通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

以下实验的总体目标是通过在体外使用受者同种抗原刺激受者来源的同种反应性供体T细胞，并同时加入阻断抗体以抑制抗原提呈细胞通过CD28受体对T细胞提供共刺激信号，从而激活这些T细胞。该目标首先通过分离两名不同健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）来实现。随后，将HLA不匹配的PBMC群体在存在针对B7.1和B7.2配体的单克隆抗体的条件下进行共培养，以阻断CD28介导的刺激，建立大规模的同种抗原激活共培养体系。

然后通过初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）来评估同种刺激的有效性。最后，通过检测第三方抗原和巨细胞病毒（CMV）特异性反应来评估同种刺激的特异性。实验结果表明，供体T细胞对后续同种抗原刺激呈现低应答状态，而对非同种抗原反应的供体T细胞则保持完整且功能正常。

我们已在先前及正在进行的临床试验中成功应用了这一策略，即在HLA错配的干细胞移植期间及之后输注经异体激活的供体T细胞，观察到相较于接受未经处理的HLA错配移植的历史对照受者，免疫重建更佳，感染更少，且急性和慢性移植物抗宿主病的严重程度更低。异体阳极化策略的一个主要优势在于其脱靶效应最小化，因为该技术不会削弱针对病原体特异性或肿瘤相关抗原特异性的T细胞应答，也不会从供体T细胞库中清除CD4+调节性T细胞，表明该操作具有良好的安全性。本实验操作将由本实验室的科研人员Christine Vin完成。第一步是从两名健康的志愿供体中抽取血液。

一名供体的细胞将作为反应细胞，另一名供体的细胞将作为刺激细胞。接下来，使用菲可（Ficoll-Paque）通过密度梯度离心法从血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）。用台盼蓝染色少量细胞，使用血细胞计数板对可存活的PBMC进行计数。

每个供体的 PBMC 分别使用 10 毫升。将完全培养基以每毫升含 100 万活细胞的浓度加入到各自的 15 毫升锥形管中。指定其中一管供体 PBMC 作为刺激细胞，另一管作为反应细胞，以建立大规模同种异体激活共培养体系。

向指定为刺激剂的15毫升离心管中加入100微克抗B 7.1和抗B 7.2抗体。轻轻振荡离心管，并在孵育30分钟后，对刺激剂PBMC进行照射，然后将其加入带有透气盖的T 25 50立方厘米细胞培养瓶中。

标记烧瓶中的大量异体混合淋巴细胞培养物。接下来，向烧瓶中加入来自另一供体的10毫升反应者外周血单个核细胞（PBMC），细胞浓度为每毫升100万个，使用完全培养基。向烧瓶中再加入各100微克的抗7.1和抗7.2抗体，轻轻混匀，然后将烧瓶直立放入培养箱中培养72小时。

接下来，照射另一份1000万个刺激剂PBMC，用于不加阻断抗体的大量对照共培养，然后将其加入一个T25（25平方厘米）细胞培养瓶中。将该培养瓶标记为大量对照共培养。向培养瓶中加入与大量同种异体激活共培养所用相同的10毫升应答PBMC，细胞密度为每毫升100万个，使用完全培养基，轻轻混匀后，将培养瓶直立放入培养箱中培养72小时。

下一步是在进行大量共培养的同一天，测定同种异体刺激的供体T细胞群的功能，为每个要检测的三个时间点分别标记一个U型底96孔板，用于初级混合淋巴细胞反应（MLR）。然后将每个大量对照组和同种异体刺激共培养物中的5毫升培养液倒入15毫升离心管中。

接下来，从每根试管中吸取200微升细胞悬液，分别加入三块培养板中的三个复孔中。将来自整体对照冷培养物的细胞所加的孔标记为“无共刺激阻断”或“no co-stimulatory blockade”（no CSB），将来自整体同种异体激活冷培养物的细胞所加的孔标记为“CSB”。然后在每块板的六个孔中各加入200微升完全培养基，作为阴性对照。

最后，向所有空孔中加入 200 微升 PBS，以减少蒸发，并将培养板置于培养箱中。在建立大规模共培养体系后 72 小时，为每个待检测的三个时间点分别标记一个 UBO 96 孔板，用于二次混合淋巴细胞反应（MLR）。为准备二次 MLR 的应答细胞，从每个大规模对照组和同种异体刺激共培养体系中转移 5 毫升至 15 毫升离心管中，在室温下以 2000 转/分钟离心 5 到 10 分钟。随后再清洗细胞两次：小心吸除上清液，重悬沉淀，每管加入 10 毫升完全培养基，第二次清洗后再次离心收集细胞。

用1毫升完全培养基重悬细胞。使用台盼蓝染色法计数活细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万个活应答细胞。从每根试管中吸取100微升细胞悬液，加入到每块板的三个复孔中。

首先将这些孔标记为同源刺激（FP）或异源刺激（alloy stimulation）。然后从每根试管中吸取100微升细胞悬液，分别加入到每块板上的另外三个孔中，并将这些孔标记为CD3/28刺激。使用同一供体的外周血单个核细胞（PBMC）作为同源刺激PBMC的来源。活化后的和对照共培养的细胞用作二次混合淋巴细胞反应（MLR）的刺激细胞，将1000万个同源供体PBMC重悬于浓度为每毫升100万个细胞的培养基中，并进行辐照处理后加入。

向每个继代混合淋巴细胞反应（MLR）板上标记为“fp allo restimulation”的孔中加入100微升照射过的刺激细胞。对于阳性对照，向每个继代MLR板上标记为“CD 3 28 stimulation”的孔中分别加入1微升CD3和CD28单克隆抗体以及98微升完全培养基。此外，向每个板上的六个空孔中各加入200微升完全培养基作为阴性对照，并向所有空孔中加入200微升PBS以减少蒸发。

将培养板放入培养箱中。下一步是检测异基因PBMC的特异性，这些异基因PBMC来自一位新的健康供体，称为第三方供体，用于在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中测试异基因反应的特异性。将第三方PBMC重悬至每毫升100万个细胞，并对标记为3的96孔板进行照射，用于二次MLR特异性检测，检测时间点为第三天、第五天和第七天。

为了准备用于二次混合淋巴细胞反应（MLR）以检测特异性的应答细胞，从每份大量培养的对照组和同种异体刺激共培养物中转移五毫升至15毫升离心管中，并在2000转/分钟下离心5到10分钟。随后，通过小心吸除上清液、重悬细胞沉淀，向每管加入10毫升完全培养基，洗涤细胞两次；每次洗涤后均需再次离心。最后，将细胞重悬于一毫升完全培养基中。

使用台盼蓝染色法计数细胞，并将细胞浓度调整至每毫升含100万个有活力的反应细胞，然后从每根试管中吸取100微升细胞悬液，分别加入到每块板的三个复孔中。将这些孔标记为TP或第三方同种异体刺激孔。随后，向标记为TP同种异体刺激的孔中加入100微升经辐照的TP刺激细胞。

为进一步验证异基因反应对病原体的特异性，在已建立对巨细胞病毒（CMV）具有增殖反应的供体外周血单个核细胞（PBMC）经活化后，检测其反应特异性。在继发性混合淋巴细胞-巨细胞病毒（M-L-R-C-M-V）反应的第3、5和7天，从每份大量培养的对照组和异基因活化培养物中转移5毫升至15毫升离心管中。随后，洗涤细胞，计数，并以完全培养基重悬细胞至浓度为100万个细胞/毫升。使用移液器将每管细胞悬液各取100微升加入到每块板的三个孔中，并将这些孔标记为CMV刺激孔。

然后，在标记为 CMV 刺激的孔中加入 0.1 µL CMV 裂解物至 100 µL 完全培养基中。接着，每块板的六个孔中各加入 200 µL 完全培养基作为阴性对照。最后，在所有空孔中加入 200 µL PBS 以减少蒸发，并将培养板放入培养箱中，用于检测初次和再次混合淋巴细胞反应（MLR）中的细胞增殖。

在收获培养板前16小时，向阴性对照和含细胞的孔中各加入1微克的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷。使用TomTec细胞收集器或类似的空气装置，将每块板的胸腺嘧啶脱氧核苷收集到一张滤膜上。将滤膜干燥一小时。

然后将它们分别放入样品袋中，每袋加入5毫升闪烁液并密封。通过Wallach Micro Beta闪烁计数器或类似设备读取滤膜，测量实验最后16小时内的三氢胸苷掺入量，使用HLA错配的刺激细胞和反应细胞PBMC。

从本图可以看出，在初次混合淋巴细胞反应（MLR）中，共刺激信号阻断的存在使第五天效应PBMC的平均同种异体增殖水平降至无共刺激阻断的对照组初次MLR的约30%。这相当于在第五天对初次同种异体增殖的平均抑制率达到约70%。如本图所示。

从本图可以看出，在二次混合淋巴细胞反应（MLR）中，经同种异体刺激活化的外周血单个核细胞（PBMC）在第5天对同种异体第一方刺激的增殖反应通常仅为对照PBMC的10%至15%。这相当于增殖抑制率达到85%至90%，表明经同种异体活化的PBMC对第一方同种异体刺激因子呈现低反应性。如图所示，一旦掌握操作技巧，大规模共培养体系可在2至3小时内完成对供者外周血单个核细胞的同种异体活化。

该方法可轻松实现临床应用的标准化，以生成同种异体反应性降低但保留针对病原体特异性免疫的供体T细胞。这类细胞可在异基因造血干细胞移植过程中进行过继性转移，从而在不引发过度移植物抗宿主病的前提下改善免疫重建。在实施该操作时，需注意务必快速完成操作步骤。

这有助于保持细胞的活力，并避免抗原呈递细胞的非特异性激活或丢失。如果使用冻存的外周血单个核细胞（PBMC）作为刺激细胞或反应细胞，应采用经过验证的复苏冻存细胞方案，以稳定获得高比例的活细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何对人源供体的外周血单个核细胞进行同种异体反应性降低处理，以及如何开展相关检测以评估该操作的效果和特异性。该策略可用于制备同种异体反应性降低的人源供体T细胞，在临床上有助于改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建。