Name: 星状细胞的七个步骤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的标准化方法，采用酶灌注消化和密度梯度离心技术。该方法可获得高纯度细胞，适用于肝脏生物学和纤维化研究。

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本工作由Smith Family生物医学研究卓越奖和美国国立卫生研究院（NIH）RO1 AI083426-01（F.W.）资助。Patrick Maschmeyer和Melanie Flach获得勃林格殷格翰基金会博士研究生奖学金的支持。

建议使用约20周龄或更年长的C57BL/6小鼠。推荐使用体重为25–30 g的雄性小鼠。在分离星状细胞前，通过给予小鼠富含维生素A的饮食喂养2个月，可提高星状细胞的得率。从一只C57BL/6小鼠肝脏中可纯化出约2×105个肝星状细胞，而从Balb/c小鼠中获得的星状细胞得率明显更高。以下实验方案按5只小鼠的用量进行调整。动物饲养与实验操作均依照经批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）规程进行。


1. 原位 小鼠肝脏灌注消化酶 
<ol>
 <li>将SC1缓冲液和酶灌注溶液在水浴中预热 37°C 水浴锅</li>
 <li>将带翼输液器安装到蠕动泵的硅胶管上。</li>
 <li>用 PBS 校准泵，以获得 6.5 ml/min 的层流，该流速将用于后续实验 原位 肝脏灌注。用SC1溶液平衡硅胶管。</li>
 <li>通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）溶液麻醉小鼠，并检测反射消失以确认深度麻醉状态。</li>
 <li>将小鼠仰卧位固定于合适的基座上。 </li>
 <li>使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。</li>
 <li>小心切开腹膜，并将肠管移出腹腔，置于动物左侧，以暴露门静脉。</li>
 <li>将输注装置的套管插入门静脉。建议在该步骤中使用体视显微镜。</li>
 <li>用30 ml SC1溶液开始灌注肝脏。启动灌流后立即打开下腔静脉。肝脏组织颜色褪去表明肝脏灌流成功。</li>
 <li>用 30 ml Pronase E 溶液灌注肝脏。消化成功后，肝叶将肿胀，肝小叶通过被膜可见明显分界。</li>
 <li>用30 ml胶原酶P溶液灌注肝脏。此时肝脏已失去原有形态，呈无张力且无固定形状的状态。</li>
 <li>小心地将肝脏与膈膜及周围器官分离，并将其置于冰上的70 ml SC2溶液中保存。</li>
 <li>对其他小鼠重复该操作步骤。</li>
</ol>





2. 小鼠肝脏的体外消化

所有后续操作步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。

<ol>
 <li>使用锋利的剪刀将肝脏切成约 2x2x2mm3 的小块。</li>
 <li>将含有肝组织块的 70ml SC2 悬液与 50ml Pronase E-Collagenase P 溶液混合，并加入 1ml DNase I 溶液。</li>
 <li>在 37°C 下搅拌消化肝脏组织 20 分钟。</li>
</ol>
3. 密度梯度离心
<ol>
 <li>将细胞悬液通过70μm细胞滤网过滤至6个50ml Falcon离心管中，并用SC2缓冲液补至50ml。在4°C条件下，以600g离心10分钟。</li>
 <li>小心吸除每管中的40ml上清液，然后向每管中加入150μl DNase I溶液并重悬细胞。</li>
 <li>将细胞悬液合并至4个50ml Falcon离心管中，用GBSS-B洗涤，在4°C条件下以600g离心10分钟。</li>
 <li>小心尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀，向每管中加入150μl DNase I溶液。每管用10ml GBSS-B重悬细胞沉淀。</li>
 <li>将细胞合并至2个50ml Falcon离心管中，每管加入GBSS-B至总体积为36ml。每管加入14ml Nycodenz溶液，并充分混匀。</li>
 <li>将10ml细胞悬液转移至一个12ml梯度离心管中，共得到10个离心管。每管轻轻覆盖1.5ml GBSS-B。</li>
 <li>在4°C条件下以1500g离心15分钟（不启用刹车）。离心后，肝细胞将沉淀于管底，而星状细胞则位于界面层，呈白色环状。</li>
 <li>小心收集含有星状细胞的界面层，并用GBSS-B洗涤；在4°C条件下以600g离心10分钟。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于20ml DMEM培养基中，该培养基添加有10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES。将细胞以2×104 cells/cm2的密度接种至组织培养瓶中。在37°C、5% CO2条件下培养细胞。</li>
 <li>一旦肝星状细胞贴壁（约制备后2小时），立即更换培养基，以去除死细胞和细胞碎片。</li>
 <li>次日，星状细胞应呈现出其特征性的星形形态，并含有围绕细胞核的储存维生素A的脂滴。</li>
 <li>在后续实验中，肝星状细胞可使用温和的酶溶液（如Accutase）轻松从非包被的塑料表面解离。</li>
</ol>


4. 代表性结果：
在按照所提供的方案制备肝星状细胞后，可通过考察该细胞类型的三个主要特征——星状形态、胞周脂滴以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达——来检测所分离细胞群体的纯度。图中展示了肝星状细胞在分离后2小时以及第1天和第3天时的典型形态特征。 体外 图1展示了培养情况。图2显示了细胞分离后培养3天的肝星状细胞中GFAP的代表性免疫荧光染色结果。肝星状细胞在培养过程中分化为成纤维肌细胞。 体外 培养。这些活化的星状细胞的一个特征性标志是表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。图3显示了培养第7天活化星状细胞中αSMA和肌球蛋白IIA的免疫荧光染色结果。 体外 培养 



<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="脂质体显微图像，可见细胞；四组实验，脂质分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 肝星状细胞的典型形态学特征。采用所提供的方案从小鼠肝脏中分离肝星状细胞。图像显示细胞分离后2小时（a, b）、第1天（c）和第3天（d）的肝星状细胞形态。 体外 培养。肝星状细胞在培养最初几天于核周区域表现出大量脂质囊泡，并逐渐获得其特有的星状形态。 体外 培养（放大倍数 200x）。



<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="细胞结构分析；显微镜图像显示神经元细胞中的荧光，呈蓝色和橙色。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 肝星状细胞在肝脏中特异性表达 GFAP。在分离星状细胞后的第 3 天，通过免疫荧光染色检测 GFAP（红色）。 体外 细胞核以蓝色显示（Hoechst 染色）。


<img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="细胞结构荧光显微镜图像；肌动蛋白丝和细胞核染色；细胞研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 肝星状细胞分化为肌成纤维细胞。从C57BL/6小鼠中分离的肝星状细胞培养7天后，转移至腔室载玻片，并对aSMA（红色显示）和肌球蛋白IIA（绿色显示）进行染色。细胞核用Hoechst复染（蓝色）。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">SC1 缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>190mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖</td>
 <td>900mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10 ml 的 1M 储存液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>400mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 · 2 H2O</td>
 <td>151mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4 · H2O</td>
 <td>78mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>350mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酚红</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>加水至 1L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">SC2 缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 · 2H2O</td>
 <td>560mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10ml 的 1M 储存液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>400mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 · 2 H2O</td>
 <td>151mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4 · H2O</td>
 <td>78mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>350mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酚红</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>加水至 1L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">GBSS-A 缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>370mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 · 2H2O</td>
 <td>225mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖</td>
 <td>991mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>30mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 · 6 H2O</td>
 <td>210mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 · 7 H2O</td>
 <td>70mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 · 2 H2O</td>
 <td>75mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>227mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酚红</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>加水至 1L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">GBSS-B 缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 · 2H2O</td>
 <td>225mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖</td>
 <td>991mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>370mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>30mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 · 6 H2O</td>
 <td>210mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 · 7 H2O</td>
 <td>70mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4 · 2 H2O</td>
 <td>75mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>227mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酚红</td>
 <td>6mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>加水至 1L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">蛋白酶 E 灌注液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蛋白酶 E</td>
 <td>100mg (4000 PU/mg min) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC2 缓冲液</td>
 <td>200ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">胶原酶 P 灌注液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>胶原酶 P</td>
 <td>85mg (1.78 U/mg lyo)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC2 缓冲液</td>
 <td>200ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">蛋白酶 E-胶原酶 P 混合液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蛋白酶 E</td>
 <td>50mg (4000 PU/mg min) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>胶原酶 P</td>
 <td>85mg (1.78 U/mg lyo)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC2 缓冲液</td>
 <td>50ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">DNase I 溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I</td>
 <td>6mg (约 2000U/mg)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GBSS-B</td>
 <td>3ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Nycodenz 溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nycodenz</td>
 <td>8g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GBSS-A</td>
 <td>28ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 分离肝星状细胞所需的缓冲液和酶溶液。所有缓冲液的pH值应调整至7.3–7.4。此外，建议对所有缓冲液进行无菌过滤。根据所用酶的酶活性调整用量至关重要。

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

肝星状细胞调控肝脏内重要的生理和病理生理过程。此外，星状细胞具有抗原呈递特性，使其成为肝脏免疫反应的重要组成部分。尽管肝星状细胞占肝脏总细胞数的10-15%，但由于其定位于窦周间隙（Disse间隙），分离这些细胞具有较大挑战性。

 本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的简便方法 原位 消化及后续的梯度离心。该方案可分离出高纯度的星状细胞，适用于免疫学检测。


 通过考虑肝星状细胞的三个主要特征——星状形态、胞周脂质囊泡中储存维生素A以及GFAP的表达，可以控制分离细胞的纯度。根据这些标准，采用所述方案获得的星状细胞经免疫荧光染色和流式细胞术评估，纯度通常约为99%。星状细胞分离过程中可能的污染物是库普弗细胞和肝树突状细胞（DCs）。因此，我们通过流式细胞术对星状细胞培养物进行表面分子F4/80（库普弗细胞）和CD11c（DCs）的染色分析。结果显示，未检测到F4/80+和CD11c+细胞，表明星状细胞制备物中不存在库普弗细胞或DCs的污染。因此，无需进一步富集或分选步骤，使得所述肝星状细胞分离方案...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 P</td><td>Roche Group</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Group</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-cv</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fluka</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>梯度离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Accudenz AG</td><td>AN7050/BLK</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-7523-70</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4633</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 E</td><td>Calbiochem</td><td>7433-2</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Masterflex (Cole-Parmer)</td><td>HV-96440-14</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶 (25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>BD Biosciences</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>带翼输液器</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>1SV27EL</td><td></td></tr></tbody></table>

星状细胞分离的七个步骤

Seven Steps to Stellate Cells

肝星状细胞是定居于肝脏、具有星形形态的细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的狄氏间隙中1,2。星状细胞来源于骨髓前体细胞，可储存体内高达80%的维生素A1, 2。在活化后，星状细胞可分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。基于其收缩能力，肌成纤维样星状细胞可调节与门静脉高压相关的血管张力4。最近，我们证实肝星状细胞具有强大的抗原呈递功能，能够激活NKT细胞以及传统T淋巴细胞5。

 本文介绍一种从小鼠肝脏中高效制备肝星状细胞的方法。由于肝星状细胞位于窦周间隙，其分离过程需分步进行。为了使星状细胞能够从狄氏腔隙中被有效分离，需对小鼠肝脏进行灌流 原位 使用消化酶Pronase E和Collagenase P进行灌注。灌注后，肝组织再经Pronase E和Collagenase P的进一步酶处理 体外随后，该方法利用了肝星状细胞内大量储存维生素A的脂滴这一特性。此特性使得可通过在8% Nycodenz梯度溶液中离心，将星状细胞与其他肝细胞分离开来。本文所述方案可获得纯度高且均一的星状细胞群体。在进行荧光显微镜或流式细胞术分析之前，可通过标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色来评估细胞制备物的纯度。此外，光学显微镜下可观察到肝星状细胞特有的星形形态，并富含大量脂滴。 


 综上所述，我们提供了一种高效分离肝星状细胞的详细方案，包括肝星状细胞形态特征及GFAP表达的代表性图像，有助于界定肝星状细胞的特性。

本文介绍了一种从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的方法。为纯化星状细胞，将小鼠肝脏进行消化处理 原位 和 体外 通过蛋白酶-胶原酶处理后再进行密度梯度离心。该技术可获得高纯度的肝星状细胞。

肝星状细胞是定位于肝脏的星形细胞，位于肝窦内皮细胞之间的狄氏间隙中……

本实验的总体目标是从小鼠肝脏中分离肝星状细胞。首先通过两步灌流法，使用消化酶对小鼠肝脏进行体内灌注。灌流完成后，将肝脏切成小块，以提高后续体外消化的效率。最后一步，通过密度梯度离心法将肝星状细胞与其他肝细胞类型分离。最终可获得肝星状细胞，并可通过光学显微镜和免疫荧光显微镜检测其纯度。本实验操作将由来自某实验室的研究生 Patrick Meyer 演示。在进行 NC 两步灌注小鼠肝脏之前，首先将 SC 一缓冲液和酶消化液置于 37 °C 水浴中预热。接下来，设置蠕动泵以获得每分钟 6.5 毫升的层流，并用 SC 一种溶液平衡泵的硅胶管。通过反射消失确认麻醉小鼠已处于深度镇静状态。然后将小鼠仰卧固定在合适的基座上。使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。小心打开腹膜，将肠管移出腹腔并置于动物左侧，以暴露门静脉。该操作中最困难的部分是通过门静脉灌注消化酶对肝脏进行零时灌流，此步骤将予以演示。接下来，在插入导管时应使用体视显微镜，并在灌注过程中密切观察肝脏结构的变化。在体视显微镜下操作时，将输液装置的导管插入门静脉。用 30 毫升 SC 一号溶液开始对肝脏进行灌注。在启动灌注液流后立即打开下腔静脉。肝脏灌注成功的标志是肝组织颜色变浅。接下来，用30毫升Pronase E溶液灌注肝脏。肝脏叶会膨胀，且在用Pronase E溶液充分灌注后，肝小叶在被膜下变得清晰可见。随后用30毫升胶原酶P溶液进行灌注。当胶原酶P灌注完成后，小心地将肝脏从膈肌及周围器官分离，取出小鼠肝脏，并将其置于70毫升预冷的SC两溶液中，冰上保存。此时肝脏已失去原有形态，呈现无张力且无固定形状的状态。小鼠肝脏的消化过程应在无菌条件下进行，于超净工作台内操作。使用锋利的剪刀将肝脏切成约 2×2×2 立方毫米大小的组织块。然后将 70 毫升 SC 两种悬浮液与肝脏组织块及 50 毫升蛋白酶 E 胶原酶 P 溶液混合。加入 1 毫升 DNA 酶一溶液，在 37 摄氏度下搅拌消化肝脏组织 20 分钟。肝脏组织经酶消化后，通过密度梯度离心将星状细胞与其他肝细胞类型分离。开始该操作时，将细胞悬液经70 µm细胞筛过滤至六个50 mL离心管中，用E2缓冲液洗涤细胞，在4°C、600 ×g条件下离心10分钟。离心后，小心吸除每管中的40 mL上清液。然后向每个离心管中加入 150 µL 的 DNA 溶液，重悬细胞。将细胞悬液合并至四个 50 mL Falcon 管中，用 G-B-S-S-P 离心机在 600 ×g、4 °C 条件下离心 10 分钟进行洗涤。小心吸除尽可能多的上清液，避免扰动沉淀，然后向每个离心管中加入 150 µL 的 DNA 溶液。将每管细胞沉淀重悬于 10 毫升 G-B-S-S-B 中。将细胞合并至两个 50 毫升离心管中，并加入 G-B-S-S-B 至每管终体积为 36 毫升。向每管中加入 14 毫升 den 溶液，充分混匀。接下来，将10毫升细胞悬液转移至一根12毫升梯度离心管中，共制备10管。每管中轻柔地在细胞悬液上层覆盖1.5毫升G-B-S-S-B。将梯度液在4摄氏度条件下以1500 ×g离心15分钟，离心过程中不设刹车。随后，肝细胞将沉淀至管底，而星状细胞则位于界面处，呈白色环状。使用5 mL移液管小心收集含有星状细胞的界面层，并转移至50 mL离心管中。加入G-B-S-S-B重悬细胞，于4°C、600 ×g条件下离心10分钟，洗涤细胞。吸去上清液，并将细胞重悬于20毫升含补充物的DMEM培养基中。计数细胞后，以每平方厘米2×10⁴个细胞的浓度将细胞接种至组织培养瓶中，在37°C及5% CO₂条件下培养。细胞制备约两小时后，肝星状细胞应已贴壁，此时更换培养基以去除死细胞和细胞碎片。将细胞放回培养箱。采用本方案从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的代表性结果如图所示。体外培养第1天和第3天的细胞显示出肝星状细胞的典型形态特征，呈星状，且含有脂滴储存。在每个细胞核位点，还可通过检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达来验证分离所得肝星状细胞的纯度。这些图像显示了肝星状细胞中GFAP的代表性免疫荧光染色结果（红色），细胞在分离后已培养三天。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从正常肝脏组织中分离肝星状细胞，以获得足量且高纯度的星状细胞。在肝脏灌注过程中，确保有效的消化至关重要。最后，通过评估肝星状细胞的形态和表型来确定所分离细胞的正确性至关重要。

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科研

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