小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

我叫Allison Clavon，是德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校格林儿童癌症研究所Alex Bishop博士的研究助理。今天我将演示如何解剖啮齿类动物的眼球，以获取完整的视网膜色素上皮层。

该组织可用于研究视网膜发育及疾病，同时也是体内同源定向DNA修复实验的检测位点。现在我们开始。这是一个已准备好进行解剖的眼球。

首先，让我们观察一下在操作过程中将用作解剖标志的结构。这是来自一只稀释动物的眼睛。此处为眼球后部对侧的视神经。

这是角膜。虹膜透过角膜可见。眼球后部的白色区域是巩膜。

因此，该区域被称为角膜巩膜分界。解剖的第一步是去除多余的组织，例如肌肉结缔组织和视神经。接下来，必须切除角膜，进行环形切口。

此时，晶状体可以被挤出，从而形成一个中空的眼杯。接下来，从角膜-巩膜分界处向视神经乳头方向做四个切口。所得结构形似一朵具有四个花瓣的花。

随后将这四个瓣片各自从中间切开，形成一个类似八瓣花的结构。在此阶段，由于材料的球面特性，I 形区域可能会在某些部位发生弯曲。为解决这一问题并获得更平整的孔座，可在弯曲处稍加延伸的位置进行八处较短的切割。

在实验工作台上，您需要准备多种材料，包括100或200 μL移液器及配套枪头、一个X-P-B-S-A 35毫米培养皿载玻片和盖玻片、90%甘油和透明指甲油用于制片，一个用于干燥载玻片的支架、一盒Kim擦拭纸以及一个腰部高度的废弃物容器。除这些常用材料外，您还需要一套专用的显微解剖工具，包括直头镊子，以及45度角弯头镊子，用于在解剖过程中夹持、旋转和操作眼球。此外，15度角的镊子头部向上弯曲，也用于眼球的夹持与操作。

最后，您需要一把弹簧剪刀。使用弹簧剪刀而非传统样式的剪刀非常重要。在开始解剖前，进行此解剖操作时，请调整好座椅高度，确保您坐直时眼睛与目镜处于同一水平位置。

在显微镜前弯腰驼背会导致肩部和背部疼痛，并影响解剖操作的质量。开始时，将一份XPBS倒入35毫米培养皿的皿盖中，然后将准备解剖的眼球转移至皿中。

这是一只野生型 C57 黑鼠的眼睛。你可以看到它非常小，直径约 3.5 毫米。巩膜的不透明性使其呈现蓝青色。

解剖的第一步是去除眼球周围的所有多余组织，例如肌肉结缔组织和视神经。此处我左手持45度镊子，右手持15度镊子。你可以用一对镊子固定眼球，同时用另一对镊子牵拉并分离组织。

当一大块组织脱落时，请小心地将镊子在无尘纸上擦拭。注意不要压碎或刺穿眼球。以悬浮方式操作解剖的一个优点是，可以清楚地观察到结缔组织从眼球上漂离。

最终，您将到达一个无法再使用镊子去除更多组织的阶段。此时，将15度角的镊子更换为弹簧剪刀，使用弹簧剪刀剪断视神经。

使用刀片的外侧边缘将组织向前推至角膜巩膜分界处。然后修剪并在无尘纸上轻轻擦拭剪刀。让我们再看一遍。

当组织翘起时，用剪刀的外侧边缘将组织向前推至角膜与巩膜交界处。修剪后，继续用剪刀的钝边将组织碎片向前推，然后将其剪除，直至所有多余组织被清除。眼球上通常有两条坚韧的组织带。

第一个附着点位于角膜与巩膜交界处，第二个附着点正在被修剪。此处大约位于角膜与巩膜交界处和视神经乳头之间的中点位置。解剖的下一步是移除角膜和晶状体。

使用45度角的镊子在角膜大约中点处夹起一个瓣膜。然后使用弹簧剪在瓣膜基部做一个小切口。将剪刀的下刃插入虹膜下方的切口内。

向角膜巩膜分界处剪切，但不要剪入其中。现在，缓慢旋转眼球360度，沿周围进行小切口。尽量将剪刀保持在虹膜下方，同时剪切角膜和虹膜。

要像我在这里演示的这样轻松完成操作，需要大量的练习。角膜移除后，将眼球侧放，轻轻按压眼球外侧，使晶状体脱出。接下来剩余的结构将呈杯状。

必须将眼球切成四等份。操作时，将眼球侧放，插入弹簧剪刀的下部刀片，沿纵向剪开，但不要完全剪至视神经乳头处。

进行此操作时，保持手臂位于身体两侧，将剪刀置于身前，大致与身体和切口垂直。在与第一处切口正对的位置进行第二处切口。仔细对齐位置，以确保切口平滑。

多次切割可能会导致边缘不平整，但如果仔细对齐，这些切口并不明显。注意观察我是如何顺应眼球的球形结构进行操作的，而不是与之对抗，因为眼球在 PBS 中能保持其正常形态。将眼球用 45 度角的镊子轻轻托起，从 PBS 中取出，后续的解剖操作将在载玻片上进行。

将眼球置于一张新的载玻片上。使用两对弯头镊子，小心地将眼球展开。注意在眼球边缘有一小部分角膜和虹膜，可用于操作时夹持。

接下来，需要将四个瓣膜中的每一个均切成两半。旋转眼球，使其中一个瓣膜与身体垂直。用15度角的镊子夹住瓣膜的角部。

轻轻抬起后，从角膜巩膜分界处向视神经乳头进行切割。这些切口应垂直于切线方向。切线是指垂直于直径的一条直线。

因此，你的切口应与眼球的直径对齐。现在旋转载玻片，使下一个花瓣状切口与你的身体垂直，并重复上述操作。抓住花瓣状切口的一角。

轻轻提起并切割，重复操作，直至将四个大瓣均切成两半。其中白色的物质是神经视网膜，直接覆盖在视网膜色素上皮（RPE）之上。

神经视网膜可以保护视网膜色素上皮（RPE），因此在完成所有切口之前应保持其完整。注意观察花瓣状切口略呈弯曲状，无需强行拉直。

请耐心对齐，以确保完成一次良好的单次切割。由于眼球呈圆形，容易发生弯曲，为防止这种弯曲，可进行八次短切口。

每个花瓣上各切一次。采用与前一轮四次切割相同的基本策略。将花瓣的角部掀起后进行切割，但此次仅切割花瓣长度的大约一半。

完成所有切口后，即可移除神经视网膜。接下来，我向样本中加入几滴1×PBS。请注意，不要让视网膜色素上皮（RPE）变干。

神经视网膜应仅与下方的视网膜色素上皮层松散连接。可见其可轻易分离。然而，它通常仍会附着于角膜巩膜分界处，该位置在眼球内部为一条凹凸不平的脊状结构，称为睫状体。

可用15度镊子的尖端插入视神经头以固定样本，同时剥离神经视网膜。睫状体标志着RPE的边缘，即已脱落的深色素组织。此处为虹膜，而非RPE。

我建议尽可能多地去除虹膜，因为虹膜具有很强的黏性，如果神经视网膜松散或有残留物附着在视网膜色素上皮（RPE）上，虹膜可能会折叠并黏附到RPE上。可能出现了以下两种情况之一：要么眼球固定不当，例如固定时间过长或过短，要么在解剖前储存时间过久。

此处我正在揭示的踏板尚未设置快捷键。您可以看到，该踏板位于视网膜色素上皮（RPE）边缘约三分之一处。因此，建议设置八个快捷键。

将所有神经视网膜完全去除后，使用移液器以100至200微升的PBS反复冲洗RPE数次，直至所有灰尘和碎片被清除。用移液器将80至90微升的90%甘油以矩形形状滴加到一张新的载玻片上。注意，此甘油体积适用于22×50毫米的盖玻片，应根据实际情况相应调整。

对于其他尺寸的盖玻片，使用移液器吸头将甘油铺开。注意不要将气泡混入甘油中。如果产生气泡，将其拖至边缘使其破裂。

将15度镊子的下臂滑入RPE下方，小心抬起，缓慢将RPE放入甘油中。RPE会漂浮在甘油表面，可能略微卷曲或扭曲。使用镊子将RPE展平，并将甘油拖过RPE表面。

如果产生任何气泡，在操作时将其移至边缘处使其破裂。以约45度角持住盖玻片，接触甘油边缘。

然后将其移向载玻片的边缘。用拇指和食指捏住盖玻片底部，用15度镊子托住其对侧边缘。一旦接触到载玻片，即缓慢地将盖玻片放下。

当接触到视网膜色素上皮（RPE）时，停止继续下压，使甘油能够迁移，并缓慢降低盖玻片。如果盖玻片下降过快，此处载玻片中会混入气泡。我将缓慢降低盖玻片，当其接触到 RPE 时，让甘油自行迁移。

当快速松开盖玻片时，可以看到有气泡混入。使用足量的透明指甲油将盖玻片边缘与载玻片完全密封，确保环绕整个周边。

这是一只C57黑鼠典型的视网膜色素上皮（RPE）。如图所示，观察到下方的脉络膜血管是正常的。同时，观察到色素沉着存在一定的个体差异也是正常的，例如某些区域色素较少。

然而，此类清晰斑点很可能是由于视网膜色素上皮（RPE）及下方脉络膜的物理损伤所致。由于眼球的脉络膜也具有色素，若脉络膜保持完整，即使黑色的RPE受损也可能难以察觉。

这是来自一只稀释型小鼠的典型视网膜色素上皮（RPE）。如图所示，您将能够观察到血管结构，并且色素沉着会存在一些变异，例如较深和较浅的斑块。然而，在稀释型RPE上几乎无法观察到损伤。

这些小斑块是损伤还是色素沉着的正常变异？我建议进行封片和染色来回答这个问题。这将帮助你判断是否在操作过程中对样本处理得过于粗暴。

染色清晰地勾勒出细胞膜，使得受损区域一目了然，但实际上，视网膜色素上皮（RPE）具有较强的韧性，若通过角膜操作眼球，通常不会造成损伤。下图是一个存在多种问题的全层铺片，其中最轻微的问题是保留了过宽的角膜边缘，这可能导致组织皱褶和弯曲。你可以看到眼后部仍残留大量无关组织。

该瓣膜部分折叠，此处可见视网膜色素上皮层（RPE）已部分撕裂。另一个问题是，该眼球呈现出风车样外观。此处我已标出切口的角度。

然而，它们本应如此。请记住，你的切口应垂直于切线，并与直径对齐。我刚刚演示了如何解剖小鼠眼球以制备视网膜色素上皮的全层铺片。

上皮组织，最重要的是保持良好的姿势，但要尽量放松。希望本视频对您有所帮助，并祝您今后的实验一切顺利。