改性膜联蛋白V /碘化丙啶检测细胞凋亡细胞死亡的准确评估

该实验的总体目标是克服传统 Annexin 5 和碘化丙啶染色技术的当前问题，以评估细胞凋亡和/或坏死引起的细胞死亡。我们发现，对广泛的细胞系和原代细胞进行常规染色会导致高达 40% 的假阳性事件。这些假阳性事件是由于细胞质 RNA 染色造成的。

相反，我们的方案通过在特定阶段引入固定和 RNA 降解步骤，大大减少了假阳性发生率的数量 在染色过程中，第一个细胞用 X in five 和碘化铋染色，以按照常规程序检测细胞死亡。接下来，用 1% 甲醛固定细胞，这增加了质膜的通透性。最后，用 RNA A 处理固定的细胞，以降解细胞质 RNA，消除导致碘化丙啶染色的假阳性。

与许多细胞生物学家一样，我们使用传统的连接蛋白 5 和碘化丙啶流式细胞术方法来检测凋亡和坏死细胞死亡。不幸的是，我们最近发现这种方法在一系列细胞系和原代细胞中会导致大量假阳性事件，高达 40%。此更新的方法克服了这些注意事项。

我们的方法在整个程序的特定步骤中利用细胞固定和 RNA 消化，选择性地去除 cyop Plasmic RNA，直接导致这些假阳性事件的染色，收获要分析的细胞进行实验。在本视频中，我们使用了原始巨噬细胞。例如，将样品在 4 摄氏度下以 335 G 离心 10 分钟，倒出上清液，并将细胞重新悬浮在 2 mL 的 1 XPBS 中。

然后在相同的条件下再次洗涤细胞。这一次，将细胞悬浮在 1 mL 的 1 X NX 和 5 结合缓冲液中。离心样品并再次倾析上清液后，将细胞重悬于最终体积为 100 μL 的 1 X NX Xin 5 结合缓冲液中。

根据制造商的建议，向每个细胞样品中添加 Xin 5。例如，在本视频中，将 2.5 微升 Xin Five zi 添加到每个聚苯乙烯圆底管中。将试管在室温下避光孵育 15 分钟。

然后向每个反应管中加入 100 μL 的 1 X NX 5 结合缓冲液中。现在每管中应该有大约 200 微升的溶液。接下来，在 1 X NX.In 5 结合缓冲液中制备 1 至 10 稀释的丙啶、碘化物或 PI，向每个试管中加入 4 微升稀释的 PI，每个样品的最终浓度为每毫升 PI 2 微克。

在室温下再次避光孵育试管 15 分钟。孵育期结束后，用 500 μL 的 1 x 和 x 以及 5 结合缓冲液洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 335 G 离心样品 10 分钟，然后倒出 snat。将细胞重新悬浮于另外 500 微升的 1 X NX 和 500 微升含有 2% 甲醛的 5 结合缓冲液中。

要制备 1% 甲醛溶液，请轻轻轻弹混合试管。固定后将样品在冰上固定 10 分钟。向每个样品中加入 1 毫升 1 XPBS，轻弹轻轻混匀，在 4 摄氏度下以 425 G 离心细胞 8 分钟，洗涤过程中 3 次。

在一个 XPBS 中制备 1 到 100 稀释的 RNA A，轻弹试管重悬沉淀，并加入 16 微升稀释的 RNA，A 溶液，最终浓度为 50 微克/毫升。然后将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。接下来，在 1 毫升 1 XPBS 中洗涤细胞，轻弹轻轻混匀，然后在 4 摄氏度下以 425 GS 离心试管 8 分钟。

样品现在可以进行分析了。或者，如果 N-X-M-P-I 染色与其他程序同时进行，则样品可用于后续染色步骤。代表性图像流式细胞仪图像显示了三种独特细胞群中假阳性染色的程度。

一种常用的细胞系原始巨噬细胞和两种原代细胞系，分别是骨髓巨噬细胞和金鱼原代肾巨噬细胞。金鱼原代巨噬细胞的使用突出了该技术在各种细胞平台上的适用性。真阳性事件显示 PI 和 drac 之间在核区室内的预期共定位。

五，一种高度膜渗透性的染料，可准确染色活细胞和死细胞的核室，黄色染色证明了这一点。在这里，根据其与 D dr 5、BRDU 7 A.A D DPI 的相似程度评估 PI 核染色的准确性，DRAC 5 在准确染色原始 2 64 0.7 巨噬细胞系细胞核的能力方面表现出大于 99% 的相似性。相比之下，使用常规方案时发生的细胞质 PI 染色导致核染色相对于 d dr five 的相似性百分比显着降低。

在该图中，可以看出每毫升 50 微克 RNA A 的掺入去除了非核 PI 染色，并显着增加了相对于 murn、骨髓巨噬细胞和金鱼原代肾巨噬细胞中 d dr 5 染色的相似程度。该图中原代肾巨噬细胞的代表性图像显示了 RN a 处理后细胞质区室中 RNA 染色的丢失。这些原代金鱼肾巨噬细胞的散点图显示，使用改良的 nexin PI 方案制备的细胞中假性凋亡坏死事件显著减少。

新方案显示 84.9% 的细胞是活的。门是根据评估荧光和形态特征的平行图像流样本绘制的。在一个例子中，早期祖细胞单核细胞和成熟巨噬细胞通过本视频中描述的五个 PI 方案中的改良 NX 染色，或者通过该图细胞的常规方法染色，由于去除了 RNA 处理的假阳性事件，阳性 PI 事件的数量在视觉上减少。

此外，这种效应在大型成熟巨噬细胞中比在较小的早期祖细胞中更明显。基于常规方案的结论会错误地表明更成熟的巨噬细胞亚群的细胞死亡呈正相关。在此染色程序之后，可以执行进一步的步骤，例如细胞内或表面染色，以回答有关细胞分离物中亚群的特定问题。例如，该技术的相关性超出了基于免疫的问题，还与利用经历基因毒性应激细胞的实验系统有关，这些细胞经过细胞周期停滞处理，药物如胸苷或羟基脲，以及对胚胎细胞的研究，其中发育进程的特征是细胞 RNA 合成的离散变化。