使用脉动生物反应器构建基于生物材料的血管移植物

本实验的总体目标是利用脉动式生物反应器系统，构建基于生物材料的血管移植物。该过程通过制备由PGA网状材料构成的可降解支架，使细胞在其上生长，并将支架组装至生物反应器腔室中来实现。随后，将平滑肌细胞接种于支架上，并用带有通气孔和加样管的盖子密封生物反应器腔室。

随后将生物反应器连接至流动系统，以向生物反应器中的血管提供脉动流。在反应器中，细胞生长形成血管结构，并可通过免疫化学、生物化学和力学测试。该技术的应用前景涉及冠心病治疗，因其为再生可用于动脉旁路移植的小直径血管移植物提供了一种极具前景的策略。

尽管该方法可为血管组织工程提供研究思路，但也可应用于其他承受周期性生理力的器官系统。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，需要大量练习才能完全掌握相关技术。

我们最初产生这一方法的想法，是源于认识到施加生理性的机械刺激对于再生工程构建物的重要性。由于生物反应器的使用过程步骤繁多，且只能通过详细的演示才能掌握，因此对该方法进行可视化展示至关重要。首先，使用蒸馏水清洗内径为三毫米、长30厘米的硅胶管段，然后使其自然风干。

使用剪刀和止血钳，为每段导管裁取一段1.1厘米×8厘米的PGA网状材料；用Dexon 6.0缝线将PGA网固定在导管上，打三个外科结，随后用止血钳进行单针缝合。固定后的网状材料构成PGA支架。将支架先浸入1摩尔氢氧化钠溶液中1至2分钟，然后在蒸馏水中浸洗三次，每次2分钟。每次洗涤之间轻轻吸干，第三次洗涤后置于通风橱中静置晾干15分钟。

干燥后，用三针将一厘米长的涤纶套管缝合到补片的每一端。保持两到三毫米的管状重叠部分，且不要刺穿管壁。确保在此方案后续步骤中留出约15厘米的游离缝线以供使用。

所有生物反应器组件和工具均需预先进行高压灭菌。在启动生物反应器培养的前一天，必须将生物反应器部分组装，并将生物反应器组件、支架、网状硅胶管、手术器械以及一根长度超过生物反应器的细金属丝浸入70%乙醇溶液中，浸泡至少30分钟。在浸没状态下，使用该金属丝将硅胶管穿过反应器的侧臂。

现在取出生物反应器，通过将涤纶套环固定在扩大的玻璃边缘上，将PGA支架安装在内部。利用多余的缝线将每个套环系紧。接着，使用连接器将支架一侧的硅胶管连接到生物反应器的一对臂上，再将支架另一侧的硅胶管连接到另外两个臂上。

安装好连接件后，将其从侧臂中拔出，并用乙醇冲洗生物反应器。每侧让反应器浸泡10分钟。将生物反应器置于一些培养皿上，并用组织培养液冲洗。

冲洗水相。使用移液管时，务必同时冲洗滤网和管路。现在将一个无菌搅拌子放入反应器中以备后续使用，并从此刻开始，在通风橱中打开吹风机、关闭紫外灯，将装置干燥过夜。

切勿在反应器上方倾斜，以免造成污染。安装过程中，所有连接器必须用酒精擦拭干净。在连接之前，许多接头需用帕洛福姆（paraform）加固，使用前应将其浸泡在70%乙醇中。因此，请准备充足的酒精和帕洛福姆。

作为预防措施，将无菌培养皿置于每个生物反应器开口上方，以保护内部的PGA支架免受污染。现在开始安装，将注射口连接到生物反应器的第三个未使用的端口上。接下来，将输液袋连接至流动系统。

使用海象导管套装，将蓝色端靠近Y型接头处尽可能扎紧并夹闭导管。将红色导管连接至静脉输液袋的远端。然后将白色导管连接至流动系统的一侧。

在流动系统中插入一个三通旋塞阀。将压力传感器管的一端连接到旋塞阀上，另一端连接到静脉输液袋的中间开口。现在向静脉输液袋中加入 350 毫升 PBS 和 1% 抑菌剂，以使流动系统部分充满液体并检查是否存在泄漏。

使用60毫升注射器，在连接到流控系统之前或之后，调节旋塞阀以控制PBS的流动方向，并挤压袋子以冲洗系统。此步骤可在细胞接种前或接种后进行。现在可将细胞接种至生物反应器中。

在此示例中，将约800万个SM细胞（相当于一个汇合的T75培养瓶）重悬于1.25毫升培养基中，并从涤纶接头至涤纶接头均匀滴加到PGA支架上。接种细胞后，用酒精将生物反应器边缘擦拭干净，避免在反应器上方悬停。

接下来，小心地组装硅胶塞盖。从高压灭菌袋中取出盖子或进行后续任何连接步骤时，切勿暴露盖子的底部。首先，将加样口连接到喂养管的雄性接头上。

第二，将聚四氟乙烯（PTFE）0.20微米滤器连接至三个进样口。第三段，密封进样口。将组装好的硅胶密封盖插入玻璃生物反应器中。

确保饲管不接触已放置的PGA支架。然后用多聚甲醛封固。现在将生物反应器连接至灌流系统，并将生物反应器及灌流系统置于37°C培养箱中。

将反应器侧放，持续 25 至 30 分钟，每 5 分钟旋转一次。接着，在仍处于培养箱中的情况下，通过喂养管利用泵向生物反应器腔内注入 400 毫升、pH 值为 4 至 10 的培养基。现在将接种后的支架在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 6 至 7 天，期间不进行脉动泵送。

在此期间，开启泵之前无需更换培养基或添加维生素C，检查管路是否有泄漏或弯折。然后调节泵的转速，使压力维持在负30至270毫米汞柱范围内。在整个培养过程中，每天监测并维持该压力。

培养基更换和抗坏血酸的补充应每周进行两次，同时在支架生长期间通过脉动泵送提供新鲜培养基。首先，为换液和废液处理目的，将注射口和聚四氟乙烯（PTFE）滤器安装到加样盖上。接着，将加样管牢固地置于双向泵中，并将一端插入生物反应器的加样口，另一端插入加样盖。随后，缓慢开始泵出 200 毫升培养基。

可逐渐提高泵速。然后连接新的进料管，缓慢开始泵入200毫升新鲜培养基。如需向反应器中添加抗坏血酸，使用无菌的30毫升注射器取出25毫升培养基。

加入5毫升无菌抗坏血酸溶液，然后补足至25毫升。经过8周培养后，工程化血管将呈现不透明状态，并达到约250微米的壁厚。在脉动条件下，对工程化血管进行苏木精-伊红染色显示，其组织形态随时间及脉动刺激而发生变化。

血管的管腔侧通过L Masson三色染色显示。胶原染色表明，经过四周脉冲刺激的血管比未受脉冲刺激的血管含有更多的胶原；白色箭头指示在12周时血管中仍残留的PGA片段。免疫化学分析显示，早期平滑肌标志物α-肌动蛋白、中期平滑肌标志物钙调蛋白1以及晚期平滑肌标志物肌球蛋白重链的表达。一旦掌握，该技术若操作得当，可在七到八小时内完成。

在尝试执行该操作流程时，重要的是要牢记始终尽可能以最清洁和无菌的方式遵循本步骤进行操作。还可以对所构建血管的管腔进行其他方法的改造，以回答更多问题，例如在体内研究过程中，管腔表面修饰对于维持构建血管的重要性。在完成构建后。

该技术为组织工程领域，尤其是血管工程领域的研究人员探索在动物模型中治疗冠状动脉疾病的有效方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过动态体外培养方法制备可植入的工程化血管移植物。请注意，氢氧化钠具有危险性，在操作过程中必须始终采取防护措施，例如佩戴护目镜和穿着实验服。