Name: 天堂斑马鱼的细胞标记与激光Uncagable荧光葡聚糖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习使用紫外激光解笼锁荧光素技术对斑马鱼胚胎进行细胞谱系标记，结合免疫荧光显微镜追踪特定细胞的命运。该方法为发育生物学研究提供了强大的活体细胞行为分析工具。

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我们感谢 Dan Carlin 在制备笼锁型荧光素方面提供的帮助。此外，我们还要感谢以下资助来源：Vanderbilt 大学医学院发育生物学培训项目对 JAC 的资助，以及 NIH HD054534 对 JTG 的资助。

1. 笼锁型荧光素葡聚糖的合成
<ol>
	<li>称取 3.5 - 4 mg 氨基葡聚糖，加入 Invitrogen 提供的避光管中，管内含有 1 mg CMNB 保护的荧光素琥珀酰亚胺酯。据我们经验，该比例可实现平均每分子葡聚糖偶联约 2.5 个染料分子。</li>
	<li>向管中加入 500 μL 0.1 M Na2B4O7（硼酸钠）缓冲液。</li>
	<li>盖紧管盖，涡旋振荡 30 秒，使氨基葡聚糖和保护型荧光素充分溶解。</li>
	<li>在涡旋混合器上反应过夜。</li>
	<li>拧下 Zeba 离心柱底部的封闭端，松开上端盖子。用记号笔在柱体上标记一个点。将柱体放入一个 15-mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。柱体压缩后应立即使用。</li>
	<li>将压缩后的柱体转移至一个新的 15-mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>合并反应混合物，并转移至压缩柱树脂床的中心位置。盖上盖子。</li>
	<li>以 1000 × g 离心 2 分钟，标记点朝向转子中心。离心后，流出液与柱体上部颜色应大致呈现相同深浅的黄色。</li>
	<li>将黄色流出液（约 350 μL）转移至 1.5-mL 微量离心管中。</li>
	<li>在真空浓缩仪中冻干至完全干燥。用铝箔覆盖真空浓缩仪。</li>
	<li>将所得的约 2-3 mg 浅黄色泡沫重新溶于水，配制成终浓度为 1% w/v 的溶液。</li>
	<li>将该溶液分装后置于 -20 °C 保存，使用铝箔包裹离心管。建议将葡聚糖溶液分装保存，以避免反复冻融。</li>
</ol>
2. 向斑马鱼胚胎注射笼锁型荧光素葡聚糖
<ol>
	<li>将1% w/v的笼锁荧光素葡聚糖储备液用0.2 M KCl稀释5倍或10倍。</li>
	<li>使用压力注射仪将0.5–1.0 nL笼锁荧光素溶液注入单细胞期胚胎的卵黄中。注射后，胚胎必须在28.5°C避光保存，以减少非特异性解笼反应。</li>
	<li>手动去除胚胎的绒毛膜。</li>
	<li>用4%三卡因麻醉胚胎。</li>
	<li>将胚胎固定于35 mm × 10 mm培养皿中的0.8%琼脂糖中，然后用胚胎培养液覆盖。</li>
	<li>将融化的琼脂糖置于50°C金属浴中平衡至少15分钟。</li>
	<li>使用玻璃移液器吸取少量水中的一个胚胎，并将其释放至琼脂糖中。注意：在将胚胎放入管中前，务必将装有琼脂糖的管子在手中冷却约30秒，以避免杀死胚胎。</li>
	<li>用移液器吸取胚胎及约50 μL琼脂糖，将内容物排至培养皿中央。</li>
	<li>使用塑料细丝迅速调整胚胎方向，使待解笼的细胞朝上。注意：琼脂糖会迅速冷却凝固，因此调整胚胎方向需迅速。若在琼脂糖变硬后操作，可能损伤胚胎。</li>
	<li>待琼脂糖完全凝固（需几分钟），然后加入含4%三卡因和0.003% PTU的胚胎培养液至培养皿三分之二满。</li>
</ol>
3. 荧光素葡聚糖的激光解笼
<ol>
	<li>用于解笼的显微镜必须配备40倍水浸物镜。</li>
	<li>我们使用Photonics Instruments激光器，配备365 nm染料池和70%/30%分光二向色镜。</li>
	<li>在解笼前，必须将激光与物镜调至齐焦，并将激光功率衰减至适当水平。</li>
	<li>为聚焦激光，将镜面玻璃载片置于物镜下方，调节物镜直至载片上的划痕清晰可见。</li>
	<li>调节激光衰减器，直至激光单次脉冲即可在镜面上产生清晰可见的划痕。</li>
	<li>上下调节物镜焦点。若在物镜失焦时激光仍能产生划痕，则将激光焦点上下调节¼圈。重复此步骤，直至仅在物镜聚焦时激光才能在镜面上产生划痕。</li>
	<li>将固定好的胚胎置于物镜下，聚焦于待解笼区域。</li>
	<li>进行解笼时，聚焦于目标细胞，并以2-3 Hz频率脉冲照射10-20次。</li>
	<li>解笼后，用镊子剥离琼脂糖，将胚胎释放并转移至含有0.003% PTU的卵水溶液中。将胚胎置于避光盒中培养，直至固定。</li>
</ol>
4. 抗体标记及去笼化荧光素葡聚糖的检测
<ol>
	<li>用 Ab 固定液（4% 多聚甲醛，0.3 mM CaCl₂）固定胚胎2，8% 蔗糖，1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.3）在室温（RT）下孵育 2 至 4 小时，或在 4°C 过夜（O/N） 4°C将胚胎在所有标记步骤中置于避光盒或用铝箔包裹的管中。</li>
	<li>去除固定液，加入100%甲醇，室温放置10分钟，去除甲醇并更换为新鲜的100%甲醇。</li>
	<li>在 -20 °C 下以甲醇保存20°C 至少 30 分钟。 注意： 可在甲醇中保存长达两周，之后表位开始降解。</li>
	<li>用以下溶液在室温下依次洗涤胚胎：75% 甲醇/1×磷酸盐缓冲液（含0.1% Tween 20，即1×PBSTw）洗涤5分钟，然后用50% 甲醇/50% 1×PBSTw洗涤5分钟，最后用25% 甲醇/75% 1×PBSTw洗涤5分钟。</li>
	<li>用 1×PBSTw 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>如果胚胎是 &gt;24小时龄，用 permeabilize 胚胎 10 μg/mL 蛋白酶K置于1×PBSTw中。通透时间取决于样本发育阶段。若胚胎处于受精后24至48小时（hpf），在蛋白酶K中处理5分钟即可；对于更晚期的幼体，可能需要更长时间。室温下用Ab固定液再固定20分钟。</li>
	<li>在室温下用1×PBSTw洗涤5次，每次5分钟。</li>
	<li>在孵育液（1×PBS，0.1% Triton X-100，10% 羊血清，10% 牛血清白蛋白，1% 二甲基亚砜）中室温孵育 1–2 小时。</li>
	<li>在封闭液中稀释一抗（抗荧光素抗体及针对细胞类型特异性标记物的抗体）。</li>
	<li>孵育胚胎过夜于 4°C 在含有初级抗体的溶液中。</li>
	<li>在室温下，用含0.1% Triton X-100的1×磷酸盐缓冲盐水（PBSTx）洗涤四次，每次20分钟。</li>
	<li>在封闭液中按1:300比例稀释荧光标记的二抗。</li>
	<li>孵育过夜于 4°C 在含有二抗的溶液中。</li>
	<li>室温下用1×PBSTx洗涤四次，每次20分钟。</li>
	<li>在室温下用50%甘油/50% 1×PBS透明胚胎至少2小时，然后去除甘油/PBS混合液，加入100%甘油，4℃过夜静置 4°C.</li>
</ol>
5. 代表性结果：
免疫标记后，去笼细胞中应出现染色富集区域（图1）。观察到相对较高的信噪比并不罕见 &gt;48小时大的斑马鱼，由于荧光素的自发解笼所致。
<img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="foxd3:GFP 和荧光素标记物，背侧视图荧光显微镜观察；基因表达分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 斑马鱼松果体复合体的谱系标记。在受精后24小时（24 hpf），通过UV激光脉冲对由foxd3:GFP表达所指示的前部松果体原基的一部分进行光解激活。A) 到48小时（48 hpf）时，从光解激活区域（白色圆圈）中出现了一个位于左侧的细胞簇，称为副松果体（红色圆圈）。B) 光解激活的荧光素信号在副松果体（红色圆圈）和松果体器官（白色圆圈）中富集。

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

如所述，本方案提供了一种相对快速的斑马鱼谱系标记方法，该方法基于常用的显微注射、显微观察和免疫荧光技术。我们发现，激光解笼是局部解笼荧光素最高效且成本效益最高的方式。该方法可用于实验终点长达4天的谱系标记。然而，随着细胞分裂，每个细胞中的笼锁荧光素浓度最终会降低至无法检测的水平。此外，已有文献报道在斑马鱼幼体中存在自发性、非特异性的荧光素解笼现象11。因此，对解笼荧光素的检测在早期幼体阶段（48–72小时）或更早时期最为有效。
我们首选的解笼方法是使用脉冲氮激光器。这类激光器通常用于细胞消融实验，能够准确定位并解笼单个细胞或少量细胞群11-12。然而，解笼也可以通过共聚焦显微镜实现；双光子共聚焦显微镜已被用于实现极为精确的解笼12。在另一端，如果不需要高精度，则可以不使用激光器。配备DAPI滤光片组的落射荧光显微镜可通过一个小针孔实现解笼11。
我们发现，使用一抗检测去笼化荧光素，并结合在红色或远红波长（例如 Alexa 633）发射荧...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-笼锁型荧光素 SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>氨基葡聚糖，10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱盐离心柱</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗荧光素抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 驴抗山羊抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>配备 40 倍水浸物镜的直立复合显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint 手动激光照射系统</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯硫脲（PTU）</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>塑料细线</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>压力注射仪</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

使用激光解笼荧光素葡聚糖对斑马鱼细胞进行谱系标记

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

发育生物学中的一个核心问题是推断脊椎动物中众多细胞类型的起源，即这些细胞如何从非特化的前体细胞逐步产生。研究人员已采用多种谱系标记方法，例如DiI标记1和可追踪酶的压力注射2，以确定模式生物在发育后期阶段的细胞命运。最早的斑马鱼（Danio rerio）命运图谱是通过在胚胎特定区域的单个细胞中电泳注射荧光染料（如罗丹明葡聚糖），并随时间追踪标记细胞的归宿而建立的3-5。尽管这些方法有效，但其技术要求较高，且需要斑马鱼实验室中通常不具备的专用设备。近年来，光转化荧光蛋白（如Eos和Kaede）在斑马鱼中的应用日益广泛6-8，这类蛋白在紫外光照射下会不可逆地从绿色荧光转变为红色荧光。由于斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性，且转基因操作相对简便，这些工具特别适用于体内细胞谱系标记及细胞迁移的观察in vivo7。尽管如此，与染料介导的谱系标记方法相比，这些蛋白仍存在一些不足。其中最关键的是我们在进行蛋白光转化时难以获得高精度的三维分辨率。在此背景下，目前用于斑马鱼谱系标记、兼具高分辨率与操作便捷性的最佳选择可能是使用笼锁型荧光素葡聚糖（caged fluorescein dextran）——一种与淬灭基团结合而使其荧光被屏蔽的荧光染料9。该染料可通过激光或汞灯发出的紫外光在特定细胞内“解笼”（即从淬灭基团中释放），从而使其荧光得以显现或可通过免疫学方法检测。与电泳注射法不同，笼锁型荧光素可使用常规显微注射装置注入，并借助带针孔的落射荧光显微镜进行解笼10。此外，抗荧光素抗体仅识别解笼后的形式，且该抗原表位在固定过程中保持稳定11。最后，笼锁型荧光素可实现极高的三维分辨率激活，尤其是在采用双光子显微镜时效果更佳12,13。本实验方案描述了利用笼锁型荧光素及激光解笼进行谱系标记的方法，并进一步通过抗体标记实现解笼后荧光素与其他抗原表位（如GFP）的同步检测。

本方案阐述了一种利用紫外光解笼释放荧光素的方法，对斑马鱼胚胎中少量细胞进行标记并追踪其命运，随后通过整体免疫标记放大光解后荧光素的信号。

发育生物学中的一个核心问题是推断脊椎动物中多种多样的细胞类型在从非特化细胞产生时各自的起源……

本实验的总体目标是对斑马鱼胚胎中的细胞进行谱系标记。首先合成笼锁型荧光素并将其注射到斑马鱼胚胎中，随后将胚胎固定在琼脂糖中，以便对需要标记的细胞进行操作。接下来，使用紫外激光激活胚胎中选定细胞内的笼锁型荧光素。最后，在胚胎发育至目标阶段后将其收集，并检测标记细胞与特定谱系标志物之间的关系。最终，通过光解笼锁和免疫荧光显微技术，可以获得显示胚胎中选定细胞命运的结果。与现有的 Cade 光转化等技术相比，该技术的主要优势在于多色免疫荧光不仅可以检测解笼的荧光素，还能同时检测其他细胞类型特异性抗体。要将笼锁荧光素葡聚糖注入斑马鱼胚胎，首先需合成该化合物，并配制成 1%（重量/体积）的溶液，然后根据随附的书面实验方案分装保存。接下来，用0.2摩尔氯化钾溶液将稀释剂按1:5或1:10的比例稀释。随后，使用压力注射器将0.5至1纳升的笼锁型荧光素溶液注入单细胞期胚胎的卵黄中。注射完成后，必须将胚胎群体置于28.5摄氏度的黑暗环境中培养，以减少在目标发育阶段发生非特异性解笼反应。用手动方法从胚胎中去除绒毛膜，将胚胎在4%三卡因中麻醉后进行固定。将0.8%熔化的琼脂糖置于50摄氏度的加热块中，平衡至少15分钟。然后将离心管用手冷却约30秒。在添加胚胎前，使用玻璃移液器吸取少量水中的一个胚胎，并将其释放到琼脂糖中。用移液器将胚胎连同约50微升琼脂糖从离心管中移出，并将内容物排至直径35毫米、高10毫米的培养皿中央。使用塑料细线快速将胚胎调整至待解笼的细胞朝上的位置。让琼脂糖完全凝固并充满培养皿，加入含 4% 三卡和 0.003% PTU 的卵水至三分之二满，将胚胎置于避光盒中直至进行解笼操作。为了对荧光素葡聚糖进行激光解笼，需使用配备40倍水浸物镜的复合显微镜。我们采用Photonics Instruments激光器，配备365纳米染料池和70%30%分光的二向色镜，用于解笼前操作。激光必须与物镜调至共焦，并将功率衰减至适当水平，以聚焦激光。将一面带有镜面的玻璃载玻片置于物镜下方，调节物镜焦距，直至载玻片上的划痕清晰可见。调节激光衰减器，使激光单次脉冲即可在镜面上产生清晰可见的划痕，同时上下调节物镜焦距。若物镜离焦时激光仍能产生划痕，则将激光焦点调节四分之一圈。调节激光强度，反复调试直至激光能够刻蚀镜面。只有当物镜聚焦后，方可将固定好的胚胎置于物镜下，聚焦至待解笼区域进行解笼。聚焦于目标细胞，在2至3赫兹频率下脉冲刺激10到20次。光解后，用镊子剥离卵膜，将胚胎放入含有0.003% PTU的卵水中。在室温下用抗体固定液固定胚胎2至4小时，或在4摄氏度下过夜固定。移除固定剂，并加入100%甲醇。室温孵育10分钟。然后移除甲醇，更换为新鲜的100%甲醇。将胚胎置于甲醇中，在负20摄氏度下保存至少30分钟。甲醇中保存时间最长可达两周，之后抗原表位将开始降解。用以下溶液在室温下进行重水化：75%甲醇、25%一倍磷酸盐缓冲液（含0.1%吐温20）洗涤5分钟，接着用50%甲醇、50%一倍PBS-Tween 20洗涤，然后用25%甲醇、75%一倍PBS-Tween 20洗涤，最后用一倍PBS-Tween 20洗涤三次，每次5分钟。若胚胎超过24小时，使用每毫升10微克的蛋白酶K在含吐温20的1倍XPBS中进行通透处理，通透时间取决于胚胎发育阶段。蛋白酶K处理5分钟即足够。如果胚胎处于受精后24至48小时之间，较老的幼虫可能需要更长时间。在室温下用抗体固定剂重新固定20分钟。在室温下，用含吐温20的1倍XPBS溶液将胚胎洗涤五次，每次五分钟。然后在室温下用封闭液孵育一至两小时。用封闭液稀释一抗。随后在4°C条件下于含一抗的溶液中过夜孵育胚胎，次日早晨用1×PBS-Triton X-100洗涤胚胎四次，并用封闭液稀释荧光标记的二抗。将胚胎在含有二抗的溶液中于 4°C 下孵育过夜。用含 Triton X-100 的 1×PBS 洗涤四次后，将胚胎置于 50% 甘油和 50% 1×PBS 的混合液中，在室温下透明化处理至少两小时。随后移除甘油-PBS 混合液，加入 100% 甘油，并于 4°C 下孵育过夜。对照组和光解笼锁幼虫的代表性结果以共聚焦投影图形式展示。对照组胚胎注射了笼锁型荧光素，但在受精后48小时未进行光解笼锁处理。该对照组胚胎在松果体复合体中显示出GFP标记。可见一些点状背景标记，但未检测到标记的荧光素有局部聚集。光解笼胚胎显示出在部分GFP标记细胞中有明显的解笼荧光素聚集。这些细胞是24小时前经光解笼处理所靶向细胞的后代，略有修改。该方法可用于在受精后48小时之前对斑马鱼胚胎中几乎所有组织进行谱系标记。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

天堂斑马鱼的细胞标记与激光Uncagable荧光葡聚糖

本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。...

斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。...

斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

濒死细胞通过邻近细胞的协同收缩从上皮组织中被挤出，而不会破坏其屏障功能。斑马鱼发育过程中具有良好的光学通透性，为在活体上皮中可视化观察细胞挤出提供了优良的实验系统。本文中，我们描述了在幼年斑马鱼表皮中诱导并以细胞分辨率成像细胞挤出的方法。...

活体成像观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

功能-间隔基-脂质（FSL）构建体可在不丧失活力的情况下修饰活细胞和病毒颗粒的表面特性。该方法仅需将FSL构建体溶液与细胞/病毒颗粒接触，即可实现自发且稳定的表面整合。...

FSL构建体：一种在不影响细胞/病毒体活力的前提下，通过多种生物标记物修饰其表面的简易方法

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

对单个细胞进行靶向操作以引发定向应激或死亡，一直以来较难实现。本文介绍一种基于标准共聚焦紫外激光的单细胞分辨率消融方法，可在细胞培养体系及活体动物中选择性地对单个细胞施加应激并诱导其死亡。...

使用常规紫外激光共聚焦显微镜诱导细胞应激与死亡

纤毛发育对正常器官形成至关重要。本方案描述了一种优化的方法，用于标记和观察斑马鱼的纤毛细胞。...

通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

激光消融是一种广泛适用于研究生物系统再生的技术。本方案描述了如何使用标准的激光扫描共聚焦显微镜对斑马鱼侧线中的中间神经丘细胞进行激光消融，并随后进行再生过程的延时成像。...

基于共聚焦显微镜的斑马鱼中间神经丘细胞激光消融与再生检测方法

在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内...

荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

学习使用紫外激光解笼锁荧光素技术对斑马鱼胚胎进行细胞谱系标记，结合免疫荧光显微镜追踪特定细胞的命运。该方法为发育生物学研究提供了强大的活体细胞行为分析工具。

使用激光解笼荧光素葡聚糖对斑马鱼细胞进行谱系标记

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