巩膜交界处方向进行剥离。务必清除虹膜残留的松散组织，因为虹膜具有较强黏性，否则可能粘附于 RPE 上。</li>
	<li>用 1× PBS 清洗样本。向样本中加入 100–200 μL 的 1× PBS，随后吸出并弃去。根据需要重复此步骤，以去除灰尘和碎片。</li>
</ol>
6. 将样本装载到载玻片上
<ol>
	<li>用移液器吸取80-90 μL的90%甘油，滴加到新载玻片上，呈矩形。使用移液器枪头的侧面将甘油涂抹成均匀的矩形薄层。（此操作适用于在同一张载玻片上封片两个RPE样本。）</li>
	<li>将15°镊子的下臂插入样本下方，轻轻将样本从解剖载玻片上提起。</li>
	<li>缓慢将样本放入甘油中。在将镊子从样本下方抽出时，轻轻晃动镊子。</li>
	<li>对另一个样本重复步骤6.1–6.3。</li>
	<li>旋转载玻片，使其长边与身体垂直。将盖玻片以45°角接触载玻片，并向甘油涂抹区域移动，直至两者接触。保持盖玻片与载玻片之间的接触，缓慢将盖玻片从甘油涂抹区域移向载玻片边缘。使载玻片和盖玻片的长边对齐并保持平行。用拇指和食指捏住盖玻片的两个角。</li>
	<li>用另一只手拿起15°镊子，将盖玻片上端（自由）边缘托在镊子弯曲处。非常缓慢地降低盖玻片。当盖玻片接触到甘油时，停止动作并等待甘油扩散。重复此缓慢下降与等待过程，直至RPE整体封片完全被覆盖。此操作旨在防止高黏度甘油包裹气泡。切勿按压盖玻片——甘油会从其下方挤出，导致粘附性极差。</li>
	<li>用透明指甲油沿盖玻片与载玻片接触的边缘进行封固。</li>
	<li>将载玻片置于空支架上方，使其自然干燥。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
该操作的结果应得到一个形似花朵且具有较好对称性的结构。
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="自旋电子学示意图：磁畴可视化，图中显示磁化方向。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 野生型C67Bl/6J小鼠的完整眼底视网膜色素上皮（RPE）。 来自黑色或野鼠色动物的RPE应呈深棕色，表面应光滑。花瓣状结构的表面出现轻微起伏属正常现象。由于RPE及下方脉络膜色素密度存在个体差异，任何给定样本的色素沉着程度可能略有不同。白色箭头指示色素减退的“通道”——此现象正常，由眼球下方血管结构所致。蓝色箭头指示RPE及下方脉络膜的物理性损伤。
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="薄层色谱结果；硅胶板上的径向分离图谱显示化合物分布情况。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 来自一只稀释型小鼠的完整眼底色素上皮组织。 从稀释型动物获取的标本颜色可从近乎透明到咖啡奶色不等，且单个标本内部通常存在色素分布差异，此处以黑色圆圈标示。总体而言，从较年轻动物获取的RPE颜色较浅，而从较年长动物获取的RPE颜色较深。黑色箭头指示部分下方的脉络膜血管结构，表现为色素减退区域。
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="荧光显微镜图像；50μm尺度下的细胞结构比较；研究分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 鬼笔环肽染色可用于检测视网膜色素上皮（RPE）的物理损伤。鬼笔环肽染色可清晰勾勒出细胞膜，显示上皮细胞的六边形形态。（A）来自黑鼠的示例。（B）来自稀释毛色小鼠的示例。
<img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="植物结构显微图像对比图，详细展示细胞排列与形态。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 一只稀释型小鼠中解剖不良的视网膜色素上皮（RPE）。 (A) 括号标示出过宽的角膜边缘，可能导致皱褶或折叠。在黑色圆圈内可见大量未从眼球后部清除的多余组织。由于样本来自一只稀释型动物，这些组织尤为明显。左下角的瓣片部分发生折叠。(B) 该整体装片呈现出风车状外观。黑色箭头指示了部分已做的切口。从角膜-巩膜分界处朝向视神经乳头的许多切口未与直径对齐。(C) 黑色箭头指示切口的正确制作方式：应与直径对齐，并垂直于切线方向。

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

视网膜色素上皮（RPE）是pun检测的位点，该检测是一种用于检测同源定向修复的活体in vivo实验方法。pun检测已被用于研究不同DNA损伤1,2以及DNA损伤信号传导和修复相关基因3,4,5对同源定向修复频率的影响。该检测方法具有高度敏感性，可检测RPE上单个细胞水平的修复事件1，并能检测发育过程中同源定向修复事件在时间上的差异6。小鼠眼球从视神经开始呈放射状向外发育7，因此，修复事件与视神经乳头之间的相对距离可反映其发生的发育时间。
视网膜色素上皮（RPE）也受到研究视网膜发育或视网膜疾病学者的关注。尽管RPE细胞可以进行培养，但该过程存在显著局限性。成年RPE细胞为终末分化细胞，不再进行有丝分裂。7 且可预见地无法良好增殖 体外此外，那些能够生长的培养物也表现出多种改变，包括但不限于色素沉着、形态以及细胞连接的变化。8...

<table><tbody><tr><td>直镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>尖端：0.08 × 0.04 mm，材质：INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0; 镊子</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>尖端：0.05 × 0.01 mm，材质：INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0; &quot;上弯&quot; 镊子</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>尖端：0.1 × 0.06 mm，材质：INOX</td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>组合式尖端宽度 0.3 mm，刃口长度 3 mm，材质：不锈钢</td></tr><tr><td>双目解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>使用反射光源</td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

视网膜色素上皮（RPE）位于哺乳动物眼球后部，紧邻含有感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）的神经视网膜下方。RPE由一层单层的色素性立方细胞构成，与其上方的神经视网膜紧密相连。这种密切关联使RPE成为研究视网膜疾病的研究人员高度关注的对象。RPE也是某些眼部疾病的发病部位 体内 同源定向DNA修复检测，该 p未 检测。由于小鼠眼球尺寸较小（直径约3.5 mm）且呈球形，解剖难度较大。本文详细演示了一种解剖小鼠眼球以制备视网膜色素上皮（RPE）整体装片的实验步骤。在此方法中，我们展示了如何利用而非对抗眼球的球形结构进行操作。简要而言，首先去除眼球后部的结缔组织、肌肉和视神经；随后移除角膜和晶状体；接着进行若干关键切口，使剩余组织显著展平；最后轻柔剥离神经视网膜，暴露出完整保留的RPE，后者仍附着于脉络膜和巩膜之上。该整体装片可用于后续 p未 用于RPE组织的检测、免疫组织化学或免疫荧光评估。

小鼠眼球解剖的正式演示，最终获得视网膜色素上皮的完整铺片。

视网膜色素上皮（RPE）位于哺乳动物眼球后部，紧邻神经视网膜下方，而神经视网膜中含有感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）。

我叫Allison Clavon，是德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校格林儿童癌症研究所Alex Bishop博士的研究助理。今天我将演示如何解剖啮齿类动物的眼球，以获取完整的视网膜色素上皮层。该组织可用于研究视网膜发育及疾病，同时也是体内同源定向DNA修复实验的检测位点。现在我们开始。这是一个已准备好进行解剖的眼球。首先，让我们观察一下在操作过程中将用作解剖标志的结构。这是来自一只稀释动物的眼睛。此处为眼球后部对侧的视神经。这是角膜。虹膜透过角膜可见。眼球后部的白色区域是巩膜。因此，该区域被称为角膜巩膜分界。解剖的第一步是去除多余的组织，例如肌肉结缔组织和视神经。接下来，必须切除角膜，进行环形切口。此时，晶状体可以被挤出，从而形成一个中空的眼杯。接下来，从角膜-巩膜分界处向视神经乳头方向做四个切口。所得结构形似一朵具有四个花瓣的花。随后将这四个瓣片各自从中间切开，形成一个类似八瓣花的结构。在此阶段，由于材料的球面特性，I 形区域可能会在某些部位发生弯曲。为解决这一问题并获得更平整的孔座，可在弯曲处稍加延伸的位置进行八处较短的切割。在实验工作台上，您需要准备多种材料，包括100或200 μL移液器及配套枪头、一个X-P-B-S-A 35毫米培养皿载玻片和盖玻片、90%甘油和透明指甲油用于制片，一个用于干燥载玻片的支架、一盒Kim擦拭纸以及一个腰部高度的废弃物容器。除这些常用材料外，您还需要一套专用的显微解剖工具，包括直头镊子，以及45度角弯头镊子，用于在解剖过程中夹持、旋转和操作眼球。此外，15度角的镊子头部向上弯曲，也用于眼球的夹持与操作。最后，您需要一把弹簧剪刀。使用弹簧剪刀而非传统样式的剪刀非常重要。在开始解剖前，进行此解剖操作时，请调整好座椅高度，确保您坐直时眼睛与目镜处于同一水平位置。在显微镜前弯腰驼背会导致肩部和背部疼痛，并影响解剖操作的质量。开始时，将一份XPBS倒入35毫米培养皿的皿盖中，然后将准备解剖的眼球转移至皿中。这是一只野生型 C57 黑鼠的眼睛。你可以看到它非常小，直径约 3.5 毫米。巩膜的不透明性使其呈现蓝青色。解剖的第一步是去除眼球周围的所有多余组织，例如肌肉结缔组织和视神经。此处我左手持45度镊子，右手持15度镊子。你可以用一对镊子固定眼球，同时用另一对镊子牵拉并分离组织。当一大块组织脱落时，请小心地将镊子在无尘纸上擦拭。注意不要压碎或刺穿眼球。以悬浮方式操作解剖的一个优点是，可以清楚地观察到结缔组织从眼球上漂离。最终，您将到达一个无法再使用镊子去除更多组织的阶段。此时，将15度角的镊子更换为弹簧剪刀，使用弹簧剪刀剪断视神经。使用刀片的外侧边缘将组织向前推至角膜巩膜分界处。然后修剪并在无尘纸上轻轻擦拭剪刀。让我们再看一遍。当组织翘起时，用剪刀的外侧边缘将组织向前推至角膜与巩膜交界处。修剪后，继续用剪刀的钝边将组织碎片向前推，然后将其剪除，直至所有多余组织被清除。眼球上通常有两条坚韧的组织带。第一个附着点位于角膜与巩膜交界处，第二个附着点正在被修剪。此处大约位于角膜与巩膜交界处和视神经乳头之间的中点位置。解剖的下一步是移除角膜和晶状体。使用45度角的镊子在角膜大约中点处夹起一个瓣膜。然后使用弹簧剪在瓣膜基部做一个小切口。将剪刀的下刃插入虹膜下方的切口内。向角膜巩膜分界处剪切，但不要剪入其中。现在，缓慢旋转眼球360度，沿周围进行小切口。尽量将剪刀保持在虹膜下方，同时剪切角膜和虹膜。要像我在这里演示的这样轻松完成操作，需要大量的练习。角膜移除后，将眼球侧放，轻轻按压眼球外侧，使晶状体脱出。接下来剩余的结构将呈杯状。必须将眼球切成四等份。操作时，将眼球侧放，插入弹簧剪刀的下部刀片，沿纵向剪开，但不要完全剪至视神经乳头处。进行此操作时，保持手臂位于身体两侧，将剪刀置于身前，大致与身体和切口垂直。在与第一处切口正对的位置进行第二处切口。仔细对齐位置，以确保切口平滑。多次切割可能会导致边缘不平整，但如果仔细对齐，这些切口并不明显。注意观察我是如何顺应眼球的球形结构进行操作的，而不是与之对抗，因为眼球在 PBS 中能保持其正常形态。将眼球用 45 度角的镊子轻轻托起，从 PBS 中取出，后续的解剖操作将在载玻片上进行。将眼球置于一张新的载玻片上。使用两对弯头镊子，小心地将眼球展开。注意在眼球边缘有一小部分角膜和虹膜，可用于操作时夹持。接下来，需要将四个瓣膜中的每一个均切成两半。旋转眼球，使其中一个瓣膜与身体垂直。用15度角的镊子夹住瓣膜的角部。轻轻抬起后，从角膜巩膜分界处向视神经乳头进行切割。这些切口应垂直于切线方向。切线是指垂直于直径的一条直线。因此，你的切口应与眼球的直径对齐。现在旋转载玻片，使下一个花瓣状切口与你的身体垂直，并重复上述操作。抓住花瓣状切口的一角。轻轻提起并切割，重复操作，直至将四个大瓣均切成两半。其中白色的物质是神经视网膜，直接覆盖在视网膜色素上皮（RPE）之上。神经视网膜可以保护视网膜色素上皮（RPE），因此在完成所有切口之前应保持其完整。注意观察花瓣状切口略呈弯曲状，无需强行拉直。请耐心对齐，以确保完成一次良好的单次切割。由于眼球呈圆形，容易发生弯曲，为防止这种弯曲，可进行八次短切口。每个花瓣上各切一次。采用与前一轮四次切割相同的基本策略。将花瓣的角部掀起后进行切割，但此次仅切割花瓣长度的大约一半。完成所有切口后，即可移除神经视网膜。接下来，我向样本中加入几滴1×PBS。请注意，不要让视网膜色素上皮（RPE）变干。神经视网膜应仅与下方的视网膜色素上皮层松散连接。可见其可轻易分离。然而，它通常仍会附着于角膜巩膜分界处，该位置在眼球内部为一条凹凸不平的脊状结构，称为睫状体。可用15度镊子的尖端插入视神经头以固定样本，同时剥离神经视网膜。睫状体标志着RPE的边缘，即已脱落的深色素组织。此处为虹膜，而非RPE。我建议尽可能多地去除虹膜，因为虹膜具有很强的黏性，如果神经视网膜松散或有残留物附着在视网膜色素上皮（RPE）上，虹膜可能会折叠并黏附到RPE上。可能出现了以下两种情况之一：要么眼球固定不当，例如固定时间过长或过短，要么在解剖前储存时间过久。此处我正在揭示的踏板尚未设置快捷键。您可以看到，该踏板位于视网膜色素上皮（RPE）边缘约三分之一处。因此，建议设置八个快捷键。将所有神经视网膜完全去除后，使用移液器以100至200微升的PBS反复冲洗RPE数次，直至所有灰尘和碎片被清除。用移液器将80至90微升的90%甘油以矩形形状滴加到一张新的载玻片上。注意，此甘油体积适用于22×50毫米的盖玻片，应根据实际情况相应调整。对于其他尺寸的盖玻片，使用移液器吸头将甘油铺开。注意不要将气泡混入甘油中。如果产生气泡，将其拖至边缘使其破裂。将15度镊子的下臂滑入RPE下方，小心抬起，缓慢将RPE放入甘油中。RPE会漂浮在甘油表面，可能略微卷曲或扭曲。使用镊子将RPE展平，并将甘油拖过RPE表面。如果产生任何气泡，在操作时将其移至边缘处使其破裂。以约45度角持住盖玻片，接触甘油边缘。然后将其移向载玻片的边缘。用拇指和食指捏住盖玻片底部，用15度镊子托住其对侧边缘。一旦接触到载玻片，即缓慢地将盖玻片放下。当接触到视网膜色素上皮（RPE）时，停止继续下压，使甘油能够迁移，并缓慢降低盖玻片。如果盖玻片下降过快，此处载玻片中会混入气泡。我将缓慢降低盖玻片，当其接触到 RPE 时，让甘油自行迁移。当快速松开盖玻片时，可以看到有气泡混入。使用足量的透明指甲油将盖玻片边缘与载玻片完全密封，确保环绕整个周边。这是一只C57黑鼠典型的视网膜色素上皮（RPE）。如图所示，观察到下方的脉络膜血管是正常的。同时，观察到色素沉着存在一定的个体差异也是正常的，例如某些区域色素较少。 然而，此类清晰斑点很可能是由于视网膜色素上皮（RPE）及下方脉络膜的物理损伤所致。由于眼球的脉络膜也具有色素，若脉络膜保持完整，即使黑色的RPE受损也可能难以察觉。这是来自一只稀释型小鼠的典型视网膜色素上皮（RPE）。如图所示，您将能够观察到血管结构，并且色素沉着会存在一些变异，例如较深和较浅的斑块。然而，在稀释型RPE上几乎无法观察到损伤。这些小斑块是损伤还是色素沉着的正常变异？我建议进行封片和染色来回答这个问题。这将帮助你判断是否在操作过程中对样本处理得过于粗暴。染色清晰地勾勒出细胞膜，使得受损区域一目了然，但实际上，视网膜色素上皮（RPE）具有较强的韧性，若通过角膜操作眼球，通常不会造成损伤。下图是一个存在多种问题的全层铺片，其中最轻微的问题是保留了过宽的角膜边缘，这可能导致组织皱褶和弯曲。你可以看到眼后部仍残留大量无关组织。该瓣膜部分折叠，此处可见视网膜色素上皮层（RPE）已部分撕裂。另一个问题是，该眼球呈现出风车样外观。此处我已标出切口的角度。然而，它们本应如此。请记住，你的切口应垂直于切线，并与直径对齐。我刚刚演示了如何解剖小鼠眼球以制备视网膜色素上皮的全层铺片。上皮组织，最重要的是保持良好的姿势，但要尽量放松。希望本视频对您有所帮助，并祝您今后的实验一切顺利。

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