Name: 实心板为基础的饮食限制在线虫 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学习使用实心板对秀丽隐杆线虫进行饮食限制实验，通过测量细菌浓度、稀释培养物并制备含灭活细菌的SDR平板，研究饮食限制对寿命、繁殖和代谢的影响。该方法为衰老生物学研究提供了可靠的实验框架。

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本工作获得了Nathan Shock中心（P30 AG13283）的试点项目资助以及美国国家衰老研究所（NIA）R01基金（R01 AG028516）对A.-L.H.的资助。

1. 建立用于估算细菌浓度的校准曲线
本部分介绍了一种用于估算任意给定细菌菌株（例如 OP50、HT115）浓度的方法，这些菌株将作为秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食限制实验中的食物来源。每种使用的细菌菌株均应建立独立的校准曲线。
<ol>
 <li>从LB琼脂平板上新鲜划线培养的E. coli OP50菌落中挑取单个菌落，接种于3 mL液体LB培养基中。</li>
 <li>将OP50菌液置于37 °C摇床中，过夜培养。</li>
 <li>用过夜培养物制备细菌悬液的连续2倍稀释液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍）。</li>
 <li>使用分光光度计在600 nm波长下测定各稀释液的吸光度（光密度），每样重复测定三次。</li>
 <li>将每种细菌悬液进一步稀释1,000,000倍（连续两次1000倍稀释）。</li>
 <li>将每种稀释度的细菌悬液各0.4 mL均匀涂布于100 mm LB琼脂平板上。</li>
 <li>将接种OP50的LB平板置于37 °C培养箱中培养18–24小时。</li>
 <li>计数每个平板上生长的细菌菌落数目。菌落计数用于计算每毫升样品中的菌落形成单位（cfu，colony forming unit）数量。</li>
 <li>通过以OD600值为纵坐标、细菌浓度（cfu/mL）为横坐标作图，并进行线性回归分析，可建立测得的OD600值与OP50细菌浓度之间的关系（图1）。</li>
</ol>
 溶液：
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">LB 培养基（Luria Broth），1 L：</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 g</td>
 <td>Bacto-tryptone</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 g </td>
 <td>Yeast Extract</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 g</td>
 <td>NaCl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
加入去离子水至 1 L。 
 高压灭菌后室温保存。
2. 固体平板式饮食限制（sDR）平板的制备
本部分介绍了用于固体平板饮食限制（sDR）实验的平板制备方法。通常，我们将细菌浓度为 1 x 1011 cfu/mL 视为自由摄食条件，1 x 108 cfu/mL 视为该方法下最佳的饮食限制喂养条件。然而，可能需要设置 4 至 6 种不同的细菌浓度，以建立 sDR 及其响应的完整剂量依赖关系。
<ol>
 <li>将一株 E. Coli OP50 细菌接种至 3 mL 液体 LB 培养基中。</li>
 <li>将 OP50 菌液置于 37 °C 摇床中，培养 6–8 小时，使细菌生长。</li>
 <li>将 OP50 菌液转移至含有 500 mL LB 培养基的新烧瓶中，并重新放入 37 °C 摇床中过夜培养。</li>
 <li>测定 OP50 菌液在 OD600 处的吸光度，以确定细菌浓度（浓度通过第一部分建立的校准曲线计算）。为准确测定吸光度，可能需要进行适当稀释。</li>
 <li>在 1,500 g 条件下离心 20 分钟，收集 OP50 细菌沉淀。</li>
 <li>将细菌重悬至浓度为 1 × 1012 cfu/mL。</li>
 <li>制备 10 mL 六种不同浓度的细菌培养液：1 × 1012、1011、1010、109、108、107 cfu/mL。</li>
 <li>用移液器将 0.2 mL 细菌培养液加至 60 mm 固化 NGM 平板中央。避免移液器吸头接触平板表面，因为表面划痕会使线虫钻入琼脂平板中。</li>
 <li>将平板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。</li>
 <li>在每块平板上加入 10 μL 100 mg/mL 羧苄西林和 10 μL 50 mg/mL 卡那霉素，以抑制细菌生长。</li>
 <li>将含有不同浓度抗生素灭活细菌的平板储存于 4 °C，以备后续使用（最多可保存一个月）。建议至少提前 1–2 天制备并储存足够整个实验使用的平板。整个实验使用同一批次的平板更为理想。</li>
 <li>为验证细菌的存活状态，从 sDR 平板上刮取部分细菌，涂布于含羧苄西林和卡那霉素的空白 NGM 平板上。将平板置于 37 °C 培养箱中培养 6–8 小时，随后检查细菌生长情况（应无细菌生长）。</li>
</ol>
溶液
<table border="1">
 <tbody>
 	<tr>
 <td colspan="2">线虫生长培养基（NGM），1 L：</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 g </td>
 <td>NaCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 g</td>
 <td>Bacto-Peptone </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 g</td>
 <td>Agar</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
高压灭菌40分钟，然后冷却至65 °C，再加入：
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>1 mL </td>
 <td>1 M MgSO4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 M CaCl2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 mL</td>
 <td>5 mg/mL 胆固醇</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mL</td>
 <td>1 M 磷酸钾，pH 6.0</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
立即将液体NGM以每份10 mL的量倒入60 mm × 15 mm的培养皿中
3. 设置 sDR 实验
对于大多数与sDR相关的研究，例如寿命分析和生育力谱型分析，制备年龄同步化的线虫群体至关重要。对于其他研究，只需将线虫从常规的OP50平板转移至sDR平板，即可启动饮食限制。本节以sDR动物的寿命分析为例，描述了相应的实验方案。
<ol>
 <li>使用铂金线虫挑取器将20-30条具有生殖活性的成虫转移到含OP50的普通NGM平板上。根据实验所需卵的数量，可能需要更多成虫。</li>
 <li>将平板置于20°C环境中4小时，以允许产卵。</li>
 <li>从平板上移除成虫，并对平板进行肉眼检查以确认是否存在卵。</li>
 <li>将平板继续置于20°C培养，使子代发育至晚期L4或第1天成虫阶段。通常情况下，N2野生型线虫在20°C下需要3天完成该发育过程。</li>
 <li>将适量的第1天成虫转移至sDR平板，以启动饮食限制处理。</li>
 <li>进行寿命分析时，每种sDR条件应设置6-8个平板，每个平板接种10-20条线虫。</li>
 <li>每2天记录每条线虫的存活情况。至关重要的是，必须每隔12-48小时将线虫转移至新的sDR平板，以避免食物完全耗尽。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
图1展示了一条用于估算OP50浓度与OD600之间关系的代表性标准曲线。通过线性回归分析得到的方程可用于今后所有OP50细菌浓度的计算。图2展示了慢性sDR处理对不同线虫品系平均寿命影响的检测示例。蓝色曲线代表野生型线虫对sDR的正常剂量依赖性反应。红色曲线表明，drr-2 o.e.部分抑制了sDR对寿命的影响，而daf-16(mu86)对sDR诱导的寿命延长无影响。C. elegans中进行寿命分析的详细方法已在先前文献中描述1-3。
<img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="细菌浓度与光密度关系图，线性回归，R²=0.99505，OD600分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于估算的校准曲线代表性结果 大肠杆菌 OP50浓度。OP50浓度绘制为测量OD的函数600 数值。误差线 = 标准差（S.D.）。细菌过夜培养物在测定吸光度前分别稀释 1.5 倍、2 倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍，在测定菌落形成单位（cfu）前再进一步稀释 1,000 倍两次。
<img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="细菌浓度与平均寿命关系图；N2、daf-16(mu86)、drr-2 过表达分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 代表性实验结果 C. elegans 比较野生型 N2 动物（蓝色）与两种不同突变体（绿色和红色）在 sDR 条件下的寿命实验（图片来自 Ching 等 4）。误差棒 = 标准误（S.E.M.）

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

已知饮食限制（DR）可延长多种物种（包括哺乳动物）的寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生5-7。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，已有多种环境和遗传操作方法用于模拟DR，包括将线虫培养于半定义的液体培养基中8,9、在液体培养基中稀释细菌食物来源10-12，以及利用摄食速率较慢的行为突变体13。然而，遗传性模拟DR可能产生与DR无关的表型，而在线虫液体培养体系中则涉及与大多数线虫实验室所适应的固体培养板条件不同的生长环境。因此，能够在标准固体培养板上实施的DR方案具有重要应用价值，目前已由多个研究团队建立4,14,15。
在本方案中，通过在培养皿上施加两种不同的抗生素来杀死细菌，以此控制食物摄入水平。然而，也可使用其他方法（如紫外线照射）来抑制细菌生长。
为避免在sDR实验过程中完全缺乏食物（即饥饿），如上文步骤3.7所述，需每隔12至48小时将线虫转移至新的sDR培养板。转移频率取决于食物浓度...

<table><tbody><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109.25</td><td>溶于水。</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Roche Group</td><td>10106801001</td><td>溶于水。</td></tr><tr><td>Bacto-蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0118072</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-胰蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123075</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0127071</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>DF00145170</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养管</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1485-0810</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Amersham</td><td>Gene Quant pro</td><td>Amersham 现为 GE Healthcare 的一部分。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Accuspin FR</td><td></td></tr></tbody></table>

基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

在包括哺乳动物在内的多种物种中，已知在不造成营养不良或饥饿的情况下减少食物摄入量能够延长寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生。这种干预措施还会导致体重和生育力下降，以及动物体内血浆葡萄糖、胰岛素和IGF-1水平降低。该处理通常被称为饮食限制（dietary restriction, DR）或热量限制（caloric restriction, CR）。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的重要模式生物。通过环境和遗传手段模拟饮食限制的研究均已证明可延长C. elegans的寿命。然而，许多已报道的关于C. elegans的饮食限制研究是在液体培养基中进行的，而衰老领域的大多数遗传学研究则是在标准的固体琼脂培养皿上完成的。本文介绍一种使用标准固体NGM琼脂平板并以灭活细菌作为食物来源的饮食限制实验方案。

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行固体平板饮食限制的实验方案。

在多种生物中，已知在不引起营养不良或饥饿的情况下减少食物摄入可延长寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生。

该实验通过在秀丽隐杆线虫的标准培养基上实施饮食限制，以研究其对寿命、繁殖力和代谢的影响。首先精确测定用作食物来源的细菌浓度，完成该实验的第一步。实验的第二步是将细菌培养物正确稀释至适宜的浓度。然后制备含有灭活细菌的SDR平板。最后，使用年龄同步化的线虫群体进行SDR实验。子代繁殖和寿命测量的结果可显示子代繁殖延迟且数量减少，同时平均寿命延长。该技术相较于在 AZA 培养基中使用 Dian 等 60 种方法的主要优势在于，整个实验将在大多数温血动物实验室用于饮食限制实验的标准固体 AGA 培养基上进行，并且需针对用作食物来源的每种细菌菌株分别建立独立的校准曲线。从 LB 琼脂平板上的新鲜划线培养中挑取单个 e coli OP50 菌落，接种至 3 毫升液体 LB 培养基中，在 37 摄氏度摇床中过夜培养。对过夜培养物进行连续两倍稀释。然后使用分光光度计在600纳米波长下测定每种稀释液的吸光度，每个样本重复测定三次。进一步将每种细菌悬液稀释一百万倍，均匀接种每种稀释液0.4毫升至100毫米LB琼脂平板上，于37°C培养18至24小时。计数每个平板上生长的细菌菌落数量，以计算每种样本每毫升的菌落形成单位（CFU/mL）。现在将OD 600对细菌浓度作图，并进行线性回归分析，以建立测定的OD 600值与OP 50细菌浓度之间的关系。在本方法中，ad libitum饲喂条件下使用1 × 10¹¹ CFU/mL的细菌浓度，而最佳DR饲喂条件则使用1 × 10⁸ CFU/mL。然而，可能需要4至6个不同的细菌浓度以建立完整的剂量依赖关系。针对SDR及其反应，准备接种物：取单个大肠杆菌OP 50菌落，接种于3毫升液体LB培养基中，在37°C摇床中培养6至8小时。必要时，将OP 50菌液转移至含有500毫升LB培养基的新烧瓶中，过夜培养至细菌达到饱和状态。为测量在 OD 600 处的吸光度，配制适当的 OP 50 菌液稀释液。为确定细菌浓度，将细菌在 1500 ×g 下离心 20 分钟以收集菌体沉淀。弃去上清液，并将细菌重悬至浓度为每毫升 1 × 10¹² CFU。现在，准备10毫升的细菌培养物，共六种不同浓度，范围从每毫升1×10¹²至1×10⁷ CFU，用移液器将0.2毫升细菌培养物加到60毫米已凝固的N GM平板中央。注意移液器枪头不要接触平板表面，因为表面的划痕会使线虫钻入琼脂内部。将平板置于37摄氏度培养箱中孵育一小时。然后向每个平板中加入10微升浓度为100毫克/毫升的碳酸溶液和10微升浓度为50毫克/毫升的卡那霉素，以抑制细菌生长。将含有不同抗生素浓度并已杀死细菌的平板于4摄氏度保存，可供后续使用长达一个月。准备并储存足够数量的培养基平板非常重要，最好为整个实验使用同一批次的平板。应提前至少一到两天进行预实验，以验证细菌的活性。从SDR平板上刮取少量细菌，将其涂布于含有碳酸盐、sein和抗霉素的空N GM平板上。将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育6至8小时，并确认无细菌生长。对于大多数与SDR相关的研究，例如寿命分析和子代产生谱型分析，制备年龄同步化的线虫群体至关重要。使用铂金线虫挑取器将20至30只具有生殖活性的成虫转移至若干标准NGM培养皿上。使用OP 50。根据实验所需的卵数量，可能需要更多的成虫。将培养板置于20摄氏度下4小时，以允许产卵。将成虫从培养皿中移除，并对培养皿进行肉眼观察以检查卵的存在。继续在20摄氏度条件下培养培养皿，使后代发育至四龄晚期至成虫第一天阶段。通常情况下，N2野生型线虫在20摄氏度条件下需要三天时间完成此发育过程。用于寿命分析。将10至12条孵化后第一天的成虫转移至SDR平板，以启动饮食限制。为获得足够的统计效力，每种SDR条件下应使用总共60至100条线虫。每两到三天对每条线虫的存活情况进行评分，直至所有线虫死亡。重要的是，每隔一天将线虫转移至新鲜的SDR平板，以避免饥饿。该校准曲线绘制了OP50浓度与OD600之间的关系。通过线性回归分析生成的方程可用于所有未来对OP 50细菌浓度的计算。本研究检测了慢性SDR处理对不同线虫品系平均寿命的影响，并与野生型线虫对SDR的正常剂量依赖性反应进行比较。SDR对寿命的影响在DR两个基因过表达时部分受到抑制，而DAF 16 MU 86突变对SDR诱导的寿命延长无影响。观看本视频后，您应该能够充分理解如何在海洋优雅风格的标准 AGA 演奏中进行 Dian 的操作。

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实心板为基础的饮食限制在线虫</em

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