Name: 器官型小脑文化:细胞凋亡的挑战和检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习器官型小脑切片培养技术，用于研究野生型和突变型小鼠小脑细胞的凋亡反应。该方法结合免疫荧光染色分析细胞存活机制，为神经科学研究提供重要的实验手段。

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本研究部分由IPSEN基金会资助。IMV是美国癌症协会分子生物学教授，并担任欧文和琼·雅各布斯卓越生命科学讲席教授。本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）、Leducq基金会、Merieux基金会、Ellison医学基金会、Ipsen/Biomeasure公司、赛诺菲安万特公司、前列腺癌基金会以及H.N.和弗朗西斯·C.贝格尔基金会的资助。PAS由麦克奈特神经科学捐赠基金和美国国家药物滥用研究所（R01 DA019022）提供资助。作者谨此感谢Mark Schmitt。图形设计由Jamie T. Simon完成。赞助由Invitrogen公司慷慨提供。

1. 器官型小脑培养：
<ol>
<li>为成功建立脑切片器官型培养，应使用出生后0至3天（P0-P3）或8至12天（P8-P12）的小鼠。在本实验中，我们选用P8-P12阶段的小鼠，因为该发育时期更符合我们的研究需求。</li>
<li>准备解剖与培养用培养基：
<ol>
<li>脑组织解剖与切片制备需在低钠人工脑脊液（ACSF）中进行，其成分为：1 mM 氯化钙、10 mM D-葡萄糖、4 mM 氯化钾、5 mM 氯化镁、26 mM 碳酸氢钠、246 mM 蔗糖及酚红溶液（1:1000），pH值为7.3。为灭菌，需使用0.22 μm滤器过滤该溶液，并于4 °C保存。</li>
<li>小脑切片培养使用含75%最低必需培养基（MEM）、25%热灭活马血清、25 mM HEPES、1 mM 谷氨酰胺、5 mg/mL 葡萄糖、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的培养基。将培养基经0.22 μm滤器过滤后，于4 °C保存，最长不超过两周。</li>
</ol>
</li>
<li>在预先用碳合气（95%氧气与5%二氧化碳）饱和的冰冻ACSF培养基中进行脑组织解剖。注意，碳合气饱和会导致溶液pH变化，颜色由红色变为橙色。解剖过程应尽可能迅速完成，同时注意避免损伤脑组织结构。</li>
<li>使用振动切片机将脑组织切成400 μm厚的矢状切片。
<ol>
<li>用剃刀在半脑上做一次矢状切口，尽量减少对小脑的切割，以提供一个平整的切面。皮层仅用于辅助固定以方便切片；但由于时间至关重要，更便捷的做法是用剃刀切除前脑半部。</li>
<li>使用氰基丙烯酸酯胶（万能胶）将脑组织固定在金属振动切片机载片板上。在涂抹胶水前，务必将载片板置于冰上冷却，并用胶管尖端将胶水均匀涂抹成薄层。若万能胶过多，当其接触ACSF时会从载片板上脱落，导致样本丢失。</li>
<li>脑组织固定后，加入足量ACSF培养基以浸没组织，并在载片板下方放置冰块以维持低温。</li>
<li>切取400 μm厚的切片，并使用塑料巴斯德移液管（将管口剪宽以避免损伤切片）将其转移至盛有冰冻ACSF的6孔细胞培养板中。</li>
<li>在解剖显微镜下，借助两支胰岛素注射器（带细径28号针头）将小脑与其他脑组织分离。部分切片边缘可能附着万能胶，此时应尝试小心去除，因其可能影响切片活性。操作时需谨慎，避免损伤小脑结构。</li>
</ol>
</li>
<li>将小脑切片转移至含有30 mm、孔径0.4 μm培养插件的6孔板中。每孔加入1 mL已预温的培养基（在细胞培养箱中37°C、5% CO2条件下预孵至少2小时）。将插件置于培养基上方，确保其下方无气泡残留，再将小脑切片（每插件1–3片）放置于插件表面，确保切片完全展开且无液体覆盖。必要时吸除多余液体。将培养物置于37°C、5% CO2条件下培养，每2至3天更换一次培养基。建议每次仅更换部分培养基（例如1/2体积），因使用过的培养基中含有切片自身分泌的营养因子，对细胞存活至关重要。</li>
</ol>
2. 小脑切片的Fas处理与染色：
<ol>
<li>在凋亡刺激实验中，我们首先将脑片培养5天，并在第5天更换培养基 体外 3（DIV3）。在DIV5时对培养物进行处理 0.5 μg通过直接将Fas激动剂抗体Jo2加入培养基中，使其终浓度为/mL，以获得清晰的细胞死亡背景，因为换液可能在培养物中诱导部分细胞死亡。一半的孔不作处理，作为对照。</li>
<li>24小时后，用吸管吸去插入物下方的培养基。为固定脑片，在插入物下方和上方各加入1 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育10分钟。</li>
<li>10分钟后去除PFA，用冷PBS短暂清洗。</li>
<li>接着移除 PBS，向插入物下方和上方各加入 1 mL 含 20% 冰甲醇的 PBS，室温孵育 5 分钟。</li>
<li>用 PBS 再次洗涤，在插入物下方和上方各加入 1 mL 含 0.5% Triton-X-100 的 PBS 进行透化处理。于 4°C 孵育至少 12 小时 4°C.</li>
<li>透化后，在室温下用含20% BSA的PBS封闭至少4小时，或在4°C过夜 4°C此时，切片可在封闭液中于4°C保存至少3天。 4°C.</li>
<li>为了染色，小心地切下与小脑切片相连的膜插件部分，并将其转移至含有 PBS 的 24 孔板中。</li>
<li>免疫染色按顺序进行，先用TUNEL试剂孵育一小时，然后用Calbindin抗体过夜孵育。
<ol>
<li>吸去 PBS，然后加入 250 μL 将TUNEL试剂加入每个孔中，确保完全覆盖切片表面。在 37°C 在暗处孵育一小时。</li>
<li>1小时后移除TUNEL反应液，用PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
<li>最后一次洗涤后，移除 PBS 并加入 250 μL PBS 中 1/1000 稀释的 Calbindin 抗体，4℃孵育过夜 4°C 在暗处。</li>
<li>移除一抗溶液，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
<li>添加 250 μL 用 PBS 以 1:500 稀释二抗，室温避光孵育至少 3 小时。我们使用的 TUNEL 试剂盒标记为 TMR red，因此 Calbindin 的二抗偶联了 Alexa-488。</li>
<li>用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，然后使用含 DAPI 的封片剂将切片封固于玻璃显微镜载片上。</li>
<li>使用共聚焦显微镜对切片进行成像，Calbindin 采用 488 nm 激发波长，TUNEL 采用 561 nm 激发波长。</li>
</ol>
</li>
</ol>
3. 代表性结果：
本方案的主要挑战在于能够制备出健康的 cerebellar slice cultures，尤其是因为我们的最终检测指标是细胞死亡。健康的培养物表现为细胞层呈半透明状，在显微镜下可清晰观察到小脑的叶状结构（图1）。培养数天后，组织切片会逐渐变薄，并可见非神经元细胞从切片边缘迁移出去。培养数天后出现在切片表面的深色圆形细胞（很可能是巨噬细胞），其数量在10至14天后将逐渐减少 体外 （图2） 5切片活性的最终验证是通过不同细胞标志物染色，例如用Calbindin标记浦肯野细胞。图3显示了浦肯野细胞层的代表性共聚焦显微镜图像，其中可见多个TUNEL阳性细胞核。
需要考虑到，即使某些切片接受了凋亡刺激，其暴露时间也仅为24小时。这足以通过TUNEL染色观察到死亡细胞中的DNA片段化，但颗粒细胞层仍然清晰存在。 
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="细菌菌落形态图，培养皿，微生物生长，生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. DIV2时期的健康小脑切片。 该图像显示了健康切片中透明的细胞体层和小脑的叶状结构。
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="胚胎发育、显微镜图像、早期蛙胚胎、细胞分化、原肠胚形成。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 体外培养第7天的健康小脑切片。 在该图像中，仍可观察到小脑的叶状结构以及深色细胞体的出现。 
<img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="显微镜分析，神经组织荧光，细胞可视化，显微图像，神经生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 经Fas处理的小脑切片代表性图像。 该共聚焦图像显示用Calbindin（绿色）染色的浦肯野细胞以及TUNEL染色阳性的凋亡细胞（红色）。浦肯野细胞并非呈单行排列，而是聚集成类似小叶的结构。

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

所有动物实验均按照美国实验动物管理评估和认可委员会（IACUC）制定的政策进行。索尔克研究所是一家获得AAALAC认证的机构。

该方法描述了神经元器官型培养的多种可能应用之一，使我们能够研究凋亡刺激对野生型和突变型小脑切片的影响。
本实验最关键的步骤是能够稳定地制备出健康的的小脑脑片培养。关键因素包括解剖和切片技术，以及在尽可能短的时间内完成操作流程，同时需小心避免损伤脑片。另一个至关重要的因素是培养基的配制与成分，这类培养物非常敏感，因此我们必须测试多种培养基配方和品牌。甚至血清或其他培养基组分的不同批次都可能影响脑片的存活率。我们使用Invitrogen公司批号为#480116的马血清时获得了最佳结果。
一旦制备出小脑切片，即可用于研究小脑的发育、电生理特性、细胞存活情况，以及在凋亡刺激、兴奋性毒性或缺氧条件下的细胞反应。利用野生型和突变型小脑切片进行的比较研究，在小脑功能与发育的诸多方面已取得了富有启发性的成果。

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔/24孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3506/3527</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 培养板插件（0.4-&amp;mu;m 孔径）</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD95（Jo2）</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;细胞死亡检测试剂盒，TMR红</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>兔抗钙结合蛋白D-28k抗体</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-山羊抗兔IgG二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

器官型小脑培养：凋亡挑战与检测

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

神经组织的器官型培养最初由 Hogue 于 1947 年提出1,2，是神经科学领域的一项重大突破。此后，该技术不断发展，目前已有多种不同的器官型培养制备方法。本文所采用的方法借鉴了 Stoppini et al. 描述的脑片制备技术以及 Gogolla et al. 描述的染色流程3,4。
该技术的一个独特之处在于，它能够以原始结构状态研究脑部不同区域，例如海马体或小脑，相较于细胞结构和神经元网络均被破坏的离体培养，具有显著优势。对于小脑而言，这一优势尤为突出，因为它使得浦肯野细胞的研究成为可能，而浦肯野细胞极难通过离体原代培养获得。该方法可用于研究小脑的某些发育特征 体外以及用于野生型和突变型小鼠的电生理学和药理学实验。
本文所述方法旨在利用TUNEL染色检测细胞凋亡，研究Fas配体等凋亡刺激因素对发育中小脑的影响。若将TUNEL染色与细胞类型特异性标记物（如针对浦肯野细胞的Calbindin）相结合，即可实现对特定细胞群体中细胞死亡的评估。此外，Calbindin染色还可用于评估小脑培养物的质量。

本方法描述了小脑类器官培养物的制备，以及特定凋亡刺激对不同类型小脑细胞存活能力的影响。

神经组织的器官型培养最初由Hogue于1947年提出1,2，是神经科学领域的一项重大突破。

以下实验的总体目标是研究凋亡刺激因子Fas配体在野生型和突变型小鼠发育中小脑中的作用。首先，在出生后第8至12天之间解剖野生型和基因敲除小鼠的脑组织；第二步是将脑组织切成400 µm厚的切片，并从每一片中分离出小脑。第三步是将小脑切片培养五天，以确保其在使用快速配体诱导细胞死亡之前处于健康状态。该实验方案的最后一步是基于凋亡标志物TUNEL的免疫荧光染色，并结合特定细胞类型的标志物（如用于浦肯野细胞的calbindin），分析快速配体在野生型和基因敲除小鼠不同小脑细胞群体中的作用。小脑活体培养的主要优势在于，它能够维持小脑区域结构的完整性，而不会像原代分离培养那样破坏神经元网络和组织结构的有序性。因此，该研究将有助于回答神经科学领域的一些关键问题，尤其是因为研究中同时拥有野生型和突变型小鼠。这样就可以进行比较发育研究，也可以开展生理学、电生理学以及药理学方面的研究。尽管该方法可为快速配体在小脑或细胞存活中的功能提供见解，也可用于研究快速配体在大脑皮层和海马体中的作用。通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为为了获得健康的 cerebellar 裂解物，关键在于在不破坏其完整性的前提下，尽快将其投入培养。因此，在尝试整个流程之前，具备良好的解剖和切片技术非常重要。在条件允许的情况下。以下操作步骤应在解剖前于组织培养罩内进行。根据书面方案配制用于脑组织解剖和脑片制备的脑脊液（CSF）培养基，以及脑片培养所需的培养基，并在解剖当天将其置于4°C条件下保存。准备好用于培养小脑脑片的组织培养板。向六孔板的每个孔中加入一毫升切片培养基。然后使用无菌镊子将培养板插入物放入每个孔中。确保插入物下方没有气泡残留。将培养板放入组织培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育至少两小时，以预平衡培养基。接着，用碳氧混合气体（carbogen）对冰冻的aCSF培养基进行鼓泡处理，使培养基被碳氧混合气体饱和，这会改变溶液的pH值，并使颜色从红色变为橙色。将少量冰冻且通入气体的A型人工脑脊液（A CSF）培养基倒入无菌培养皿和六孔板中。将这些容器与用于脑组织切片的振动切片机载物盘一同置于冰上。在解剖后，将使用含有通入气体的冰冻A型人工脑脊液（A CSF）的培养皿来分离P8至P12小鼠幼崽的脑组织。使用剃刀刀片在半球上进行矢状切面切割，以提供一个平坦的表面用于固定在振动切片机的 Vibram 板上。也可切除大脑皮层的前部。用纸巾擦干冷却的 Vibram 板。然后在切片台上滴加少量速干胶，用速干胶管的尖端以锯齿状方式将其涂开。为形成一层薄薄的粘合层，使用刮刀将脑组织转移至振动切片台上，使脑组织的扁平面与速干胶接触。一旦脑组织固定在振动切片台上，加入足量的aCSF溶液以完全浸没脑组织，并在切片台下方放置冰块以保持低温。将脑组织切成400微米厚的切片。然后使用一端已剪开并扩宽的塑料移液管，在解剖显微镜下将切片转移至含有冰上预冷的aCSF培养基的六孔板中。使用两个带有细直径28号针头的胰岛素注射器，将小脑与脑的其余部分分离。如果任何切片边缘有超级胶水，请使用两个注射器针头将胶水从切片上移除。使用末端剪宽的塑料意面移液管，将切片转移至滤膜表面。每个插入物添加一到三片组织，以确保切片完全伸展且无液体覆盖。如有必要，用移液管吸除多余培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。48小时后，更换一半体积的新鲜培养基，并确保插入物下方无气泡滞留。剩余的原始培养基含有对细胞存活至关重要的切割衍生营养因子。在培养五天后进行凋亡刺激实验。向待处理孔中的细胞培养基加入快速激动型抗体 JO two。将一半的孔不作处理，作为空白对照。24小时后，吸去孔下方的培养基。然后通过移液在插入物下方加入一毫升冰冻的4%多聚甲醛，在插入物上方加入一毫升PFA，以固定组织切片。将切片在PFA中固定，室温下放置10分钟后，再于室温下静置10分钟。吸除PFA，并用两毫升冷PBS轻轻洗涤，分别向插入物上方加入一毫升，插入物下方加入一毫升，使用移液器操作。接下来，吸除 PBS，用移液器在插入物下方加入一毫升含 20% 冰甲醇的 PBS，插入物上方也加入一毫升。室温孵育五分钟，然后吸除孔中的 20% 甲醇，并用 PBS 洗涤切片和 D 孔。同前，用移液器在插入物上方加入一毫升含 0.5% Triton X-100 的 PBS，插入物下方再加入一毫升。在透化后，于4°C下孵育至少12小时以使溶液充分渗透组织切片。吸除PBS中的0.5%Triton X-100溶液，用移液器在切片上方和下方各加入1毫升PBS中的20%BSA溶液。在室温下封闭切片至少4小时，或在4°C下过夜。封闭完成后，使用洁净的剪刀小心剪下与小脑切片相连的膜插片。然后用洁净的镊子将膜片转移至含有 PBS 的 24 孔板中，吸去 PBS，并向每孔加入 250 微升 TUNEL 试剂，确保试剂完全覆盖切片表面。避光，在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育时间结束后，吸去孔中的隧道试剂，并加入 500 µL PBS。将板避光，在室温下孵育 10 分钟以进行洗涤。最后一次清洗后，重复此步骤两次。吸除 PBS，加入 250 µL 用 PBS 按 1:1000 稀释的钙结合蛋白抗体，于 4°C 避光孵育过夜。第二天。吸去一抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。然后加入 250 微升用 PBS 按 1:500 稀释的二抗溶液。用铝箔纸包裹培养板以避光，室温孵育至少 3 小时。用 PBS 清洗切片三次，每次 10 分钟，并使用含有 dappy 的封片剂。将切片置于玻璃显微镜载玻片上，加盖盖玻片。使用共聚焦显微镜对切片进行成像，激发波长分别为 488 纳米和 561 纳米，对应 kale、bendin 和 tunnel。此图像显示一个健康的 cerebellar 切片。体外培养两天后，细胞层呈半透明状，在显微镜下可清晰观察到小脑的叶状结构。体外培养七天后，健康 cerebellar 切片的叶状结构仍然可见。此外，通常为巨噬细胞的深色细胞体一般会覆盖在切片上。此处显示的共聚焦图像代表经快速处理的小脑切片。经一抗染色后，再使用 Alexa 488 标记的二抗孵育，比基尼细胞（bikini cells）呈现绿色。经TUNEL染色呈阳性的凋亡细胞因使用的TUNEL试剂盒标记有TMR而呈现红色。在进行该实验操作时，红色的Bikini细胞并非排列成单行，而是聚集成类似结构。需要注意的是，应尽可能在组织培养罩内操作，并尽量减少脑组织暴露于细菌或真菌等潜在污染物的时间。利用此方法，可对这些切片应用其他技术，包括生物化学和电生理学分析，以获取有关蛋白质含量以及神经元兴奋性的额外信息。该技术最初是为了研究快速介导的细胞死亡对携带影响快速通路突变的浦肯野细胞的作用而开发的。浦肯野细胞在原代培养中极少能够存活。因此，该实验方法是最佳的实验方案。希望在观看本视频后，您能够清楚地了解如何制备小脑桶状切片，以及如何研究无反应性刺激及其对不同脑细胞类型的影响。

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