Name: 卵泡在蛋白质降解的3维系统的封装和文化的一种方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 了解使用纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络封装小鼠卵巢卵泡的三维培养方法。该技术支持卵母细胞成熟，同时维持细胞间相互作用，适用于生殖生物学研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：U54HD41857 和 PL1EB008542，以及“肿瘤生育力联盟”路线图资助项目中的 P30 生物材料核心项目）。

1. 卵泡分离
动物实验严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及西北大学既定的实验动物使用与护理规程中的规定进行。
为获得最佳结果，所有解剖操作均在L15培养基中进行，以在环境CO2水平下控制pH值；使用37°C加热台控制温度，并在洁净工作台中操作以最大限度减少细菌污染。解剖培养基（DM）由添加了50 IU/mL青霉素、50 μL/mL链霉素和1%胎牛血清（FBS）的L15培养基配制而成。维持培养基（MM）由添加了50 IU/mL青霉素、50 μL/mL链霉素和1%胎牛血清（FBS）的αMEM培养基配制而成。
<ol>
 <li>将16日龄小鼠的新鲜解剖卵巢转移至新的35 mm培养皿中，加入1-2 mL含0.1%胶原酶和0.1% DNase的MM。置于培养箱中孵育15分钟 37°C 和5% CO₂2.</li>
 <li>孵育后，用DM进行多次洗涤以去除胶原酶，然后转移至含新鲜DM的35 mm培养皿中。使用两个连接一次性注射器的28½号针头，通过轻弹（或切割）方法将卵泡从整个卵巢上分离。在不破坏卵泡完整性的前提下，尽可能去除间质组织。每枚卵巢分离出20–40个次级卵泡（130–150 mm）。这些卵泡通常具有2–3层体细胞。 </li>
 <li>向60 mm IVF培养皿的中央小室加入1 mL MM体外 受精）培养皿的外圈加入3 mL MM，用移液器将完整的卵泡转移至体外受精（IVF）培养皿的外圈进行短暂冲洗，然后选择性地将其转移至中央孔中（参见 1.4 将此IVF培养皿存放在培养箱中。</li>
 <li>收集完所有卵泡后，在解剖显微镜下以5-8倍放大倍数进行筛选步骤。健康的卵泡具有以下形态学特征：
 <ul>
 <li>2-3层体细胞</li>
 <li>130-150 mm</li>
 <li>卵母细胞与体细胞之间无分离</li>
 <li>完整且圆形的卵母细胞 
 将健康的卵泡转移至IVF培养皿的中央，用于包封。</li>
 </ul>
 </li>
</ol>

 
2. 卵泡包封，方法一——“液滴法”
<ol>
 <li>在IVF培养皿的中央孔中加入1 mL含40 mM CaCl2的50 IU/mL凝血酶TBS溶液。将纤维蛋白原储备液（50 mg/mL溶于TBS）解冻并置于冰上保存。使用前将其恢复至室温。</li>
 <li>在1.7 mL无菌微量离心管中，按2:1:1的比例混合1×PBS、0.5% PBS藻酸盐溶液和50 mg/mL纤维蛋白原溶液，配制纤维蛋白原/藻酸盐混合液。避免在溶液中引入气泡。轻轻涡旋混匀后离心。该溶液略显浑浊，应现配现用。</li>
 <li>在IVF培养皿外圈放置两滴纤维蛋白原/藻酸盐溶液：一滴90 μL用于包封，另一滴10 μL用于洗涤。为减少蒸发，关闭解剖显微镜的加热台。使用200 μm微量移液枪头将10–15个卵泡连同极少量培养基（< 5 μL）转移至10 μL液滴中，并迅速混匀。再将所有卵泡连同第一滴中的少量溶液（< 5 μL）转移至90 μL液滴中，混匀。</li>
 <li>使用10 μL移液枪头同时吸取一个卵泡和5 μL纤维蛋白原/藻酸盐溶液，释放至IVF培养皿中的凝血酶/Ca2+溶液内。重复此步骤，直至所有卵泡完成包封。</li>
 <li>在凝血酶/Ca2+溶液中交联珠状物5–7分钟。随着纤维蛋白凝胶形成，珠状物颜色会变深。将珠状物转移至含有MM的培养皿中，优先转移颜色较深的珠状物。将培养皿放入培养箱中孵育15–30分钟，以洗去残留的凝血酶。</li>
 <li>将珠状物转移至含有100 μL卵泡生长培养基的96孔培养板中，立即进行成像。生长培养基（GM）由αMEM培养基添加10 mIU/mL重组FSH、3 mg/mL BSA、1 mg/mL牛胎球蛋白、5 μg/mL胰岛素、5 μg/mL转铁蛋白和5 ng/mL硒配制而成。</li>
</ol>
3. 卵泡包封，方法2——“Parafilm法”
<ol>
 <li>在1.7 mL无菌微量离心管中，按1:1比例混合0.5%藻酸盐溶液与50 mg/mL纤维蛋白原溶液，制备纤维蛋白原/藻酸盐混合溶液。</li>
 <li>用移液器将7.5 μL纤维蛋白原/藻酸盐混合液滴加到带有3 mm间隔垫片的石蜡膜包被载玻片上。用最少体积的培养基将1个卵泡转移至每滴液滴中。</li>
 <li>向每滴液滴中加入7.5 μL凝血酶/Ca2+溶液。由于凝胶几乎瞬间形成，无需混合。</li>
 <li>用第二张石蜡膜包被的载玻片覆盖凝胶，将载玻片倒置放入100 mm培养皿中，并转移至培养箱孵育5分钟。</li>
 <li>将凝胶珠转移至含有MM的培养皿中，再按前述方法转移至培养孔中。若凝胶珠因珠间交联而粘连，可用镊子轻轻分离。</li>
</ol>
4. 卵泡成像与培养基更换
<ol>
 <li>每隔2天，使用光学显微镜对培养的卵泡进行成像，并利用ImageJ软件测量卵泡直径。</li>
 <li>每隔2天，更换一半的生长培养基（50 μL），补充新鲜且预先平衡的生长培养基。</li>
</ol>
5. 从三维基质中回收卵泡 体外 卵母细胞成熟（IVM） 
<ol>
 <li>培养 8 天后，由于纤维蛋白组分完全降解，水凝胶呈现透明状，卵泡扩张至直径 300–400 μm。残留的海藻酸盐通过海藻酸酶（alginate-lyase）降解，这是一种来源于植物的酶，可特异性降解海藻酸盐，但不影响动物细胞。</li>
 <li>移除含有微珠孔中的生长培养基，每孔加入 100 mL 含 10 IU/mL 海藻酸酶的 αMEM。将培养板置于培养箱中孵育 25–30 分钟。</li>
 <li>使用钝头吸头从溶解的微珠中取出卵泡。先转移至含有 DM 的体外受精（IVF）培养皿外圈，再移入同样含有 DM 的中心孔中进行洗涤。</li>
 <li>洗涤后，将卵泡转移至含有成熟培养基的体外受精（IVF）培养皿的外圈，然后移入内圈。体外 成熟培养基（IVM）由 αMEM、10% FCS、1.5 IU/mL hCG 和 5 ng/mL 表皮生长因子（EGF）组成。</li>
 <li>将培养皿置于 CO2 培养箱中孵育 15–16 小时。 
 在显微镜下观察卵泡中颗粒细胞的扩张情况。为去除卵母细胞周围的颗粒细胞，加入透明质酸酶溶液至终浓度 0.1 mg/mL，在培养箱中孵育 2–3 分钟。使用 75 mm 微量移液吸头，通过反复吹打数次使颗粒细胞与卵母细胞分离。在光学显微镜或解剖显微镜下判断卵母细胞的成熟阶段。可能的成熟阶段按成熟度由低到高依次为：
 <ul>
 <li>退化型：卵母细胞碎裂为两个或更多片段。</li>
 <li>生发泡期（GV 期）：卵母细胞未对 hCG 刺激作出反应而恢复减数分裂，表现为卵母细胞核（生发泡，GV）仍可见。</li>
 <li>生发泡破裂期（GVBD）：卵母细胞中核膜消失，但尚未出现极体，因此仍处于减数第一次分裂（meiosis-I）阶段。</li>
 <li>中期 II 停滞卵母细胞（MII 期）：卵母细胞已恢复减数分裂，并停滞于第二次减数分裂中期（metaphase-II）。在光学显微镜或解剖显微镜下应可见极体。除非在后续实验中受精，否则卵母细胞将一直停留在 MII 期。</li>
 </ul>
 </li>
</ol>

 
6. 代表性结果：
我们描述了一种将卵巢卵泡包封于FA-IPN中的新型包封方法 体外 培养（图1）。卵巢卵泡由一个卵母细胞及其周围多层体细胞构成。多个细胞区室之间的通讯对于卵泡的正常发育和卵母细胞成熟至关重要。将卵泡包埋于三维水凝胶中，可在维持卵泡结构的同时支持其扩张。 9,11,12随着卵泡发育，其体积呈指数级扩张，包裹的生物材料应允许这种扩张，而不会产生抑制性的压缩力。FA-IPN 是由两种天然材料构成的网络，其中纤维蛋白可被卵泡激活的纤溶酶通过蛋白水解降解，而海藻酸盐则具有生物惰性 13（图2）。在卵泡生长过程中，纤维蛋白的降解首先在卵泡周围局部开始，并持续进行直至水凝胶中的纤维蛋白被完全清除。在此培养期间保持完整的不可降解海藻酸盐组分可维持水凝胶的三维结构。
卵泡在次级发育阶段（150-180 μm 直径）并扩增至 400 μm 在FA-IPN凝胶中卵泡发育至窦腔阶段。在hCG刺激下，培养的卵泡可发生颗粒细胞扩展，卵母细胞可恢复减数分裂并发育至减数第二次分裂中期，具备受精能力。这些结果表明，包封方法及包封材料可支持卵泡培养并实现成功成熟 体外 （图3）。
包封卵泡周围纤维蛋白的降解从培养的第一天开始，并在第6天完成。抑肽酶（aprotinin）是一种可溶性纤溶酶抑制剂，可用于调节纤维蛋白的降解，从而延长包封材料中的力学梯度（图4）。若在含有0.01 TIU/mL抑肽酶的条件下培养卵泡，前4天内纤维蛋白的降解速度会减慢。尽管如此，卵泡仍可发育至腔状阶段，且在去除抑肽酶后，卵母细胞仍具备恢复减数分裂并进展至第二次减数分裂中期的能力。高浓度的抑肽酶（0.1 TIU/mL）会显著抑制纤维蛋白的降解，基质刚性阻碍了卵泡的扩张，同时可观察到体细胞侵入基质的现象。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="体外卵泡发育示意图；从原始卵泡到有腔卵泡的各个阶段；包括成熟过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 卵泡发育流程图。 卵巢卵泡由位于中央的卵母细胞及其周围一层或多层体细胞构成，这些体细胞支持卵母细胞的发育。随着卵泡从次级卵泡发育至排卵前的有腔卵泡阶段，包围卵母细胞的体细胞发生增殖和分化，同时卵母细胞体积增大。in vitro 成熟（IVM）是卵泡培养的最后一步，在人绒毛膜促性腺激素（hCG）刺激后，紧邻卵母细胞的体细胞（称为颗粒细胞）发生扩展，卵母细胞恢复减数分裂并进展至第二次减数分裂中期（MII阶段）。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="海藻酸盐凝胶化示意图；钙离子结合G嵌段；聚合物网络形成。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2a"> 
 图2a. 用于3D卵泡培养的海藻酸盐及纤维蛋白-海藻酸盐 体外 . (a)海藻酸盐是一种适用于 体外 由于其温和的凝胶化特性以及生化特性（如孔径大小、可调控的刚性和生物惰性），海藻酸盐被用于卵泡培养。海藻酸盐是一种由α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）组成的线性杂聚多糖。含有重复G单体的区域称为“G嵌段”，在二价钙离子存在下，G嵌段通过交联形成水凝胶。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="海藻酸盐微珠通透性示意图；细胞包封、扩散过程，箭头指示流动方向。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2b"> 
 图 2b. （b-i）在培养初期，包封在海藻酸盐中的小型卵泡所受压缩力较低。然而，随着卵泡的扩张，微珠内被排开的体积增加，导致与卵泡扩张方向相反的压缩力增大（b-ii）。
 <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="纤维蛋白-海藻酸盐网络形成示意图；钙离子、凝血酶和因子XIII的参与。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2c"> 
 图2c. 在交联之前，单个聚合物链已完全缠结于纤维蛋白-海藻酸盐溶液中。当暴露于凝血酶和钙离子的混合物时，FA-IPN的两种组分立即开始交联。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="小鼠卵巢卵泡发育：卵母细胞成熟、颗粒细胞及培养装置示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3a"> 
 图3a. 卵泡分离及在FA-IPN中包封的流程图。 从16日龄小鼠中分离次级卵泡（A-i）。解剖生殖器官（A-ii），并将分离的卵泡转移至含有维持培养基的培养皿中（A-iii）。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="使用凝血酶和钙溶液并通过移液步骤进行微胶囊化的流程图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3b"> 
 图3b. 卵泡在纤维蛋白原-海藻酸盐溶液中进行包埋的液滴法（B:i-iv）。将两滴纤维蛋白原-海藻酸盐溶液，即清洗液滴（10 μL）和包埋液滴（90 μL），用移液器加入培养皿中（B-i）。随后将3-5个卵泡转移至清洗液滴中（B-ii）。清洗并去除培养基后，将卵泡转移至包埋液滴中（B-iii）。使用10 μL移液枪头吸取5 μL纤维蛋白原-海藻酸盐溶液将每个卵泡吸入，然后排出至凝血酶/钙溶液中（B-iv）。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="纤维蛋白原-海藻酸盐示意图；加入凝血酶溶液；展示凝块形成过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3c"> 
 图 3c. 微珠交联持续 5 分钟。使用 Parafilm 法将卵泡包埋于纤维蛋白原-海藻酸盐溶液中（C:i-iii）。将纤维蛋白原-海藻酸盐溶液（7.5 μL）滴加至涂有 Parafilm 的载玻片上，卵泡经洗涤后分别转移至各液滴中（C-i, ii）。随后向每滴溶液中加入凝血酶溶液（7.5 μL）（C-iii）。
 <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="细胞结构示意图与电子显微镜图像；细胞分裂及超微结构细节。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3d-e"> 
 图 3d - e. 液滴上覆盖另一层涂有石蜡膜的玻片，并将FA-IPN在培养箱中交联5分钟。（D）将包封的卵泡转移至96孔板中的生长培养基中。（E）FA-IPN中包封卵泡的图像（白色箭头）。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="在显微镜下观察胚胎发育阶段，D0至D4；受精卵生长进程分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. 生长卵泡对纤维蛋白的降解作用。在培养期间，卵泡会降解FA-IPN中的纤维蛋白成分，表现为卵泡周围出现清晰的透明环。剩余的海藻酸盐维持了卵泡的三维结构。在第0天（D0），纤维蛋白仍保持完整，卵泡周围的基质呈浑浊状；培养1天后（D1），卵泡周围开始出现透明环（白色箭头），至培养第2天（D2）和第4天（D4），纤维蛋白降解前沿持续呈放射状扩展。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="细胞发育阶段，显微镜图像；各时期显示胚胎发育进程，可见比例尺标识。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
 图5. 卵泡生长的图像。 FA-IPN中次级卵泡在培养第0天（A）、第4天（B）、第6天（C）和第8天（D）的代表性图像。培养8天后，卵泡发育为成熟腔状卵泡 体外 ，获得的MII期卵母细胞如图所示（E，黑色箭头指示极体）。
<img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="类器官生长实验；12天内的图像；抑肽酶作用；显微镜分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
 图6. 抑肽酶抑制了纤维蛋白的降解。 第一行显示了第2、4、10和12天的卵泡生长情况。在第0、2和4天，向培养基中添加浓度为0.01 TIU/mL（第二行）和0.1 TIU/mL的抑肽酶。只有在含0.01 TIU/mL抑肽酶的培养体系中，去除抑肽酶后纤维蛋白被降解，卵泡发育至腔状阶段。而在含0.1 TIU/mL抑肽酶的培养条件下，卵泡在FA-IPN中未能生长。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>缩写</td>
 <td>全名</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 培养箱</td>
 <td>37°C 5% CO₂ 培养箱2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>COC</td>
 <td>卵丘-卵母细胞复合体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D</td>
 <td>三维</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DM</td>
 <td>解剖液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF</td>
 <td>表皮生长因子</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FA-IPN</td>
 <td>纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>胎牛血清</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM</td>
 <td>培养基</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GV</td>
 <td>生发泡</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hCG</td>
 <td>人绒毛膜促性腺激素</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ITS</td>
 <td>胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>体外受精培养皿</td>
 <td>中心孔 60 mm 体外 受精皿</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MM</td>
 <td>维持培养基</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MII期卵母细胞</td>
 <td>减数分裂II期卵母细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>rFSH </td>
 <td>重组卵泡刺激素</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TBS</td>
 <td>Tris缓冲盐水</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TIU</td>
 <td>胰蛋白酶抑制单位</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 缩略词

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

所展示的卵巢卵泡在FA-IPN中的包封方法可实现卵泡在三维环境中的培养 体外纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络（FA-IPN）是一种动态的、细胞响应性基质，其初始力学性能由纤维蛋白和海藻酸盐共同决定。在培养过程中，包埋的卵泡会激活蛋白酶，特异性降解IPN中的纤维蛋白组分，而保留海藻酸盐。随着培养进行，凝胶刚度逐渐降低，最终仅由剩余的海藻酸盐提供力学支撑。研究表明，FA-IPN所提供的动态力学性能更接近于发育中卵泡的天然微环境，与单独使用海藻酸盐相比，可显著提高卵母细胞减数分裂成熟率。
FA-IPN 表现出温和且快速的凝胶化特性，该系统的各个组分通过独立的机制交联。我们已在其他地方描述过5，凝胶形成的速度可通过纤维蛋白原和凝血酶的浓度进行调控。降解速率可通过抑肽酶抑制纤维蛋白降解来调节。小鼠次级卵泡通常培养 8–12 天，而其他物种的卵泡则需要更长的培养时间。因此，抑肽酶延缓纤维蛋白降解可能为更长时间的培养提供一个持续动态的环境。
所述的包封方法可应用于其他系统，例如微组织或类胚胎体的包封与培...

<table><tbody><tr><td>胎球蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>重组卵泡刺激素</td><td>国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐溶液</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel 纤维蛋白试剂盒</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>分子量 418 kDa</td></tr></tbody></table>

一种用于卵泡包封及在蛋白酶可降解三维系统中培养的方法

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可分泌性激素并支持卵母细胞成熟。In vitro 卵泡技术为研究卵泡发育的基本生物学提供了建模工具，同时正在被开发为一种临床生育力保存技术1-4。我们的in vitro 培养系统采用水凝胶，通过维持卵泡的三维结构、细胞间相互作用以及调控卵泡发育的旁分泌信号，模拟卵巢的天然微环境5。此前，卵泡已在海藻酸盐中成功培养，海藻酸盐是一种惰性的藻类来源多糖，可在钙离子作用下发生凝胶化6-8。浓度为0.25% w/v的海藻酸盐水凝胶最有利于卵泡培养，并能保持最高的发育潜能9。海藻酸盐水凝胶不可降解，因此随着卵泡直径增大，会对卵泡产生压缩力，从而影响其生长10。随后，我们开发了一种基于纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络（FA-IPN）的培养系统，其中纤维蛋白与海藻酸盐混合后同时发生凝胶化。该组合提供了动态的力学环境：初始阶段两种组分共同贡献基质刚性；但随着卵泡生长，其分泌的蛋白酶会降解基质中的纤维蛋白，最终仅由海藻酸盐提供支撑。在该互穿网络中，海藻酸盐含量可低于0.25%，而单独使用海藻酸盐则无法实现这一浓度5。因此，随着卵泡扩张，由于固体含量降低，其所受压缩力也相应减小。本文中，我们描述了一种将卵巢卵泡包埋于FA-IPN中的封装方法及相应的in vitro 培养系统。该动态力学环境模拟了自然卵巢中卵泡的发育过程：小卵泡位于刚性较强的皮质区，随着体积增大逐渐移向更为宽松的髓质区11。该可降解组分在临床转化中可能尤为关键，因其可支持人类卵泡在体内正常发育过程中超过106倍的体积增长in vivo。

介绍了一种将卵巢卵泡包埋于三维纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络的新方法。该系统结合了结构支撑与蛋白水解降解特性，可支持未成熟卵泡发育并产生成熟卵母细胞。该方法也可用于培养细胞聚集体，以维持细胞间接触，同时不限制其扩展。

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可分泌性激素并支持卵母细胞成熟。体外卵泡技术提供……

本方案描述了一种用于体外培养的新型卵泡包封方法，即将卵泡包封于纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络中。次级卵泡由位于中央的卵母细胞及其周围多层体细胞构成，这些体细胞支持卵母细胞发育；将卵泡在三维环境中进行包封和培养，可在支持多个细胞区室间相互交流的同时，促进卵泡的生长并维持其球形结构。本方案的第一步是采用液滴法从16日龄小鼠卵巢中分离次级卵泡。将卵泡冲洗后转移至包封溶液中。用含有纤维蛋白原-海藻酸盐溶液的移液管吸取每个卵泡，将其滴入凝血酶-钙溶液中，使微珠在对苯二甲醛（paraform）方法下发生交联。将单个卵泡转移至经对苯二甲醛包被的玻片上的纤维蛋白原-海藻酸盐溶液液滴中，然后加入凝血酶溶液以启动F-A-I-P-N交联反应。然后将包封的卵泡转移至生长培养基中，并对FA IPN中的包封卵泡进行成像。由于该系统结合了结构支撑与生物响应性，可支持未成熟卵泡的生长与发育以产生卵子，因此也可应用于细胞聚集体的培养，以维持细胞间的接触而不限制其扩增。大家好，我是Lonnie Shea，通过与Three Wood Drip的合作，我们开发了一种用于卵巢卵泡体外成熟的培养系统。这项培养研究真正体现了生物工程学与生殖生物学之间的深入合作。今天，开发该培养系统的科研人员将向您介绍相关方法。首先，Ariel Checkoff 是一位生物工程学领域的博士后研究员，他开发了该生物材料系统。接下来是Minsu，他是妇产科的一名生殖生物学家，负责开发卵巢组织的操作流程。他们将共同向您介绍卵巢组织的实际包封与培养方法。与现有方法（如在平面上进行的标准塑料培养）相比，该技术的主要优势在于，纤维蛋白-海藻酸盐系统可在为快速生长的卵泡提供力学动态环境的同时，支持卵泡的三维结构架构。当前人类的动态力学微环境为该技术从大规模模型向潜在临床应用转化提供了额外优势，因为人类卵泡需要更广泛的生长才能产生成熟且可受精的卵子，以获得最佳效果。所有解剖操作均应在基于L-15的培养基中进行，以控制pH值，并在37摄氏度的加热载物台上控制温度，同时在洁净台中操作以最大限度减少细菌污染。将 freshly dissected 卵巢组织转移至新的35毫米培养皿中，加入一到两毫升含有0.1%胶原酶和0.1%DNA酶的维持培养基，在二氧化碳培养箱中孵育15分钟。用DM洗涤样本以去除胶原酶，然后转移至含有新鲜DM的35毫米培养皿中，以从卵巢中分离卵泡。使用连接在胰岛素注射器上的两根28.5号针头轻轻弹动，将卵泡从整个卵巢上分离。在不破坏卵泡完整性的前提下，尽可能去除间质细胞。从每个卵巢中分离出20至40个直径为130至150微米的次级卵泡。这些卵泡通常具有两到三层颗粒细胞。现在，在IVF培养皿的中央孔中加入1毫升mm，在外圈加入3毫升mm。用移液器将完整的卵泡转移至受精培养皿的外圈。将此受精培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。待所有卵泡收集完毕后。在解剖显微镜下以五至八倍的放大倍数观察样本，挑选大小为130至150微米、形态健康的卵泡，健康的卵泡应包含两到三层颗粒细胞层，卵母细胞与颗粒细胞之间无分离，且卵母细胞完整、呈圆形。将健康的卵泡转移至另一培养皿中央，用于包封。对于卵泡包封的液滴法，向IVF培养皿的中央孔中加入1毫升浓度为每毫升50国际单位的凝血酶溶液，并将纤维蛋白原储备溶液置于冰上解冻并保持低温。在包封前立即让纤维蛋白原升至室温。使用前立即操作。通过混合一倍磷酸盐缓冲液、0.5%海藻酸钠和50毫克/毫升纤维蛋白原来制备纤维蛋白原-海藻酸钠溶液。在1.7毫升无菌微量离心管中，按2:1:1的比例加入纤维蛋白原。轻轻涡旋并离心略显浑浊的溶液，以减少蒸发。关闭体视显微镜旁加热台，在IVF培养皿外圈的一侧放置。用于包封的90微升纤维蛋白原-海藻酸盐溶液，以及用于洗涤步骤的10微升溶液。将10至15个卵泡连同极少量培养基转移至10微升液滴中，迅速用极少量溶液混匀，然后将所有卵泡转移至90微升液滴中并混匀。使用10微升枪头，吸取5微升纤维蛋白原-海藻酸盐溶液中的一个卵泡，将纤维蛋白原-海藻酸盐溶液与卵泡一同释放至培养皿中央的凝血酶溶液中。重复此步骤，直至所有卵泡完成包封。将珠子在凝血酶钙溶液中静置5至7分钟，以交联凝胶。随着纤维蛋白的形成，珠子颜色会变深。从颜色较深的珠子开始，将珠子转移至维持培养基中。首先在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后洗去残留的凝血酶。最后将微珠转移至培养板中进行成像。立即通过混合0.5%藻酸盐和50毫克/毫升纤维蛋白原制备藻酸盐溶液。在1.7毫升无菌微量离心管中，按1:1比例加入纤维蛋白原，用移液器将7.5微升纤维蛋白原-海藻酸盐混合物滴加到涂有石蜡的玻璃片上。使用3毫米间隔器推片，并将一个卵泡转移至每滴混合物中，加入极少量培养基。加入7.5 µL凝血酶溶液至每滴液滴中，注意不要触碰或搅动含有卵泡的液滴，因为凝胶会几乎瞬间形成。用第二层涂有Parafilm的玻片盖住凝胶。将玻片滑动并倒置于100 mm培养皿中，放入培养箱孵育5分钟。必要时使用镊子将黏性珠粒转移至维持培养基中，然后每两天将其转移至一个新的培养孔中。使用光学显微镜观察培养的卵泡，并用ImageJ软件测量卵泡直径。同时，每两天更换一半的培养基，补充新鲜的平衡培养基。经过8天培养后，由于纤维蛋白成分已完全降解，水凝胶应变得透明，卵泡直径可达到最终尺寸，超过400微米。移除生长培养基，加入100微升含10国际单位/毫升的溶液。将海藻酸盐珠置于含α-MEM的溶液中以降解海藻酸盐。将培养板放入培养箱中孵育25至30分钟。然后用钝头吸头从部分溶解的珠中取出卵泡。将卵泡转移至含有分离培养基的培养皿外圈，以洗去海藻酸盐，然后转移至内圈。接着，将具有腔隙的卵泡转移至含有成熟培养基（包含HCG和EGF）的培养皿外圈，再转移至内圈，在二氧化碳培养箱中孵育15至16小时。观察培养物中颗粒细胞的扩展情况，以去除颗粒细胞。加入高IDE溶液，使其终浓度为0.1毫克/毫升，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2至3分钟。用口吸管吹打使卵母细胞与卵丘细胞分离，最后在显微镜下确定其成熟阶段。海藻酸盐是一种天然生物材料，由于其温和的凝胶化特性以及网孔大小、可调控的刚性和生物惰性等生化特性，适用于体外卵泡培养。在培养初期，包裹在海藻酸盐中的小型卵泡所受的压缩力较低。然而，随着卵泡的扩张，微珠内被占据的体积逐渐增加，从而在与卵泡扩张相反的方向上产生更大的压缩力。在交联之前，单个聚合物的链在原纤蛋白-海藻酸盐溶液中已完全缠绕。F-A-I-P-N 的两种组分在接触凝血酶和钙混合物后立即开始交联。在培养期间，卵泡会降解 F-A-I-P-N 中的纤维蛋白组分，这表现为卵泡周围出现清晰的环状区域。剩余的海藻酸盐则维持着卵泡的三维结构。这些图像显示了F-A-I-P-N中次级卵泡从第0、4、6天到第8天直至M2期的发育过程。极体存在时，抑肽酶是一种蛋白酶抑制剂，可添加至培养基中以减缓纤维蛋白的降解。在培养的前四天，向培养基中添加每毫升0.01 TIU的抑肽酶后，卵泡无法降解基质；而在去除蛋白质后，卵泡恢复生长并达到窦腔期。然而，卵泡在较高浓度的抑肽酶中进行初始培养时，其生长受到抑制。今天，我们展示了一种新的技术，用于在三维纤维蛋白-海藻酸盐网络中进行卵泡包封及体外培养的调控。该系统不仅在培养过程中维持了卵泡结构的完整性，还支持卵泡在体外成功发育，最终实现减数分裂第二次分裂中期（MII）卵母细胞的获得。该技术对于揭示卵巢卵泡的功能机制具有重要意义，并有望为年轻的癌症患者提供生育选择。更广泛地说，该培养系统可用于细胞簇的培养，或用于细胞在自组织形成结构过程中的培养。这些三维培养系统将为在分子水平上解析组织生长提供有价值的工具。

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科研

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生物工程

卵泡在蛋白质降解的3维系统的封装和文化的一种方法

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在本视频中，我们介绍了一种将猪卵母细胞包封于疏水性微生化反应器中的实验方案。...

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蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

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探究卵巢微环境：小鼠卵巢体细胞的分离、二维培养及类器官培养方法

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三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

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一种用于卵泡包封及在蛋白酶可降解三维系统中培养的方法

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