Name: 协同刺激信号封锁的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞同种异体抗原特异性无能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 了解如何通过阻断协同刺激信号诱导人外周血单个核细胞产生同种异体抗原特异性无能。该方法利用抗B7.1和B7.2抗体阻断CD28共刺激，通过混合淋巴细胞反应评估T细胞反应性，为异基因造血干细胞移植后改善免疫重建、减少移植物抗宿主病提供临床策略。

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由美国国立卫生研究院（U19 CA100625 和 R21 CA137645）资助。JKD 获得白血病与淋巴瘤学会以及美国血液与骨髓移植学会/大冢新研究者奖的支持。

1. PBMC 的制备
<ol>
	<li>在实施本方案期间，必须遵守良好的无菌操作技术和通用预防措施。</li>
	<li>通过使用Ficoll-Hypaque进行密度梯度离心，从健康志愿者供体中分离外周血单个核细胞（PBMC）。或者，可复苏冻存的PBMC。</li>
	<li>用台盼蓝染色后，使用血细胞计数板计数活PBMC。将PBMC重悬于完全培养基（CM）中，调整浓度为每毫升含100万个活细胞，置于15 mL Falcon管中。</li>
</ol>
2. 建立大规模异体无能共培养体系
<ol>
	<li>需要两个不同供体的外周血单个核细胞（PBMC）来建立同种无能化培养体系。其中一个供体的细胞作为反应细胞，另一个供体的细胞作为刺激细胞（称为第一方刺激细胞）。</li>
	<li>将1000万个刺激性PBMC以100万个/mL的浓度置于15 mL Falcon管中，加入100 mg抗B7.1抗体和100 mg抗B7.2抗体以阻断共刺激。轻轻混匀管内液体，孵育30分钟。本步骤及后续所有步骤的孵育条件均为 37°C/5% CO₂2/80% 湿度</li>
	<li>照射刺激剂PBMC（33 Gy），并加入T-25培养瓶中，体积为50 cm³3 带有透气盖的细胞培养瓶。将培养瓶标记为“Bulk alloanergizing co-culture”。</li>
	<li>加入10 mL应答者PBMC（以100万个/mL浓度溶于CM中）至培养瓶中。</li>
	<li>再加入各100mg的抗B7.1和抗B7.2抗体，轻轻混匀，然后将培养瓶 upright 放置在培养箱中孵育72小时</li>
</ol>
3. 建立大体积对照共培养体系
<ol>
	<li>将1000万个刺激性PBMC（浓度为100万个/mL）置于15 mL Falcon离心管中。</li>
	<li>对1000万个刺激性PBMC进行照射（33 Gy），然后加入50 cm3细胞培养瓶中。标记为“批量对照共培养”。</li>
	<li>向培养瓶中加入10 mL应答性PBMC（浓度为100万个/mL，用完全培养基CM），轻轻混匀，随后将培养瓶直立放入培养箱中培养72小时。</li>
</ol>
4. 建立初始混合淋巴细胞反应（MLR）以评估共刺激阻断的效力
<ol>
	<li>共刺激阻断的有效性通过初始混合淋巴细胞反应（MLR）进行测定，该反应使用来自大量同种无能化共培养物和对照共培养物的外周血单个核细胞（PBMC）建立。</li>
	<li>初始MLR与大量共培养物在同一天建立。</li>
	<li>首先为需要检测的三个时间点（设板后第4、5、6天）分别标记一个U型底96孔板，标注为“初始MLR”。</li>
	<li>将5mL细胞悬液从每个大量对照共培养物和同种无能化共培养物中转移至15mL Falcon离心管中。</li>
	<li>从每个Falcon管中吸取200µL细胞悬液，分别加入每块板的三个复孔中。将来自大量对照共培养物的细胞孔标记为“无共刺激阻断（CSB）”，来自大量同种无能化共培养物的细胞孔标记为“CSB”。</li>
	<li>在每块板上加入200µL完全培养基（CM）至6个孔中作为阴性对照。向所有空孔中加入200µL PBS以减少蒸发。将各板放入培养箱中。</li>
</ol>
5. 建立二次混合淋巴细胞反应以评估同种无能化的有效性
<ol>
	<li>在建立大规模共培养体系72小时后，通过二次混合淋巴细胞反应（MLR）检测经同种无应答处理的外周血单个核细胞（PBMC）中残余的同种异体反应。在二次MLR中，分别从大规模同种无应答共培养体系和大规模对照共培养体系中收集PBMC，洗涤后用照射处理的同种异体刺激PBMC重新刺激。</li>
	<li>为设置二次MLR，为每个待测时间点（建立后第3、5和7天）准备一个U型底96孔板，并标记为“二次MLR”。</li>
	<li>从每个大规模对照共培养体系和同种无应答共培养体系中取出5 mL培养物，转移至15 mL Falcon管中，以2000 rpm离心5–10分钟。小心吸除上清液，重悬细胞沉淀，加入10 mL完全培养基（CM），再次离心。重复该洗涤步骤一次。</li>
	<li>将细胞重悬于1 mL完全培养基（CM）中，使用台盼蓝染色法计数活细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万活应答细胞。</li>
	<li>从每个Falcon管中吸取100 µL细胞悬液，加入每块板的三个重复孔中，并将这些孔标记为“第一方（FP）同种再刺激”。</li>
	<li>从每个Falcon管中另取100 µL细胞悬液，加入每块板的另外3个孔中，并将这些孔标记为“CD3/28刺激”。</li>
	<li>为准备二次MLR的刺激细胞，从与同种无应答及对照培养中所用相同健康供体的新鲜血液中分离PBMC（或复苏冻存的PBMC）。</li>
	<li>将来自第一方（FP）供体的PBMC重悬至浓度为100万/mL，并进行照射处理（33 Gy）。</li>
	<li>向标记为“FP同种再刺激”的孔中加入100 µL照射后的刺激细胞。</li>
	<li>作为阳性对照，在标记为“CD3/28刺激”的孔中加入CD3和CD28单克隆抗体各1 µL及98 µL完全培养基（CM）。每块板另设6个孔加入200 µL完全培养基（CM）作为阴性对照，并向空孔中加入200 µL PBS。将各板放入培养箱中孵育。</li>
</ol>
6. 测量异体无能化的特异性
<ol>
	<li>通过在次级混合淋巴细胞反应（MLR）中，使用来自“第三方”健康供体（即不同于第一供体的供体）的照射外周血单个核细胞（PBMC）刺激后，比较来自已完成的异体无能化共培养体系与对照共培养体系的应答细胞增殖情况，以确定异体无能化的特异性。</li>
	<li>标记三个96孔板，分别注明“次级MLR特异性”第3天、第5天和第7天。</li>
	<li>从各组大体积对照组和异体无能化共培养体系中分别取出5 mL，转移至15 mL Falcon管中，在2000 rpm条件下离心5–10分钟。小心吸除上清液，重悬细胞沉淀，加入10 mL完全培养基（CM），再次离心。重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>将细胞重悬于1 mL完全培养基（CM）中，使用台盼蓝染色法计数，并调整细胞浓度至每毫升含100万活应答细胞。</li>
	<li>为准备次级MLR中的第三方刺激细胞，从新的健康供体的新鲜血液中分离PBMC（或复苏冻存的PBMC）。从每个Falcon管中吸取100 µL细胞悬液，分别加入各板的三个复孔中。将这些孔标记为“第三方异体刺激”（TP allostimulation）。</li>
	<li>将来自第三方供体的PBMC以每毫升100万细胞的浓度重悬，并进行照射处理（33 Gy）。</li>
	<li>向标记为“第三方异体刺激”的孔中每孔加入200 µL照射后的第三方刺激细胞。</li>
	<li>异体无能化的特异性也可通过比较来自已完成的异体无能化共培养体系与对照共培养体系的应答细胞，在受到如巨细胞病毒（CMV）等感染性病原体刺激后的增殖情况来确定。此步骤中，必须使用先前已证实对CMV裂解物具有增殖反应的供体来源的应答PBMC。</li>
	<li>标记三个96孔板，分别注明“次级MLR CMV”第3天、第5天和第7天。</li>
	<li>为准备用于检测CMV应答的次级MLR应答细胞，从各组大体积对照组和异体无能化共培养体系中各取5 mL，转移至15 mL离心管中，按前述方法进行洗涤、计数，并以完全培养基（CM）重悬为每毫升含100万细胞的浓度。从每个Falcon管中吸取100 µL细胞悬液，分别加入各板的3个孔中。</li>
	<li>向各孔中加入含0.1 mL CMV裂解物的100 µL完全培养基（CM）。</li>
	<li>在所有板上各设6个孔，每孔加入200 µL完全培养基（CM）作为阴性对照，并向空孔中加入200 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。将各板放入培养箱中孵育。</li>
</ol>
7. 测定原代和继代混合淋巴细胞反应中的增殖
<ol>
	<li>通过胸苷掺入法检测初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）中应答细胞的增殖情况。初次MLR培养板建立后第4、5、6天，以及再次MLR培养板建立后第3、5、7天测定细胞增殖。</li>
	<li>在收获前16小时，向各孔加入1 µCi的氚标记胸苷</li>
	<li>加入氚标记胸苷后，将培养板继续孵育16小时，随后使用Tomtec细胞收集器（或类似设备）将细胞收集至滤膜上。滤膜室温晾干1小时，放入样品袋中，加入5 mL闪烁液并密封。使用Wallac Micro beta闪烁计数器或类似仪器读取数据。</li>
</ol>
8. 计算共刺激阻断在初次混合淋巴细胞反应（MLR）中的有效性
<ol>
	<li>初始同种反应的抑制百分比（PI）计算公式为 100 × [同种刺激孔的平均 cpm 值（bulk alloanergy co-culture PBMC）－ 同种刺激孔的平均 cpm 值（bulk control co-culture PBMC）] 
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="细胞增殖指数公式；PI=100－{100×cpm(初级MLR+CSB)/cpm(初级MLR无CSB)}" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>
9. 计算同种无能化在二次混合淋巴细胞反应中的效果
继发性同种异体反应的增殖指数（PI）计算公式为 
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="增殖指数公式，免疫学中的PI方程，细胞增殖率计算。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2">
10. 计算二次混合淋巴细胞反应中异体无能化的特异性
<ol>
	<li>使用 CD3 和 CD28 重新刺激细胞后，也可通过该公式计算细胞对 TP 同种刺激物或 CMV 抗原刺激反应的增殖指数（PI）。这可以衡量同种无能化过程的特异性</li>
</ol>
11. 异基因造血干细胞移植（HSCT）后用于临床的供者异源耐受性PBMC的制备
<ol>
	<li>在HLA不匹配的同种异体造血干细胞移植（HSCT）后，可按照上述方案制备用于临床的供体异体无反应性外周血单个核细胞（PBMC）</li>
	<li>当为临床用途制备细胞时，效应细胞（responder PBMC）取自HSCT供体，刺激细胞（stimulator PBMC）则取自移植前的HSCT受体</li>
	<li>当为临床用途制备PBMC时，所有操作均须在经认证的干细胞处理机构中，按照药品生产质量管理规范（GMP）条件进行</li>
	<li>需进行额外的质量控制检测，包括内毒素检测、革兰染色以及微生物培养，以满足细胞放行用于临床前的安全性标准</li>
</ol>
12. 代表性结果
使用HLA不匹配的刺激细胞和反应细胞外周血单个核细胞（PBMC），在初次混合淋巴细胞反应（MLR）中加入共刺激阻断后，反应细胞PBMC在第5天的平均同种增殖水平降低至无共刺激阻断对照组的约30%（±10%，均值±标准差）。这相当于在第5天对初次同种增殖的平均抑制率达到约70%（±10%），图1 A和B。
在第5天的二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，经同种无应答处理的外周血单个核细胞（PBMC）对荧光标记同种刺激细胞（FP allostimulators）的增殖反应通常仅为对照组PBMC的10-15%（±10%），相当于增殖抑制率达到85-90%（±10%），图2A和B。这表明经同种无应答处理的PBMC对荧光标记同种刺激细胞呈现低反应性。
相比之下，同种异体无能化的外周血单个核细胞通常对有丝分裂原（CD3/CD28抗体）、第三方同种异体刺激细胞以及巨细胞病毒裂解物（在对巨细胞病毒有反应性的供体中）仍保持70-100%的增殖能力。这表明，同种异体无能化外周血单个核细胞的低反应性特异性地针对供体来源的同种异体抗原。
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="共刺激阻断对细胞增殖的影响：计数/分钟与天数的关系图，抑制数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. A. 在无或有共刺激阻断（使用人源化单克隆抗-B7.1 和抗-B7.2 抗体）条件下，采用HLA不匹配的刺激细胞和反应细胞外周血单个核细胞（PBMC）进行初次混合淋巴细胞反应（MLR）时的细胞增殖情况（通过胸苷掺入法测定）。结果展示为8次代表性实验的均值（±标准差），每组实验使用不同的刺激细胞-反应细胞配对。B. 在存在共刺激阻断（使用人源化单克隆抗-B7.1 和抗-B7.2 抗体）条件下进行的初次MLR中，同种异体增殖的抑制百分比。结果展示为与图1A中相同的8组独特刺激细胞-反应细胞配对的均值（±标准差）。
<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="PBMC增殖与抑制图；双线图；计数 vs. 天数；百分比 vs. 天数；免疫学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. A. 在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，通过胸苷掺入法测定增殖情况，其中来自初次MLR的反应PBMC（在无共刺激阻断条件下进行的为对照PBMC，或在存在共刺激阻断条件下的为同种无能PBMC）被照射后的第一方刺激细胞再次刺激。结果以图1所示的8个不同刺激细胞-反应细胞配对的均值（±标准差）表示。B. 在二次MLR中，当来自初次MLR的反应PBMC（在无共刺激阻断条件下为对照PBMC，或在存在共刺激阻断条件下为同种无能PBMC）被照射后的第一方刺激细胞再次刺激时，对第一方同种异体增殖的抑制百分比。结果以图1及图2A所示8个不同刺激细胞-反应细胞配对的均值（±标准差）表示。

<ol><li>Ferrara, J. L., Levy, R., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologic+mechanisms+of+acute+graft-vs.-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologic mechanisms of acute graft-vs.-host disease.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 5, 347-356 (1999).</li>
<li>Keever, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reconstitution+following+bone+marrow+transplantation%3A++Comparison+of+recipients+of+T-cell+depleted+marrow+with+recipients+of+conventional+marrow+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immune reconstitution following bone marrow transplantation: Comparison of recipients of T-cell depleted marrow with recipients of conventional marrow grafts.</a> Blood. 73, 1340-1350 (1989).</li>
<li>Bacigalupo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+leukemia+relapse+with+high-dose+cyclosporine+A+after+allogeneic+marrow+transplantation+for+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased risk of leukemia relapse with high-dose cyclosporine A after allogeneic marrow transplantation for acute leukemia.</a> Blood. 77, 1423-1428 (1991).</li>
<li>Horowitz, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-leukemia+reactions+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-leukemia reactions after bone marrow transplantation.</a> Blood. 75, 555-562 (1990).</li>
<li>Andre-Schmutz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reconstitution+without+graft-versus-host+disease+after+haemopoietic+stem-cell+transplantation%3A+a+phase+1%2F2+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Immune reconstitution without graft-versus-host disease after haemopoietic stem-cell transplantation: a phase 1/2 study.</a> Lancet. 360, 130-137 (2002).</li>
<li>Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+with+allodepleted+donor+T-cells+improves+immune+reconstitution+after+haploidentical+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy with allodepleted donor T-cells improves immune reconstitution after haploidentical stem cell transplantation.</a> Blood. 108, 1797-1808 (2006).</li>
<li>Amrolia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+donor+alloreactive+T+cells+without+loss+of+antiviral+or+antileukemic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of donor alloreactive T cells without loss of antiviral or antileukemic responses.</a> Blood. 102, 2292-2299 (2003).</li>
<li>Perruccio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+purging+of+alloreactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Photodynamic purging of alloreactive T cells for adoptive immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation.</a> Blood Cells Mol Dis. 40, 76-83 (2008).</li>
<li>Mielke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+FOXP3%2B+regulatory+T+cells+%28Tregs%29+after+CD25-depleted+allotransplantation+in+elderly+patients+and+association+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of FOXP3+ regulatory T cells (Tregs) after CD25-depleted allotransplantation in elderly patients and association with acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 110, 1689-1697 (2007).</li>
<li>Gribben, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+blockade+of+B7+family-mediated+costimulation+is+necessary+to+induce+human+alloantigen-specific+anergy%3A+a+method+to+ameliorate+graft-versus-host+disease+and+extend+the+donor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Complete blockade of B7 family-mediated costimulation is necessary to induce human alloantigen-specific anergy: a method to ameliorate graft-versus-host disease and extend the donor pool.</a> Blood. 87, 4887-4893 (1996).</li>
<li>Davies, J. K., Yuk, D., Nadler, L. M., Guinan, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alloanergy+in+human+donor+T+cells+without+loss+of+pathogen+or+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Induction of alloanergy in human donor T cells without loss of pathogen or tumor immunity.</a> Transplantation. 86, 854-864 (2008).</li>
<li>Davies, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+alloanergized+haploidentical+bone+marrow+transplantation+after+ex+vivo+costimulatory+blockade%3A+results+of+2+phase+1+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Outcome of alloanergized haploidentical bone marrow transplantation after ex vivo costimulatory blockade: results of 2 phase 1 studies.</a> Blood. 112, 2232-2241 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

通过在共刺激阻断存在的情况下对供者外周血单个核细胞（PBMC）进行同种抗原刺激，诱导针对同种抗原的低反应性或无能状态，是一种简便的技术，可用于制备同种反应性降低的供者PBMC。我们已在实验室中建立了该技术流程，并正在临床中应用此策略，以制备同种反应性降低的供者PBMC，用于HLA不相合的异基因造血干细胞移植（HSCT）后的输注。采用此类治疗的目的是在不增加毒性的前提下改善免疫重建。尽管目前该策略的临床应用仅限于异基因HSCT的情境，但该方法也可应用于其他由异常T细胞反应导致组织损伤的情况，例如实体器官移植排斥反应或自身免疫性疾病。
在同种无能化共培养过程中，可使用多种试剂阻断由CD28介导的共刺激信号。本文描述了我们目前采用的方案，即使用临床级人源化鼠单克隆抗体靶向CD28的配体（B7.1和B7.2）。非临床级鼠抗人B7.1和B7.2抗体可从多家供应商商业化获得。此外，也可在同种无能化过程中使用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA）4-免疫球蛋白（Ig）融合蛋白来阻断CD28共刺激。CTLA4-Ig由CTLA4分子的胞外段与IgG Fcγ受体连接而成，可高亲和力结合B7.1和B7.2。使用CTLA4-Ig可实现与人外周血单个核细胞（PBMCs）同种无能化相似的效果和特异性。
异体无能化技术操作简便。可使用新鲜或先前冻存的刺激型外周血单个核细胞，其处理结果无显著差异。该方法仅需一个相对较短的体外孵育步骤，且无需细胞分选操作，从而最大限度地降低了细胞输注前发生细胞死亡和细菌污染的风险，使得该策略在临床规模上应用相对简单。
我们所描述的方法（以及其他选择性降低人细胞同种反应性的方法）的一个局限性在于，目前缺乏一种能够实时检测残余同种反应性的检测手段。增殖实验需要3至5天才能完成，以确认同种反应性的降低程度，而用于临床的细胞必须在这些实验结果出来之前输注给患者。此外，尽管通过胸苷掺入法检测外周血单个核细胞（PBMC）增殖较为简便，但该方法不仅检测T细胞的增殖，还同时检测B细胞及其他细胞亚群的增殖。CFSE染料稀释法可用于检测应答性PBMC，可作为替代实验方法，并能够确定T细胞不同亚群特异性的同种增殖反应。为进一步提升本策略在临床上的应用，一种可行途径是开发并验证一种仅需数小时即可完成的同种反应性检测方法，以便在同种无能化细胞释放用于临床前完成检测。
除了证明该策略的有效性之外，确认异体无能化过程的特异性也非常重要。这可以通过测定针对第三方异体刺激细胞的异体反应性是否相对保留来轻松实现；此外，当对巨细胞病毒（CMV）反应性的供体细胞进行异体无能化时，还可通过检测其对CMV的增殖反应是否得以保留来确认特异性。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Hypaque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200mM</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>人AB血清（热灭活）</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-512</td><td>使用经过验证的批次</td></tr><tr><td>完全培养基（500ml）</td><td></td><td></td><td>440ml RPMI 1640，50ml AB血清，5ml Hepes，5ml 谷氨酰胺，167μL 庆大霉素</td></tr><tr><td>照射仪</td><td>GammaCell 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带透气盖的T-25细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>3056</td><td></td></tr><tr><td>人源化单克隆抗B7.1和抗B7.2抗体</td><td></td><td></td><td>参见实验方案正文</td></tr><tr><td>U型底96孔培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>单克隆CD3抗体</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0178</td><td>用200ml蒸馏水重悬</td></tr><tr><td>单克隆CD28抗体</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM1376</td><td>用200ml蒸馏水重悬</td></tr><tr><td>CMV 2级抗原</td><td>Microbix</td><td>EL-01-02</td><td></td></tr><tr><td>氚标记胸腺嘧啶</td><td>NEN</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1205-440</td><td></td></tr><tr><td>细胞收集器</td><td>Tomtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打印滤膜A</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>滤膜袋</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1450-432</td><td></td></tr><tr><td>1450 MicroBeta TriLux 闪烁计数仪</td><td>Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">null</td></tr></tbody></table>

通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

同种异体造血干细胞移植（AHSCT）为许多患有先天性和获得性血液系统疾病的患者提供了最佳的治愈机会。然而，供体T细胞若对宿主组织产生异体反应并造成损伤，则可能导致移植物抗宿主病（GvHD）1。AHSCT成功面临的一个挑战是在预防GvHD的同时，避免损害供体T细胞的有益作用，特别是免疫重建和防止疾病复发。可通过非特异性地从干细胞移植物中清除供体T细胞，或使用药物性免疫抑制来预防GvHD。但这些方法会增加感染和疾病复发的风险2-4。另一种策略是在移植前，通过受者抗原呈递细胞（APC）对供体T细胞进行异体刺激后，选择性清除具有异体反应性的供体T细胞。早期临床试验表明，此类异体反应性T细胞清除策略在HLA不相合的HSCT后改善了免疫重建，且未导致GvHD显著增加5,6。然而，部分异体清除技术需要专门制备受者来源的APC6,7，且某些方法可能存在脱靶效应，包括清除供体中针对病原体特异性的T细胞8以及CD4调节性T细胞9。另一种替代方法是通过诱导针对异体抗原的特异性低反应性，使异体反应性供体T细胞失活。该方法通过使用受者APC刺激供体细胞，同时阻断CD28介导的共刺激信号来实现10。这种“异体无能化”（alloanergization）策略可在体外减少1至2个数量级的异体反应性，同时保留对病原体和肿瘤相关抗原的T细胞应答能力11。该策略已在2项已完成和1项正在进行的临床小规模研究中成功应用，在HLA不相合的HSCT期间或之后输注经异体无能化处理的供体T细胞，结果显示出快速的免疫重建、较少的感染发生率，以及比接受未经处理的HLA不相合移植的历史对照组更轻的急性和慢性GvHD12。本文中，我们描述了当前用于制备对外源性HLA不相合刺激者外周血单个核细胞（PBMC）产生异体无能化的外周血单个核细胞（PBMC）的技术方案。异体无能化通过在单克隆抗体存在下进行异体刺激来实现，这些抗体靶向B7.1和B7.2配体，以阻断CD28介导的共刺激信号。该技术无需制备特殊的刺激性APC，操作简便，仅需一步相对短暂的体外孵育过程。因此，该方法易于标准化，可用于临床制备具有较低异体反应性但保留针对病原体特异性免疫应答能力的供体T细胞，以在AHSCT背景下进行过继性转移，从而在不引起过度GvHD的前提下促进免疫重建。

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。

异基因造血干细胞移植（AHSCT）为许多患有先天性和获得性血液系统疾病的患者提供了最佳的治愈机会……

以下实验的总体目标是通过在体外使用受者同种抗原刺激受者来源的同种反应性供体T细胞，并同时加入阻断抗体以抑制抗原提呈细胞通过CD28受体对T细胞提供共刺激信号，从而激活这些T细胞。该目标首先通过分离两名不同健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）来实现。随后，将HLA不匹配的PBMC群体在存在针对B7.1和B7.2配体的单克隆抗体的条件下进行共培养，以阻断CD28介导的刺激，建立大规模的同种抗原激活共培养体系。然后通过初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）来评估同种刺激的有效性。最后，通过检测第三方抗原和巨细胞病毒（CMV）特异性反应来评估同种刺激的特异性。实验结果表明，供体T细胞对后续同种抗原刺激呈现低应答状态，而对非同种抗原反应的供体T细胞则保持完整且功能正常。我们已在先前及正在进行的临床试验中成功应用了这一策略，即在HLA错配的干细胞移植期间及之后输注经异体激活的供体T细胞，观察到相较于接受未经处理的HLA错配移植的历史对照受者，免疫重建更佳，感染更少，且急性和慢性移植物抗宿主病的严重程度更低。异体阳极化策略的一个主要优势在于其脱靶效应最小化，因为该技术不会削弱针对病原体特异性或肿瘤相关抗原特异性的T细胞应答，也不会从供体T细胞库中清除CD4+调节性T细胞，表明该操作具有良好的安全性。本实验操作将由本实验室的科研人员Christine Vin完成。第一步是从两名健康的志愿供体中抽取血液。一名供体的细胞将作为反应细胞，另一名供体的细胞将作为刺激细胞。接下来，使用菲可（Ficoll-Paque）通过密度梯度离心法从血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）。用台盼蓝染色少量细胞，使用血细胞计数板对可存活的PBMC进行计数。每个供体的 PBMC 分别使用 10 毫升。将完全培养基以每毫升含 100 万活细胞的浓度加入到各自的 15 毫升锥形管中。指定其中一管供体 PBMC 作为刺激细胞，另一管作为反应细胞，以建立大规模同种异体激活共培养体系。向指定为刺激剂的15毫升离心管中加入100微克抗B 7.1和抗B 7.2抗体。轻轻振荡离心管，并在孵育30分钟后，对刺激剂PBMC进行照射，然后将其加入带有透气盖的T 25 50立方厘米细胞培养瓶中。标记烧瓶中的大量异体混合淋巴细胞培养物。接下来，向烧瓶中加入来自另一供体的10毫升反应者外周血单个核细胞（PBMC），细胞浓度为每毫升100万个，使用完全培养基。向烧瓶中再加入各100微克的抗7.1和抗7.2抗体，轻轻混匀，然后将烧瓶直立放入培养箱中培养72小时。接下来，照射另一份1000万个刺激剂PBMC，用于不加阻断抗体的大量对照共培养，然后将其加入一个T25（25平方厘米）细胞培养瓶中。将该培养瓶标记为大量对照共培养。向培养瓶中加入与大量同种异体激活共培养所用相同的10毫升应答PBMC，细胞密度为每毫升100万个，使用完全培养基，轻轻混匀后，将培养瓶直立放入培养箱中培养72小时。下一步是在进行大量共培养的同一天，测定同种异体刺激的供体T细胞群的功能，为每个要检测的三个时间点分别标记一个U型底96孔板，用于初级混合淋巴细胞反应（MLR）。然后将每个大量对照组和同种异体刺激共培养物中的5毫升培养液倒入15毫升离心管中。接下来，从每根试管中吸取200微升细胞悬液，分别加入三块培养板中的三个复孔中。将来自整体对照冷培养物的细胞所加的孔标记为“无共刺激阻断”或“no co-stimulatory blockade”（no CSB），将来自整体同种异体激活冷培养物的细胞所加的孔标记为“CSB”。然后在每块板的六个孔中各加入200微升完全培养基，作为阴性对照。最后，向所有空孔中加入 200 微升 PBS，以减少蒸发，并将培养板置于培养箱中。在建立大规模共培养体系后 72 小时，为每个待检测的三个时间点分别标记一个 UBO 96 孔板，用于二次混合淋巴细胞反应（MLR）。为准备二次 MLR 的应答细胞，从每个大规模对照组和同种异体刺激共培养体系中转移 5 毫升至 15 毫升离心管中，在室温下以 2000 转/分钟离心 5 到 10 分钟。随后再清洗细胞两次：小心吸除上清液，重悬沉淀，每管加入 10 毫升完全培养基，第二次清洗后再次离心收集细胞。用1毫升完全培养基重悬细胞。使用台盼蓝染色法计数活细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万个活应答细胞。从每根试管中吸取100微升细胞悬液，加入到每块板的三个复孔中。首先将这些孔标记为同源刺激（FP）或异源刺激（alloy stimulation）。然后从每根试管中吸取100微升细胞悬液，分别加入到每块板上的另外三个孔中，并将这些孔标记为CD3/28刺激。使用同一供体的外周血单个核细胞（PBMC）作为同源刺激PBMC的来源。活化后的和对照共培养的细胞用作二次混合淋巴细胞反应（MLR）的刺激细胞，将1000万个同源供体PBMC重悬于浓度为每毫升100万个细胞的培养基中，并进行辐照处理后加入。向每个继代混合淋巴细胞反应（MLR）板上标记为“fp allo restimulation”的孔中加入100微升照射过的刺激细胞。对于阳性对照，向每个继代MLR板上标记为“CD 3 28 stimulation”的孔中分别加入1微升CD3和CD28单克隆抗体以及98微升完全培养基。此外，向每个板上的六个空孔中各加入200微升完全培养基作为阴性对照，并向所有空孔中加入200微升PBS以减少蒸发。将培养板放入培养箱中。下一步是检测异基因PBMC的特异性，这些异基因PBMC来自一位新的健康供体，称为第三方供体，用于在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中测试异基因反应的特异性。将第三方PBMC重悬至每毫升100万个细胞，并对标记为3的96孔板进行照射，用于二次MLR特异性检测，检测时间点为第三天、第五天和第七天。为了准备用于二次混合淋巴细胞反应（MLR）以检测特异性的应答细胞，从每份大量培养的对照组和同种异体刺激共培养物中转移五毫升至15毫升离心管中，并在2000转/分钟下离心5到10分钟。随后，通过小心吸除上清液、重悬细胞沉淀，向每管加入10毫升完全培养基，洗涤细胞两次；每次洗涤后均需再次离心。最后，将细胞重悬于一毫升完全培养基中。使用台盼蓝染色法计数细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万个有活力的反应细胞，然后从每根试管中吸取100微升细胞悬液，分别加入到每块板的三个复孔中。将这些孔标记为TP或第三方同种异体刺激孔。随后，向标记为TP同种异体刺激的孔中加入100微升经辐照的TP刺激细胞。为进一步验证异基因反应对病原体的特异性，在已建立对巨细胞病毒（CMV）具有增殖反应的供体外周血单个核细胞（PBMC）经活化后，检测其反应特异性。在继发性混合淋巴细胞-巨细胞病毒（M-L-R-C-M-V）反应的第3、5和7天，从每份大量培养的对照组和异基因活化培养物中转移5毫升至15毫升离心管中。随后，洗涤细胞，计数，并以完全培养基重悬细胞至浓度为100万个细胞/毫升。使用移液器将每管细胞悬液各取100微升加入到每块板的三个孔中，并将这些孔标记为CMV刺激孔。然后，在标记为 CMV 刺激的孔中加入 0.1 µL CMV 裂解物至 100 µL 完全培养基中。接着，每块板的六个孔中各加入 200 µL 完全培养基作为阴性对照。最后，在所有空孔中加入 200 µL PBS 以减少蒸发，并将培养板放入培养箱中，用于检测初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）中的细胞增殖。在收获培养板前16小时，向阴性对照和含细胞的孔中各加入1微克的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷。使用TomTec细胞收集器或类似的空气装置，将每块板的胸腺嘧啶脱氧核苷收集到一张滤膜上。将滤膜干燥一小时。然后将它们分别放入样品袋中，每袋加入5毫升闪烁液并密封。通过Wallach Micro Beta闪烁计数器或类似设备读取滤膜，测量实验最后16小时内的三氢胸苷掺入量，使用HLA错配的刺激细胞和反应细胞PBMC。从本图可以看出，在初次混合淋巴细胞反应（MLR）中，共刺激信号阻断的存在使第五天效应PBMC的平均同种异体增殖水平降至无共刺激阻断的对照组初次MLR的约30%。这相当于在第五天对初次同种异体增殖的平均抑制率达到约70%。如本图所示。从本图可以看出，在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，经同种异体刺激活化的外周血单个核细胞（PBMC）在第5天对同种异体第一方刺激的增殖反应通常仅为对照PBMC的10%至15%。这相当于增殖抑制率达到85%至90%，表明经同种异体活化的PBMC对第一方同种异体刺激因子呈现低反应性。如图所示，一旦掌握操作技巧，大规模共培养体系可在2至3小时内完成对供者外周血单个核细胞的同种异体活化。该方法可轻松实现临床应用的标准化，以生成同种异体反应性降低但保留针对病原体特异性免疫的供体T细胞。这类细胞可在异基因造血干细胞移植过程中进行过继性转移，从而在不引发过度移植物抗宿主病的前提下改善免疫重建。在实施该操作时，需注意务必快速完成操作步骤。这有助于保持细胞的活力，并避免抗原呈递细胞的非特异性激活或丢失。如果使用冻存的外周血单个核细胞（PBMC）作为刺激细胞或反应细胞，应采用经过验证的复苏冻存细胞方案，以稳定获得高比例的活细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何对人源供体的外周血单个核细胞进行同种异体反应性降低处理，以及如何开展相关检测以评估该操作的效果和特异性。该策略可用于制备同种异体反应性降低的人源供体T细胞，在临床上有助于改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建。

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