实心板为基础的饮食限制在线虫

该实验通过在秀丽隐杆线虫的标准琼脂平板上实施饮食限制，以研究其对寿命、繁殖力和代谢的影响。该过程首先精确测定将用作食物来源的细菌浓度，第二步是将细菌培养物适当稀释至所需浓度。

然后制备含有灭活细菌的基础SDR平板。最后，使用年龄同步化的线虫群体进行SDR实验。子代繁殖数量和寿命测定结果可显示子代繁殖延迟且数量减少，同时平均寿命延长。

与在AZA培养基中使用Dian的60种方法相比，该技术的主要优势在于，整个实验将在一种基于标准固体AGA的培养基上进行，这种培养基被大多数研究秀丽隐杆线虫的实验室广泛用于饮食限制实验。针对用作食物来源的每种细菌菌株，需分别建立独立的校准曲线。从LB琼脂平板上的新鲜划线培养中挑取单个大肠杆菌OP50菌落，接种至3毫升液体LB肉汤培养基中，在37°C摇床中过夜培养。对过夜培养物进行连续两倍梯度稀释。

然后使用分光光度计在600纳米波长下测定每种稀释液的吸光度，每个样本重复测定三次。进一步将每种细菌悬液稀释一百万倍，均匀地取0.4毫升各稀释度的细菌悬液接种于100毫米LB琼脂平板上，于37°C培养18至24小时。计数每个平板上生长的细菌菌落数量，以计算每毫升样品中的菌落形成单位（CFU/mL）。

现在以OD 600为纵坐标，细菌浓度为横坐标作图，并进行线性回归分析，以建立测定的OD 600值与OP 50细菌浓度之间的关系。在本方法中，ad libitum饲喂条件下使用1 × 10¹¹ CFU/mL的细菌浓度，而最佳DR饲喂条件则使用1 × 10⁸ CFU/mL。然而，可能需要使用四到六个不同的细菌浓度来建立完整的剂量依赖关系。

针对SDR及其反应，准备接种物：取单个大肠杆菌OP 50菌落，接种于3毫升液体LB培养基中，在37°C摇床中培养6至8小时。如有需要，将OP 50菌液转移至含有500毫升LB培养基的新烧瓶中，过夜培养至细菌达到饱和状态。

准备适当稀释的OP 50菌液，用于测定600 nm处的吸光度（OD 600）。为确定细菌浓度，将细菌在1500 ×g下离心20分钟以收集菌体沉淀。弃去上清液，并将菌体重悬至浓度为每毫升1 × 10¹² CFU。

现在，准备六种不同浓度的10毫升细菌培养物，浓度范围从每毫升1×10¹² CFU到每毫升1×10⁷ CFU，用移液器将0.2毫升细菌培养物加到60毫米已凝固的NGM平板中央。注意移液枪头不要接触平板表面，因为表面的划痕会使线虫钻入琼脂中。

将平板置于37摄氏度培养箱中孵育一小时。然后向每个平板中加入10微升浓度为100毫克/毫升的碳酸溶液和10微升浓度为50毫克/毫升的卡那霉素，以抑制细菌生长。将含有不同抗生素浓度并杀死细菌的平板于4摄氏度保存，可供后续使用长达一个月。

准备并储存足够的平板至关重要，最好为整个实验使用同一批次的平板。实验前至少一到两天进行预实验，以验证细菌的活性。从SDR平板上刮取一些细菌，涂布于含有碳酸盐、sein和抗霉素的空N GM平板上。

将培养皿置于37摄氏度的培养箱中孵育6至8小时，并确认无细菌生长。对于大多数与SDR相关的研究，例如寿命分析和子代产生谱型分析，制备年龄同步化的线虫群体至关重要。使用铂金线虫挑取器将20至30只具有生殖活性的成虫转移至若干普通NGM培养皿上。

使用OP 50。根据实验所需的卵数量，可能需要更多的成虫。将培养板置于20摄氏度下4小时，以允许产卵。

将成虫从培养皿中移除，并对培养皿进行肉眼观察以检查卵。继续在20°C下培养培养皿，使后代发育至晚期L4至成虫第一天阶段。通常情况下，N2野生型线虫在20°C下需要三天时间。

用于寿命分析。将10至12条孵化后第一天的成虫线虫转移至SDR平板，以启动饮食限制。为获得足够的统计效力，每种SDR条件下应使用总共60至100条线虫。

每两到三天对每条线虫的存活率进行一次评分，直至所有线虫死亡。重要的是，每隔一天将线虫转移至新鲜的SDR平板，以避免饥饿。该校准曲线绘制了OP50浓度与OD600之间的关系。

通过线性回归分析生成的方程可用于所有未来对OP 50细菌浓度的计算。本研究检测了长期SDR处理对不同线虫品系平均寿命的影响，并与野生型线虫对SDR的正常剂量依赖性反应进行比较。SDR对寿命的影响在DR two过表达的情况下部分受到抑制，而DAF 16 MU 86突变对SDR诱导的寿命延长无影响。

观看本视频后，您应能充分理解如何在海洋优雅风格的标准 AGA 演奏中进行 Dian 的操作。