Name: 夹层和小鼠的外周淋巴结的双光子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: 了解双光子成像技术在小鼠外周淋巴结中的应用，通过过继转移荧光标记的CD4+ T细胞，实时观察T细胞在淋巴结内的运动行为。该方法为免疫学研究提供了重要的活体成像手段。

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我们感谢Rebecca Paquette在试剂制备方面的帮助。MPM获得了美国国立卫生研究院Ruth L. Kirchstein博士前奖学金的支持，以及美国国立卫生研究院资助项目GM-41514（MDC）、NS-48252（KGC）和GM-48071（IP）的支持。

1. 细胞过继转移：
尾静脉注射或眼内注射均适用于导入经细胞示踪剂标记或表达荧光蛋白的淋巴细胞。在本视频中，我们演示通过尾静脉注射进行细胞过继转移的方法。
a. 材料
CD4+ T细胞在37ºC下用1.4 μM CFSE标记30分钟，洗涤两次后重悬于100 μL RPMI-1640培养基中。将细胞加载至无菌的28号胰岛素注射器中用于注射。所用细胞数量取决于具体实验设计。通常，500万个T细胞&nbsp;足以进行简单的T细胞示踪观察。实验中需使用小鼠啮齿类动物固定器，以防止对动物&nbsp;和&nbsp;操作者造成伤害。
b. 固定动物
将小鼠缓慢地向后推入啮齿类动物固定器中以进行过继转移（参见视频），并通过轻轻按压推杆封闭管子的开口端。在此过程中，请勿松开小鼠尾巴，因为一些体型较小的动物可能在固定器内转身。该方法可防止动物受伤，并避免在注射过程中移动。安装啮齿类动物固定器时，推入推杆的深度不应超过防止动物向前跳跃所需的程度。同时，&nbsp;切勿将推杆直接抵住动物身体，也不应让动物在固定器中停留过长时间。
c. 观察尾静脉
轻轻将尾巴朝向自己拉近，使其轻柔地缠绕在食指上，并用拇指将尾巴压在食指内侧固定。辨认位于直立尾巴两侧的尾静脉。可通过温水加热尾巴以促进血管显影，随后用乙醇擦拭表面。
d. 细胞注射
确定静脉位置后，将注射器针尖斜面朝上，以与静脉平行的浅角度插入。进入静脉后，轻轻推动推杆；若针头在静脉内，则注射时应无任何阻力。如果遇到任何阻力，应立即退出注射器，并在另一位置重新尝试。
如果血管清晰可见，缓慢推动针栓直至注射完成。注射过程中尾部不应出现肿胀，若发生肿胀，则表明针头未进入血管内。在注射过程中有可能“失去”血管，此时应拔出针头，并在尾部另一位置重新尝试注射。若需进行多次注射尝试，最好从原注射位点向小鼠身体方向沿尾部上移选择新注射点。&nbsp;为应对这一情况，初始注射应从尾部较远端开始，以便为后续的过继性转移操作预留足够的尝试空间。
e. 注射后的注意事项
注射完成后，静脉处会出现少量血液回流。用干净的擦拭巾轻轻按压注射部位，直至出血停止。取出注射器的活塞，轻轻抓住动物的尾巴，让其向前行走，离开固定装置。
务必咨询您的动物护理委员会并遵守动物使用规程，以确保符合相关规定。在进行正式实验之前，务必多次练习该技术。
2. 淋巴结分离
用于双光子成像的淋巴结分离需要从周围组织中仔细摘取正确的淋巴结。
a. 外周淋巴结的选择与定位
用于成像的淋巴结选择取决于实验目的。需注意局部感染或注射部位引流的淋巴结，并选择适合成像的淋巴结。Van den Broeck 等人的文章详细描述了小鼠淋巴结的位置和形态3。在本视频中，我们展示了六个适合用于细胞分离或成像的大型外周淋巴结的切除过程。
b. 淋巴结切除：
在去除淋巴结时，需注意保持组织的完整性。操作过程中应小心避免破坏被膜或以任何方式损伤淋巴结结构。淋巴结结构完整性的丧失将影响实验结果。如有必要，可在解剖显微镜下使用精细解剖镊（#5 Dumont 镊子）去除淋巴结表面的脂肪组织。淋巴结表面不应残留任何脂肪，因为脂肪会散射光线，从而干扰成像效果。
在首次正式实验之前，正确切除淋巴结也是一项需要练习的重要技术。
3. 淋巴结成像设置与注意事项
应将淋巴结固定在成像台上，&nbsp;在这种情况下，装置包含一个凹陷的腔室。通过蠕动泵和管路加热器，将加温并充氧的培养基从一侧泵入腔室，培养基随后经由向下倾斜的通道流出，进入带有真空管的收集室，并最终流入废液收集瓶。在我们的系统中，淋巴结浸没于37°C的培养基中，并以医用级碳氧混合气体（5% CO₂ + 95% O₂）进行表面灌流。2，95% O₂2灌流液的温度应尽可能靠近淋巴结的位置进行记录。您所使用的特定系统可能需要根据显微镜载物台和物镜的配置，对灌流液流速和载物台设计进行相应调整。
a. 淋巴结成像装置设置：
如视频所示，我们将淋巴结髓质面朝下（以便使用直立显微镜观察T细胞或B细胞区域）固定在裁剪至合适尺寸的塑料盖玻片上。必须使用无毒的组织胶（我们使用3M公司生产的VetBond™）。
通过在盖玻片的底面涂抹少量硅脂，然后将其粘附到成像室的玻璃底座上，从而在流动的培养基中固定盖玻片。
b. 双光子成像注意事项：
多种因素可导致淋巴细胞停止运动：温度过高或过低；激光功率过高；淋巴结受到压迫或其他损伤；以及缺氧。由于激光功率过高或温度&gt;约39°C造成的损伤是不可逆的。
如果细胞荧光较弱，通常最好提高检测器增益或优化细胞标记方案，而不是使用更高的激光功率来观察细胞。可能需要优化标记过程或荧光蛋白的表达，以使荧光信号高于背景自发荧光水平。在合理的增益和激光功率设置下，荧光信号较基线水平（通过流式细胞术测定）提高约两个数量级，是细胞观察的合理范围。
使用可调谐的双光子激光器时，激发所用的波长应略小于待成像荧光染料单光子激发最大值的两倍。在使用多种标记物或荧光蛋白的双光子实验中，可能需要尝试不同的激发波长，以找到适用于所有标记物的最佳设置。双光子激发还可通过利用内源性胶原结构固有的蓝色二次谐波生成来实现成像。二次谐波生成（SHG）是指在材料内部两个光子结合并发射出一个频率为原始光子两倍的单光子的现象。在组织中，当入射激光垂直于高度有序的蛋白质结构（如胶原）时，会发生双光子激发。
关于双光子成像的实际问题已在先前的综述中讨论过4, 5。

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

在本视频方案中，我们展示了用于成像外周淋巴结中淋巴细胞运动所需的过继性细胞转移以及淋巴结分离与制备步骤。与共聚焦成像相比，双光子成像在离体组织（如本文所示）和活体样本中均具有多项优势。值得注意的是，使用红外激发可最大限度减少光散射，从而能够对淋巴结被膜下约300微米深度以及某些组织更深层区域进行成像4。此外，多光子激发仅局限于物镜的焦点位置，可显著减少焦点平面以外的光漂白和组织损伤。然而，与任何新技术一样，双光子成像并非万能，其局限性和潜在陷阱必须予以充分考虑5。其中之一是，除胶原蛋白等内源性信号（如二次谐波产生）外，目标细胞必须通过外源性探针标记或表达荧光蛋白才能实现荧光标记。因此，人们容易产生一种印象，即这些被标记的细胞仿佛游动于一片黑色虚空之中；而事实上，它们所处的环境极为复杂，被大量未标记且不可见的细胞及结构成分所包围，并与之发生相互作用。

自从双光子成像技术引入免疫学领域的六年来，该技术使研究人员能够通过直接观察完整活体组织中的细胞间相互作用、细胞运动与定位、细胞信号通路以及细胞毒性细胞杀伤事件等过程，解答了长期以来存在的科学问题。该领域已迅速超越最初的表型描述阶段，目前正结合定量分析、计算机建模与模拟，逐步揭示淋巴结内看似混乱的细胞运动和相互作用如何最终产生高效的免疫应答。这一进展已在近期一篇综述文章中得到全面总结1，该文列出了100多篇关于双光子显微镜在免疫成像中应用的研究论文。

小鼠外周淋巴结的解剖与双光子成像

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

双光子成像技术揭示了在基础状态下以及免疫应答启动过程中淋巴结内细胞运动与细胞间相互作用的精巧动态过程1。本文介绍了标记T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及如2002年首次描述的那样，在离体淋巴结中对CD4+ T细胞运动行为进行成像的方法2。对免疫细胞进行双光子成像需要细胞带有荧光标记，可通过细胞示踪染料染色或表达荧光蛋白实现。我们展示了将来源于供体小鼠的细胞经尾静脉注射到受体动物体内的过继转移操作，这些细胞可在约15–30分钟内归巢至淋巴器官。我们图示了淋巴结的分离过程，并描述了确保离体淋巴结正确安装的方法。其他注意事项，如灌注介质的充分氧合、温度控制和激光功率的调节，也进行了讨论。最后，我们展示了在37°C条件下，初始型CD4+ T细胞呈现稳态运动的三维视频图像。

双光子成像已揭示了在基础状态及免疫应答过程中淋巴结内淋巴细胞的运动性及细胞间相互作用1。本文中，我们展示了T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及离体淋巴结中CD4+ T细胞运动性的成像。

双光子成像揭示了在基础条件下以及在...时淋巴结内细胞运动与细胞间相互作用的精巧协调过程

您好，我叫Melanie Matthew，来自加州大学欧文分校Micah Helen的实验室。今天我们将从小鼠体内取出淋巴结，用于原位光子成像。这包括切除腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结和颈部淋巴结。小鼠体内有六个易于获取的外周淋巴结。为了将荧光标记的细胞导入小鼠淋巴结，我们首先需要进行荧光标记细胞的过继转移，以便通过双光子成像进行观察。在本实验中，我将首先向您演示过继性细胞转移。这是我们的28号胰岛素注射器。我将用它吸取一些细胞悬液。首先，我需要卸下注射器的堵头，使其能够顺畅推动。接着，我将小心地加载细胞。我会尽量避免用胰岛素注射器触碰试管内壁，以免针头变钝，从而增加向小鼠尾静脉注射的难度。如果有气泡，需要轻弹去除，将它们排出去。在这里轻敲使其移出。这样就可以了。现在我们准备将这些细胞注入尾静脉。好的，这是我们的C57BL/6小鼠。我们将缓慢而轻柔地将其放入尾静脉注射器中。许多小鼠并不喜欢这样，但这样可以防止在进行实际注射时小鼠跳动，从而避免它们进一步受伤，或导致操作者可能被针头刺伤。因此，您应非常缓慢地将小鼠固定好。接着，您需要在小鼠尾巴的两侧寻找尾静脉。因此，一条大动脉沿背部上方走行。而在小鼠尾巴的两侧，则有两条细长的静脉，一直延伸至尾尖。因此，拿起你的针头，从尾巴较低的位置开始，寻找静脉。我在这里就能看到一条静脉。我将用乙醇稍微湿润一下该区域，这样能更清楚地观察到静脉。好的，现在我们将进行尾静脉注射，注意保持针头斜面朝上，即针头开口端朝上，并且进针方向应与尾巴几乎平行。不要以角度进针，因为血管就在正上方。你只需非常缓慢地将针头滑入尾静脉即可。随着操作次数增加，你会逐渐感受到针头进入血管时的细微感觉。但最初一两次推动液体时，要观察是否有阻力。如果没有阻力，说明针头已在尾静脉内，此时可以像我刚刚所做的那样，快速、顺利地完成注射。然后可缓慢地将针头拔出。另一个确认已进入静脉的迹象是，你会看到少量血液回流形成的小血泡。因此，若在注射部位有少量血液顺利回流出来，即可确认针头确实已进入尾静脉。注射后，小鼠的出血应很快停止。好的，这是一只C57BL/6小鼠，我们将从小鼠的腹股沟两侧、腋窝下方（即此处可找到腋下淋巴结的位置）以及另一侧进行淋巴结的摘取。此外，还有位于颈部上部咽喉区域的浅表颈淋巴结，每侧各一个，位置分别在这里和这里。你好。现在我们准备解剖小鼠。我将首先用大头针把小鼠固定在解剖板上。继续操作，把四肢固定好。是的。需要确保固定针的位置牢固可靠。这样可以更好地暴露外周淋巴结。因此，我通常会将四肢的爪子全部固定住。我不用担心尾巴部分。有些人也喜欢把尾巴固定住。为了防止毛发进入我们正在解剖的区域，避免毛发污染淋巴结和实验器械，我们会用70%乙醇喷洒小鼠。现在小鼠已通过乙醇麻醉，我将沿中线做一切口。操作时，先将毛发从身体上拨开。如您所见，皮肤可以被提起，形成一个小帐篷状。这样可以避免切到腹膜，而在此情况下这是需要避免的。好的，我将从这里的正中切口开始。先做一个小切口，并确保没有进入腹膜。可以看到下方有腹膜。我将剪刀插入切口下方，缓慢地将皮肤与腹膜分离，边操作边做小切口，因为我们接下来要取颈部淋巴结。我会非常小心且缓慢地一直剪到小鼠的下颌线，确保不损伤任何主要的血管。然后，由于我们要获取的是位于皮瓣下部的腹股沟淋巴结，我将沿着中线切开，一直切到尾部下方，即尾根处。好了，这样我们就完成了一条可用的中线切口。现在我将分离皮肤与腹膜。操作过程中，我将用镊子轻轻牵拉皮肤，使其与腹膜分离。这样就暴露出了我们将要解剖的第一个淋巴结。这是位于下方皮瓣中的腹股沟淋巴结。现在我已经将小鼠主体上的皮瓣拉开，接下来将用针固定，以充分暴露腹股沟淋巴结。这样可以更好地暴露腹股沟淋巴结，便于我们将其完整地分离出来。如图所示，在固定后已暴露腹股沟淋巴结。它通常位于此处腿部上方的皮瓣中。可通过观察其上方血管的Y形分叉处来定位该淋巴结。好了，就在这里。它藏在一些脂肪组织中，上方有血管走行。现在，我将移除腹股沟淋巴结。我用镊子沿着淋巴结两侧轻轻刮擦，将其从脂肪组织中分离出来。我们不需要任何脂肪组织，因为双光子成像时脂肪会阻碍激光对组织的穿透。让我们来看一下。分离淋巴结周围所有脂肪组织非常重要，同时要保持淋巴结的皮质结构完整。好的，就是这样。这就是我们的髂淋巴结。我将把它放入培养基中，判断是否去除了全部脂肪的一个好方法是观察淋巴结是否会下沉。一旦放入培养基中，它会立即沉到底部。如果有脂肪，它会浮起来。好的，现在我要取出辅助淋巴结。它位于小鼠腋窝处，紧邻一条主要血管。因此，有时操作可能会比较困难，因为会出现大量出血，从而遮挡淋巴结。不过，我会向您展示我的操作方法，希望这次不会出现出血情况。首先，我会掀开皮瓣，实际上我会将我想取下的淋巴结旁边的前臂部位也一并掀开。这样我可以用手指更灵活地将皮肤拉开，同时抓住腋窝处的这块肌肉，轻轻牵拉，腋窝淋巴结就会显露出来。我现在就寻找一下。就是它。它就位于腋窝内，沿着一条主要的血管。现在我将分离出腋窝淋巴结，你可以重新用针固定皮肤，也可以用手指捏住，选择你觉得更顺手的方式即可。但我倾向于在此操作中格外小心谨慎。这个淋巴结周围的脂肪很少，这有利于成像，但它紧邻一条主要血管，因此如果不小心，有时可能会丢失样本。对于腋窝淋巴结，我正在抓取其周围的结缔组织，并缓慢地将其从血管上分离。好了，就是这样。这是我们的腋窝淋巴结。就在这里。它是一个细长且扁平的淋巴结。我正在轻轻夹住淋巴结侧面残留的一些结缔组织，以避免损伤淋巴结本身。为了保持淋巴结的水合状态，我们将进行成像。在进行离体成像之前，将淋巴结分别置于不含CO2的培养基中，并放入独立的腔室，以便区分并追踪腹股沟、腋窝和颈部淋巴结。判断淋巴结制备是否成功的方法是，解剖取出后观察其是否会沉入底部。如果下沉，说明淋巴结中的脂肪含量极低。好的，现在我将移除颈部淋巴结，即浅表颈淋巴结。我进行此操作时，会从取出腋下淋巴结的位置重新固定，以便更好地暴露小鼠颈部组织。颈部淋巴结位于小鼠下颌肌肉附近，实际上沿着侧面分布。这些淋巴结就是你在生病时能摸到的那些。当你患感冒时，医生通常会触摸这里的淋巴结。为了做到这一点，我通常喜欢将手指伸到组织下方，一边用镊子沿着侧面轻轻滑动，一边将组织向前轻拉。我应该能看到一个突出的淋巴结。哦，就是它。它就在组织上方。在这里。这是浅表颈淋巴结。注意不要误取唾液腺。在您的唾液腺中找不到任何T细胞。而这些特定的淋巴结中含有用CFSC标记的CD4阳性T细胞。接下来，我们将向您展示这些T细胞在组织内移动的原位视频。好的，现在我要将淋巴结粘附到一个不易破碎的塑料盖玻片上，以便将其固定在原位成像载物台的底部。这样在对T细胞进行成像时，可以避免组织移动或漂移。我手边用的就是这种不易破碎的塑料盖玻片。我要做的第一件事是将其中一块裁剪成适合我们淋巴结的大小。因此，我只需用剪刀剪出一个小方块。好了，现在我要在其上轻涂胶水。取少量胶水，涂抹在我们已切割好的载玻片上。然后，我将取一张无尘纸，吸去多余的胶水。这是将覆盖在淋巴结上的胶水。我们只需要非常薄的一层，以免影响成像。接下来，我将从溶液中取出一个淋巴结。因此，我们将从媒体中取出的第一个淋巴结开始。操作时需轻柔，避免损伤淋巴结的皮质部分。我将仅捏住其一角，并通过先轻轻将淋巴结的角落接触载玻片，然后将淋巴结在载玻片上拉开，从而将其固定在载玻片上。我利用了淋巴结边缘残留的少量脂肪来完成这一操作，因此实际上并未破坏淋巴结的皮质区域。然后取淋巴结，为了固化胶水，我将把它浸入之前取出组织的同一孔中。因此，将淋巴结倒置，轻轻浸入培养基中，使所有胶水随之转移。取下少量已随组织固化的外源性胶水。好了，现在我们已经准备好用于双光子成像的淋巴结。这就是制备用于原位双光子成像淋巴结的方法。现在我们将把这些样本转移到显微镜下，进行设置并获取我们过继转移的T细胞的高质量图像。这里我们看到的是荧光染料CFSE标记的T细胞在腹股沟淋巴结内移动。该视频已加速约500倍，可以看到这些细胞具有高度的运动性。通过我们的20倍水浸物镜，它们被放大了约20倍。这只是T细胞运动的一个示例，我们尚未对周围细胞进行任何染色处理。通常在更高级的双光子实验中，可以对树突状细胞、B细胞、T细胞以及与之相互作用的自然杀伤细胞（NK细胞）进行染色标记。你可以对淋巴结内可能存在的几乎所有预期细胞类型进行标记，并对其进行成像观察。以上即为我们研究所淋巴结成像方案的全部内容。

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