Name: 生物发光成像评估的免疫反应，植入心脏组织工程（东隧） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 了解利用生物发光成像技术在大鼠体内评估工程化心脏组织（EHT）植入后的免疫反应。该方法可实现对移植物存活与排斥反应的非侵入性纵向监测，为心血管免疫学研究提供重要工具。

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Sonja Schrepfer、Lenard Conradi 和 Arne Hansen 获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG；项目编号：SCHR992/3-1、SCHR992/4-1、CO 858/1-1、HA 3423/3-1）的资助。本工作还获得了欧洲联盟向 Thomas Eschenhagen 提供的 EUGeneHeart 和 Angioscaff 项目的资助。

1. EHT 的生成与培养条件
基于纤维蛋白的工程化心脏组织（EHT）的制备方法如先前文献所述4。简言之，为生成可用于移植的基于纤维蛋白的EHT，配制一种主混合液，其中包含从新生ROSA/luciferase-LEW转基因大鼠心脏中分离的细胞、牛纤维蛋白原和Matrigel。使用置于6孔培养板中的聚四氟乙烯（Teflon）间隔物制备琼脂糖铸造模具。琼脂糖凝固后，移除间隔物，并将带有硅胶支柱的支架架置于培养板上，使支柱伸入模具内。为生成EHT，将主混合液与计算量的凝血酶短暂混合后，用移液器加入模具中。纤维蛋白原聚合后，将带有附着于支柱上的EHT的硅胶支架轻轻从琼脂糖模具中取出，转移至新的6孔细胞培养板中，并在37°C、7% CO2的细胞培养孵育箱中，使用定制的细胞培养基进行维持培养。
EHT 在细胞培养条件下培养至第10天。在此期间，新生大鼠心肌细胞开始沿硅胶柱之间的受力方向伸长、相互连接并排列整齐。在植入时，可观察到细胞出现自发的协调性收缩，并使硅胶柱发生偏转。
2. EHT 植入
为研究同种异体免疫反应，在免疫功能健全的布朗-挪威（BN）大鼠或免疫缺陷型裸鼠中进行了EHT移植。体重为100–150 g的BN大鼠和裸鼠购自德国查尔斯河公司（Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld），在常规条件下饲养，自由摄取标准大鼠饲料和水。免疫缺陷型大鼠饲养于无菌垫料和笼具中，并使用灭菌水。动物实验程序已通过德国伦理审查委员会的审查和批准。所有手术器械在使用前均经过灭菌处理。
植入手术的操作步骤如下：
使用诱导室通过异氟烷（2.5-3%）对大鼠进行麻醉。在下吹式工作台或非循环通风橱中操作可减少人体接触异氟烷。手术过程中需维持动物体温。
<ol>
	<li>剃除腹部区域毛发，并涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。</li>
	<li>将大鼠仰卧放置，并在其鼻口部覆盖面罩以维持麻醉状态。</li>
	<li>使用聚维酮碘（Betadine）和80%乙醇对腹部区域进行消毒。擦拭时应从清洁区域向污染区域进行，即从剃毛区域中心向外周有毛区域移动。</li>
	<li>通过夹捏后肢足部检查反射，确认大鼠已充分麻醉。</li>
	<li>对动物进行铺巾，行腹正中切口，分两步分别切开皮肤和肌肉层以进入腹腔。皮肤与肌肉切开之间使用热珠灭菌法进行器械灭菌。</li>
	<li>将肠管置于预热的、用生理盐水湿润且无粉的手套中，将手套包裹肠管以防止水分流失。</li>
	<li>清除脂肪组织，暴露脾脏。</li>
	<li>用镊子观察并展开大网膜。</li>
	<li>小心地将EHT从支撑的硅胶柱上剪下，并转移至大网膜上。</li>
	<li>将大网膜包裹EHT，并使用两根7-0 Prolene单缝线（Ethicon, Norderstedt, Germany）固定。</li>
	<li>随后将肠管复位回腹腔内。</li>
	<li>用预热的无菌生理盐水冲洗腹腔。</li>
	<li>使用6-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合腹壁肌肉层。</li>
	<li>使用5-0 Prolene连续缝合线（Ethicon, Norderstedt, Germany）缝合皮肤。</li>
	<li>在大鼠仍处于麻醉状态时，皮下注射5 mg/kg的卡洛芬（Carprofen）。</li>
	<li>为为此类手术提供充分镇痛，术后3天内需在饮水中添加镇痛药（如美洛昔康，Metamizol），剂量为每100 ml水含50 mg Metamizol。</li>
</ol>
3. 移植后EHT的生物发光成像
IVIS 生物成像平台（Xenogen，Alameda，CA，USA）用于非侵入性生物发光成像 体内 使用 IVIS Living Image（Xenogen）软件包分析结果。术后2小时开始每日进行成像。
使用诱导室以异氟烷（2.5 - 3%）对大鼠进行麻醉。
<ol>
	<li>使用聚维酮碘广泛消毒腹部和胸部区域，随后使用80%乙醇，重复此步骤三次。</li>
	<li>腹腔注射d-荧光素（Xenogen；375 mg/kg体重）。</li>
	<li>将麻醉后的大鼠放入IVIS成像室（每次最多可同时分析4只大鼠）。</li>
	<li>在感兴趣区域（ROI）内，于基线水平（移植后120分钟）以及第1、2、3、5、7、10天和第2、3、4周，以光子/秒/平方厘米/球面度（photons/sec/cm2/steradian）为单位评估EHT内luc+细胞的信号强度。注意记录信号峰值（通常出现在d-荧光素注射后约20分钟）。</li>
</ol>
创建一个图表（Excel），显示信号强度随时间的变化。
4. BLI 结果与 ELISPOT 的相关性分析
细胞的 体内 在EHT移植后，研究了免疫功能健全的BN大鼠和免疫缺陷的裸鼠的免疫反应。移植后第5天采集受体动物的脾脏，以分离受体脾细胞。ELISpot实验采用丝裂霉素抑制的EHT（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）作为刺激物，与5 x10⁵6 以受体脾细胞作为反应细胞，按照制造商说明书（BD Biosciences）使用包被IFN-γ和IL-4抗体的板分别检测TH1和TH2型免疫应答。与免疫缺陷模型相比，免疫功能健全模型中IFN-γ和IL-4斑点数显著升高（IFN-γ：p = 0.001；IL-4：p = 0.023；Student t检验）。
5. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="EHT移植后的ELISpot示意图及光子衰减图" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. BLI结果与ELISpot的相关性 a) 在EHT植入后，研究了免疫功能健全的Brown Norway大鼠与免疫缺陷裸鼠体内的细胞免疫应答。EHT植入5天后收集受体脾细胞，采用丝裂霉素处理的EHT作为刺激细胞，5×10⁶个受体脾细胞作为反应细胞，通过ELISpot法检测IFNγ和IL-4的表达。Th1和Th2应答在免疫功能健全模型中显著高于免疫缺陷模型，分别表现为IFNγ和IL-4的产生增加。b) 将Luc+ EHT移植至免疫功能健全的BN大鼠或免疫缺陷裸鼠的大网膜中，通过生物发光成像（BLI）对细胞存活情况进行纵向监测。图中显示了排斥移植EHT的动物比例。所有BN大鼠均迅速排斥了EHT移植物，而在T细胞缺陷型大鼠中，细胞得以存活。

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在将EHT技术应用于临床心脏修复之前，需在实验模型中评估一些基础性问题，例如细胞和基质成分的免疫原性以及移植后移植物的存活情况。 体内 生物发光成像是一种用于监测细胞移植后存活情况的有用新技术。通过改进已有方案，我们成功制备了含有荧光素酶阳性（luc+）心肌细胞的基于纤维蛋白的工程化心肌组织 4将这些EHT植入受体大鼠的大网膜中。通过腹腔注射特异性底物（d-Luciferin），可利用IVIS生物成像平台（Xenogen）检测产生的信号。在植入后120分钟（基线）测得的信号强度，单位为光子/秒/平方厘米。2/steridian 作为移植心外膜组织片（EHT）内细胞数量的替代参数。每日测量可实现对移植物存活情况的无创性纵向评估。在排斥反应模型中，信号强度随时间下降的程度与不同大鼠品系急性排斥反应的强度和动力学特征相关。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk 大鼠（NBPR 大鼠编号 0299，http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;牛纤维蛋白原（储存液：200 mg/ml 加抑肽酶 5 &amp;#x03BC;g/ml 纤维蛋白原，溶于 0.9% NaCl，Sigma F4753&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Matrigel（BD Bioscience 356235）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DMEM（Biochrome F0415）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;马血清（Gibco 26050）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;青霉素/链霉素（Gibco 15140）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;胰岛素（Sigma-Aldrich I9278）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;抑肽酶（Sigma Aldrich A1153）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;D-荧光素（Biosynth L-8220）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;酶联免疫斑点（ELISpot）检测板（Hassa Laborbedarf，S2EM004M99）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

利用生物发光成像评估工程化心肌组织（eht）植入后的免疫反应

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

过去几十年中，人们已探索了多种心脏组织工程技术，包括使用天然或生物人工支架材料的支架策略、将心肌细胞包埋于纤维蛋白或胶原等水凝胶中，以及心肌细胞单层的堆叠1。这些方法旨在恢复受损的心脏功能（例如心肌梗死后），或作为实验模型（例如用于预测性毒理学、物质筛选或疾病建模）。如今，利用活体生物发光成像（BLI）技术，已可精确监测工程化心肌组织（EHT）植入后的细胞存活情况2。本文描述了利用一种全身性表达萤火虫荧光素酶的转基因大鼠品系（ROSA/luciferase-LEW Tg；3）制备基于纤维蛋白的EHT的方法。将EHT植入不同大鼠品系的大网膜中，以评估受体机体在EHT植入后的免疫反应。通过BLI与酶联免疫斑点技术（ELISPOT）所得结果的比较，证实了BLI在评估免疫反应方面的可用性。

本视频演示了 在体 利用生物发光成像研究大鼠植入工程化心肌组织（EHT）后的免疫反应

利用生物发光成像评估工程化心肌组织（EHT）植入后的免疫反应

过去几十年中，人们已探索了多种心脏组织工程技术，包括使用天然或合成材料的支架策略……

以下实验的总体目标是利用活体生物发光成像技术，研究大鼠植入工程化心肌组织（EHT）后的免疫反应。该目标首先通过生成表达荧光素酶的EHS细胞实现，随后将稳定表达荧光素酶的EHS细胞移植至受体大鼠的大网膜中。随后可在受体动物上进行活体生物发光成像，以无创、长期地监测EHT的存活与排斥反应。利用该模型，例如急性排斥反应的强度和动力学特征可与随时间推移观察到的生物发光信号强度的下降相关联。与组织学等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够进行每日测量，从而实现对移植物存活情况的无创、长期评估。该方法可为工程化心肌组织的存活与排斥反应提供研究依据，也可应用于其他问题的研究，例如 ehs 的代谢。本视频中展示的 bili 技术由 Christiana Parman 演示，她每天都在常规开展此项技术操作。在我的实验室中，首先从表达荧光素酶的新生大鼠心脏中分离出转基因心肌细胞，用于制备基于纤维蛋白的工程化心脏组织（DHT）以进行移植。制备主混合液，其中包含从表达荧光素酶的新生转基因大鼠心脏中分离的细胞、牛纤维蛋白原以及Matrigel，并加入X-D-M-E-M和NKM培养基。通过向6孔培养板的每个孔中加入9毫升含2%琼脂糖的PBS溶液来制备琼脂糖铸造模具，随后将聚四氟乙烯（Teflon）间隔片放入各孔中。待琼脂糖凝固后，移除间隔片，并将带有硅胶微柱的支架放置于培养板上，使微柱伸入模具内。为制备工程化心肌组织（EHT），请先轻柔混匀主混合液，然后向其中加入计算好体积的凝血酶，并短暂混匀。随后迅速将1100 µL主混合液移入每个模具中。待纤维蛋白原聚合后，轻柔地将带有支柱的支架（此时已附着EHT）从琼脂糖铸造模具中取出，并将支架转移至新的六孔细胞培养板中，每孔加入8 mL定制培养基。EHT 在 37 摄氏度、7% 二氧化碳的细胞培养箱中培养 10 天，每周更换三次培养基。在此培养期间，新生大鼠心肌细胞将开始沿硅胶柱之间的受力线方向伸长、相互连接并排列整齐。植入时可观察到自发性协调收缩。使用前通过高压灭菌器对手术器械进行灭菌，并将30毫升无菌生理盐水预热。用于植入的实验大鼠体重应为100至150克，在常规条件下饲养，提供标准大鼠饲料和自由饮水。在本视频中，使用麻醉后的棕色挪威大鼠，在手术前对大鼠进行镇静，并通过夹捏脚趾无反应来确认大鼠处于麻醉状态，按每公斤体重5毫克的剂量皮下注射卡因斯至腹部区域，剃除腹部毛发并涂抹眼膏以防止动物眼睛干涩。在麻醉期间，使用碘伏对腹部区域进行消毒，然后用80%乙醇棉片由清洁区域向污染区域擦拭。重复此消毒步骤。进行三次踏步，覆盖动物并沿腹中线做切口，分两步分离皮肤和肌肉以打开腹腔。每次切割之间使用热珠灭菌法对器械进行消毒。用生理盐水浸湿无粉乳胶手套。将肠道放入手套内，用手套包裹肠道以防止水分流失。撑开切口，暴露脾脏。用镊子识别并展开大网膜。小心地将工程化心肌组织（EHT）从悬浮的硅胶柱上剪下，并转移至大网膜上。将大网膜包裹在EHT周围，并使用两根单股7-0聚丙烯缝线将其固定闭合。接下来，将肠管复位至腹腔内。用一毫升预热的无菌生理盐水冲洗腹腔。使用6-0聚丙烯连续缝合线缝合腹壁的肌肉层。使用五号聚丙烯缝线连续缝合皮肤，以为此类手术提供充分的镇痛效果。术后三天，在每100毫升饮水中加入50毫克对乙酰氨基酚。IVUS Bioimaging平台用于体内非侵入性生物发光成像，结果通过IVUS Living Image软件进行分析。术后两小时开始每日进行包装成像。在观察EHT生物发光之前，先对大鼠实施麻醉，并通过脚趾夹捏确认麻醉效果，随后对腹部区域进行消毒。首先按每公斤体重375毫克的剂量注射荧光素，并将麻醉后的大鼠放入ivu成像室。每次最多可同时分析四只大鼠。使用IVUS活体成像软件观察并记录峰值信号，该信号通常在注射荧光素后约20分钟出现。然后，在植入后120分钟以及第1、2、3、5、7、10天和第2、3、4周，测定EHT内荧光素酶阳性细胞在感兴趣区域的基线信号强度，单位为每秒每平方厘米每球形当量的光子数。数据可用图表形式表示，显示信号强度随时间的变化。在具有免疫能力的Brown Norway大鼠和免疫缺陷动物体内的细胞体内免疫反应。裸鼠在EHT移植后被研究，于EHT移植后第五天收获受体SP细胞。通过使用丝裂霉素抑制的EHT作为刺激细胞和5×10⁶受体细胞作为反应细胞，采用lispa法检测干扰素、γ和IL-4的表达。TH1和TH2反应在免疫健全模型中显著高于免疫缺陷模型，分别表现为干扰素、γ和IL-4的产生增加。将表达荧光素酶（LUCIFERASE）的EHS移植到免疫功能健全的PN大鼠或免疫缺陷型裸鼠的大网膜中。通过生物发光成像（BLI）对细胞存活情况进行长期追踪。图中展示了移植EHS被排斥的动物比例。所有BN大鼠均迅速排斥了EHT移植物，而细胞在T细胞缺陷型大鼠中得以存活。一旦掌握手术技巧，若术后操作得当，手术可在数分钟内完成。也可采用其他方法，如免疫学检测和组织学分析，以探讨有关细胞浸润和体液反应的其他问题。

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生物发光成像评估的免疫反应，植入心脏组织工程（东隧）

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