天堂斑马鱼的细胞标记与激光Uncagable荧光葡聚糖
2011年4月28日
该协议描绘的方式，标签和跟踪的小斑马鱼的胚胎细胞群体，使用紫外线uncaging笼荧光，整个装载免疫标记uncaged荧光信号放大的命运。
该程序的总体目标是在斑马鱼胚胎中谱系标记细胞。这是通过首先合成笼状荧光素并将其注射到斑马鱼胚胎中来实现的。然后将胚胎安装在 agarro 中，以便可以接近要标记的细胞。
接下来，使用紫外激光激活胚胎选定细胞中的笼状荧光素。最后，在胚胎发育到所需阶段后收获胚胎，并根据特定谱系的标记物检测标记的细胞。最终，可以获得通过光解笼和免疫荧光显微镜显示胚胎中选定细胞命运的结果。
与现有技术（如 Cade 的光转换）相比，该技术的主要优点是，除了其他细胞结合特异性抗体外，多色免疫荧光还可以检测未笼荧光素。要将笼式荧光素葡聚糖注射到斑马鱼胚胎中，首先合成它并准备每体积 1% 重量。根据随附的书面方案储备等分试样。
接下来，在 0.2 摩尔氯化钾中稀释 1 至 5 或 1 至 10 份。接下来，将 0.5 至 1 纳升笼状荧光素溶液注射到一个细胞期胚胎的卵黄中。注射后使用压力注射器，胚胎窝必须保存在 28.5 摄氏度的黑暗中，以减少所需发育阶段的非特异性解笼。
手动从胚胎中取出 choon，在 4% trica 中麻醉胚胎以使胚胎平衡，将 0.8% 熔化的 aros 置于 50 摄氏度的加热块中至少 15 分钟。然后将手中的试管冷却约 30 秒 在使用玻璃移液管添加胚胎之前，将一个胚胎放入少量水中，然后将其释放到体内。从试管中吸取胚胎和大约 50 微升的 aros，然后将内容物排到 35 毫米 x 10 毫米培养皿的中心。
使用塑料线快速定位胚胎，使要解笼的细胞面朝上。让 aros 完全凝固并填满盘子。三分之二装满含有 4% trica 和 0.003% PTU 的蛋水，将胚胎保存在一个轻巧的盒子中，直到笼中。
要在荧光素葡聚糖的笼子上进行激光，请使用带有 40 x 水浸物镜的复合显微镜。在解笼之前，我们使用带有 365 纳米染料池和 70%30% 分裂二向色镜的光子学仪器激光器。激光器必须与物镜齐焦，并衰减到适当的功率以聚焦激光器。
将镜面载玻片放在物镜下方并聚焦物镜，直到看到载玻片上的划痕。调整激光衰减器，直到激光在镜子中用单个脉冲产生清晰可见的划痕，上下调整物镜焦距。如果激光在物镜失焦时会产生划痕，请将激光焦距调整四分之一。
向上或向下转动。重复直到激光可以划伤镜子。只有当目标聚焦时，将挂载的胚胎放在目标下方，并专注于要解笼到解笼的区域。
聚焦于感兴趣的细胞，以 2 到 3 赫兹的频率脉冲 10 到 20 次。解笼后。用镊子剥去胚胎，然后将它们放入含有 0.003% PTU 的鸡蛋水中，以释放胚胎 将胚胎在抗体固定剂中，在室温下固定 2 至 4 小时，或在 4 摄氏度下过夜。
去除固定剂并用 100% 甲醇更换。在室温下孵育 10 分钟。然后除去甲醇，用新鲜的 100% 甲醇代替。
将胚胎储存在零下 20 摄氏度的甲醇中至少 30 分钟。在表位开始降解之前，您可以在甲醇中储存长达两周。在室温下用 75% 甲醇 25%1 x 磷酸盐缓冲盐水和 0.1% 吐温 20 50% 甲醇 50% 一个 XPBS 吐温 20 洗涤 5 分钟，然后用 25% 甲醇、75% 一个 XPBS 吐温 20 洗涤 3 次，每次 5 分钟，在一个 XPBS 吐温 20 中洗涤 5 分钟。
如果胚胎超过 24 小时，则以每毫升 10 微克的速度渗透它们。一个 XPBS 吐温 20 渗透时间中的蛋白酶 K 取决于胚胎阶段。在蛋白酶 K 中 5 分钟就足够了。
如果胚胎在受精后 24 到 48 小时之间，则年龄较大的幼虫可能需要更多时间。在室温下重新固定抗体固定剂 20 分钟。在室温下，在一个 XPBS tween 20 中洗涤胚胎 5 次，每次 5 分钟。
然后在室温下在块状溶液中孵育 1 至 2 小时。在封闭溶液中稀释一抗。然后第二天早上在含有一抗的溶液中将胚胎在 4 摄氏度下孵育过夜，同时在封闭溶液中的一瓶 XPBS tritton X 100 稀释荧光标记的二抗中洗涤胚胎四次。
将胚胎在 4 摄氏度下在含有二抗的溶液中孵育过夜。在 1 个 XPBS Triton X 100 中洗涤 4 次后，在 50% 甘油 50%1 XPBS 中清除胚胎，在室温下至少两个小时。然后去除甘油 PBS 混合物并加入 100% 甘油，在 4 摄氏度下孵育过夜。
对照和光开笼幼虫的 Represen 结果以共聚焦投影的形式显示。对照胚胎注射笼中荧光素，但在受精后 48 小时未进行光解锁。对照胚胎在松果体复合物中表现出 GFP 标记。
一些点状背景标记，但未检测到标记荧光素的局部积累。光致未笼的胚胎显示一些 GFP 标记的细胞中透明积累了无笼荧光素。这些是 24 小时前在笼子上拍摄所针对的细胞的后代，经过细微的修改。
该程序可用于在受精后 48 小时之前对斑马鱼胚胎中的几乎任何组织进行谱系标记。
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概述
该协议描述了一种方法，用于在斑马鱼胚胎中标记细胞系，使用的是笼内荧光素的紫外解笼。该技术允许通过免疫荧光显微镜追踪特定细胞的命运。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 斑马鱼是研究发育过程的模型生物。
- 笼内荧光素是用于精确细胞标记的化合物。
- 紫外解笼允许在特定细胞中定点激活标记。
- 免疫荧光显微镜增强了标记细胞的检测。
研究目的
- 追踪斑马鱼胚胎中特定细胞的系谱。
- 了解胚胎发育过程中的细胞命运决定。
- 提供一种可靠的方法，用于研究体内细胞行为。
使用的方法
- 合成笼内荧光素并注入斑马鱼胚胎。
- 将胚胎固定在琼脂上以便于细胞的可及性。
- 使用紫外激光激活笼内荧光素。
- 在特定发育阶段收集胚胎进行分析。
主要结果
- 成功标记了斑马鱼胚胎中的目标细胞。
- 通过免疫荧光显微镜清晰地可视化了细胞命运。
- 证明了紫外解笼在系谱追踪中的有效性。
- 对标记细胞的发育路径有了新的认识。
结论
- 该方法为研究斑马鱼细胞系提供了强大的工具。
- 结果有助于理解胚胎发育。
- 未来的应用可能扩展到其他模型生物。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution lineage labeling in zebrafish using laser-uncagable fluorescein dextran enables precise mapping of cell fate, supporting early discovery and mechanistic de-risking in vertebrate developmental models. This approach enhances predictive confidence in target validation and informs translational research by clarifying cellular origins and differentiation pathways. The method's compatibility with immunofluorescent detection and multiplexed marker analysis positions it as a reusable capability for portfolio-wide developmental biology initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental hypotheses by tracing specific cell lineages in vivo.
- Supports functional target validation through high-resolution fate mapping of undifferentiated precursors.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying lineage relationships and cellular differentiation events.
- Improves predictive confidence for downstream target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, lineage-labeled biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Enables quantitative, multiplexed immunofluorescence readouts for robust assay development.
- Supports reproducibility and standardization by allowing precise spatial and temporal control of labeling.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on defined cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental lineage tracing with disease-relevant model systems for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into cell fate and tissue specification.
- Supports biomarker alignment through co-detection of lineage and cell-type specific markers.
- Provides predictive de-risking for preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This lineage labeling method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven mapping of cell fate and developmental pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lineage markers for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers high-resolution, multiplexed immunofluorescence outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling lineage tracing in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable approach for lineage analysis across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental and disease models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of lineage tracing workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and laser-based microscopy techniques.
- Demands access to UV laser-equipped compound microscopes and immunofluorescence infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, uncaging, and detection protocols.
- Adaptable to various tissues and developmental stages within zebrafish embryos.
- Limited to pre-48 hour post-fertilization stages for optimal labeling and detection fidelity.
