星状细胞的七个步骤

该程序的总体目标是从小鼠肝脏中分离肝星状细胞。这是通过首先在 C 中用消化酶对小鼠肝脏进行两次灌注来实现的。灌注后，将肝脏切成小块以提高体外消化的效率，然后进行体外消化。

作为最后一步，通过密度梯度离心将肝星状细胞与其他肝细胞类型分离。最终，获得肝星状细胞，其纯度可以通过光学和免疫荧光显微镜评估。演示该程序的是实验室的研究生 Patrick Meyer。为了准备 NC，小鼠肝脏的两次灌注首先在 37 摄氏度的水浴中加热 SC One 缓冲液和酶灌注溶液。

接下来，设置蠕动泵以获得每分钟 6.5 毫升的层流，并用 SC one 溶液平衡泵的硅胶管。现在通过反射丧失确认麻醉的小鼠是深度镇静的。然后将鼠标固定在合适的底座上仰卧位。

用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一个纵向切口，露出腹膜。小心地打开腹膜，将肠道从腹腔移到动物的左侧，以暴露门静脉。该程序最困难的方面是肝脏与消化酶的 zeto 灌注，这将得到证明。

接下来，重要的是在插入套管时使用体视显微镜，并密切监测灌注过程中肝脏结构的变化。在体视显微镜下工作时，将输液装置的套管插入门静脉。用 30 毫升 SC one 溶液开始肝脏灌注。启动流后立即打开 Vanna Cava inferior。

肝脏冲洗成功表明肝组织失去颜色，然后用 30 毫升链霉蛋白酶 E 溶液细读肝脏。肝叶会肿胀，并且在用 30 毫升胶原酶 P 溶液灌注链霉蛋白酶 E 溶液后，小叶会通过胶囊显得明显。当胶原酶 P 的大量完成时，通过小心地从隔膜和周围器官中解剖肝脏并将其储存在冰上的 70 毫升 SC 二溶液中，从小鼠中收获肝脏。

此时的肝脏已经失去了形状，看起来无张力和无定形。小鼠肝脏的消化程序应在无菌条件下进行。在层流罩中。

用锋利的剪刀将肝脏切成大约 2 x 2 x 2 立方毫米的小块。然后将 70 毫升 SC 2 悬浮液和肝块与 50 毫升蛋白酶 E 胶原酶 P 溶液混合。加入 1 毫升 DNA，一种溶液在 37 摄氏度下消化肝脏 20 分钟，同时搅拌。

组织酶消化后，通过密度梯度离心将星状细胞与其他肝细胞类型分离。要开始此程序，通过 70 微米细胞过滤器将细胞悬液过滤到 6 个 50 mLfalcon 管中，然后用 E 2 缓冲液离心机在 600 Gs 和 4 摄氏度下洗涤细胞 10 分钟。离心后，小心地从每个试管中吸出 40 毫升上清液。

然后加入 150 μL DNA，每管 1 种溶液，重悬细胞。将细胞悬液混合到四个 50 mL的Falcon管中，并用G-B-S-S-P离心机在600 Gs和4°C下洗涤10分钟。在不干扰沉淀的情况下小心吸出尽可能多的上清液，并向每个试管中加入 150 μL DNA，一种溶液。

我们将细胞沉淀悬浮在每管 10 毫升 G-B-S-S-B 中。将细胞汇集到两个 50 mL的Falcon管中，并添加G-B-S-S-B，使每管的总体积为36 mL。向每管中加入 14 毫升 den 溶液并充分混合。

接下来，将 10 mL 细胞悬液转移到一个 12 mL 梯度离心管中，总共得到 10 个试管。每管用 1.5 毫升 G-B-S-S-B 轻轻覆盖细胞悬液。将梯度在 1500 Gs 和 4 摄氏度下离心 15 分钟，不得间断。

随后，肝细胞将在试管底部沉淀，而星状细胞在界面中以白环形式出现。使用 5 毫升移液器，小心地收获含有星状细胞的界面，并转移到 50 毫升试管中。加入 G-B-S-S-B 并在 600 Gs 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，洗涤细胞。

吸出上清液，并将细胞重悬于 20 毫升含补充剂的 DMEM 中。计数细胞后，将它们转移到浓度为每平方厘米第四个细胞的 10 倍的 2 倍的组织培养瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。制备后约2小时，肝星状细胞应粘附，更换培养基以洗去死细胞和细胞碎片。

将细胞放回培养箱中，使用该方案从小鼠肝脏制备肝星状细胞的代表性结果如下所示。体外培养第 1 天和第 3 天的细胞显示肝星状细胞的特征形态。它们是天形地衣形状，并表现出脂质囊泡的储存。

在每个核位点，分离的肝星状细胞的纯度也可以通过神经胶质纤维酸性蛋白或 GFAP 的表达来验证。这些图像显示了肝星状细胞中 GFAP 的代表性免疫荧光染色，以红色显示，这些细胞在细胞分离后培养了 3 天。看完这个视频，你应该对如何从神经元肝脏中分离肝星状细胞以获得足够的纯星状细胞产量有一个很好的了解。

确保肝脏灌注时有效消化很重要。最后，通过评估肝 dal 细胞的形态和表型来确定分离细胞的正确实体至关重要。