星状细胞分离的七个步骤

本实验的总体目标是从小鼠肝脏中分离肝星状细胞。首先通过两步灌流法，使用消化酶对小鼠肝脏进行体内灌注。灌流完成后，将肝脏切成小块，以提高后续体外消化的效率。

最后一步，通过密度梯度离心法将肝星状细胞与其他肝细胞类型分离。最终可获得肝星状细胞，并可通过光学显微镜和免疫荧光显微镜检测其纯度。本实验操作将由来自某实验室的研究生 Patrick Meyer 演示。在进行 NC 两步灌注小鼠肝脏之前，首先将 SC 一缓冲液和酶消化液置于 37 °C 水浴中预热。

接下来，设置蠕动泵以获得每分钟 6.5 毫升的层流，并用 SC 一种溶液平衡泵的硅胶管。通过反射消失确认麻醉小鼠已处于深度镇静状态。然后将小鼠仰卧固定在合适的基座上。

使用剪刀和镊子在腹部皮肤上做一纵向切口，暴露腹膜。小心打开腹膜，将肠管移出腹腔并置于动物左侧，以暴露门静脉。该操作中最困难的部分是通过门静脉灌注消化酶对肝脏进行零时灌流，此步骤将予以演示。

接下来，在插入导管时应使用体视显微镜，并在灌注过程中密切观察肝脏结构的变化。在体视显微镜下操作时，将输液装置的导管插入门静脉。用 30 毫升 SC 一号溶液开始对肝脏进行灌注。在启动灌注液流后立即打开下腔静脉。

肝脏灌注成功的标志是肝组织颜色变浅。接下来，用30毫升Pronase E溶液灌注肝脏。肝脏叶会膨胀，且在用Pronase E溶液充分灌注后，肝小叶在被膜下变得清晰可见。随后用30毫升胶原酶P溶液进行灌注。当胶原酶P灌注完成后，小心地将肝脏从膈肌及周围器官分离，取出小鼠肝脏，并将其置于70毫升预冷的SC两溶液中，冰上保存。

此时肝脏已失去原有形态，呈现无张力且无固定形状的状态。小鼠肝脏的消化过程应在无菌条件下进行，于超净工作台内操作。

使用锋利的剪刀将肝脏切成约 2×2×2 立方毫米大小的组织块。然后将 70 毫升 SC 两种悬浮液与肝脏组织块及 50 毫升蛋白酶 E 胶原酶 P 溶液混合。加入 1 毫升 DNA 酶一溶液，在 37 摄氏度下搅拌消化肝脏组织 20 分钟。

肝脏组织经酶消化后，通过密度梯度离心将星状细胞与其他肝细胞类型分离。开始该操作时，将细胞悬液经70 µm细胞筛过滤至六个50 mL离心管中，用E2缓冲液洗涤细胞，在4°C、600 ×g条件下离心10分钟。离心后，小心吸除每管中的40 mL上清液。

然后向每个离心管中加入 150 µL 的 DNA 溶液，重悬细胞。将细胞悬液合并至四个 50 mL Falcon 管中，用 G-B-S-S-P 离心机在 600 ×g、4 °C 条件下离心 10 分钟进行洗涤。小心吸除尽可能多的上清液，避免扰动沉淀，然后向每个离心管中加入 150 µL 的 DNA 溶液。

将每管细胞沉淀重悬于 10 毫升 G-B-S-S-B 中。将细胞合并至两个 50 毫升离心管中，并加入 G-B-S-S-B 至每管终体积为 36 毫升。向每管中加入 14 毫升 den 溶液，充分混匀。

接下来，将10毫升细胞悬液转移至一根12毫升梯度离心管中，共制备10管。每管中轻柔地在细胞悬液上层覆盖1.5毫升G-B-S-S-B。将梯度液在4摄氏度条件下以1500 ×g离心15分钟，离心过程中不设刹车。

随后，肝细胞将沉淀至管底，而星状细胞则位于界面处，呈白色环状。使用5 mL移液管小心收集含有星状细胞的界面层，并转移至50 mL离心管中。加入G-B-S-S-B重悬细胞，于4°C、600 ×g条件下离心10分钟，洗涤细胞。

吸去上清液，并将细胞重悬于20毫升含补充物的DMEM培养基中。计数细胞后，以每平方厘米2×10⁴个细胞的浓度将细胞接种至组织培养瓶中，在37°C及5% CO₂条件下培养。细胞制备约两小时后，肝星状细胞应已贴壁，此时更换培养基以去除死细胞和细胞碎片。

将细胞放回培养箱。采用本方案从小鼠肝脏中分离肝星状细胞的代表性结果如图所示。体外培养第1天和第3天的细胞显示出肝星状细胞的典型形态特征，呈星状，且含有脂滴储存。

在每个细胞核位点，还可通过检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达来验证分离所得肝星状细胞的纯度。这些图像显示了肝星状细胞中GFAP的代表性免疫荧光染色结果（红色），细胞在分离后已培养三天。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从正常肝脏组织中分离肝星状细胞，以获得足量且高纯度的星状细胞。

在肝脏灌注过程中，确保有效的消化至关重要。最后，通过评估肝星状细胞的形态和表型来确定所分离细胞的正确性至关重要。