Name: Multivirus特异性T细胞的生成，预防/治疗异基因造血干细胞移植后的病毒感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习使用核转染树突状细胞与质粒编码病毒抗原，在G-Rex透气培养装置中快速扩增多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。该GMP合规方案适用于异基因造血干细胞移植受者的过继免疫治疗。

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本工作得到了细胞疗法生产援助项目（合同编号：NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C）（C.M.R.）、细胞治疗专项研究中心资助项目 NIH-NHLBI 1 U54 HL081007（C.M.R.）、美国血液与骨髓移植学会青年研究者奖（U.G. 和 J.V.）、白血病与淋巴瘤学会临床研究特聘研究员奖（U.G.）以及艾米·斯特雷泽·马纳塞维特学者奖（A.M.L）的支持。

1. 树突状细胞核转染
<ol>
<li>通过轻柔吹打重悬，收获经塑料贴壁法富集、并在含IL4（1000 U/ml）、GMCSF（800 IU/ml）的Cell Genix培养基中培养5天后，再使用DC成熟细胞因子IL4（1000 U/ml）、GMCSF（800 IU/ml）、IL6（100 ng/ml）、TNF-α（10 ng/ml）、IL1-β（10 ng/ml）和PGE2（1 μg/ml）进一步成熟24小时的单核细胞来源树突状细胞（DC）1。</li>
<li>用台盼蓝计数活细胞，将细胞分装至3个15 ml离心管中，每管细胞数不少于0.5×106，不超过2×106个细胞。</li>
<li>以200g离心10分钟。在此期间，将添加了DC成熟细胞因子的Cell Genix培养基（DC成熟培养基）预热：在12孔组织培养板的三个孔中每孔加入2 ml，置于37°C、5% CO2培养箱中。</li>
<li>离心结束后，吸除上清液，并向各离心管中加入相应的DNA质粒，使终浓度为每管5 μg DNA。具体为：在1号管中加入编码IE1-pp65的质粒，2号管中加入Hexon-Penton质粒，3号管中加入EBNA1-LMP2-BZLF1质粒。</li>
<li>用100 μl Amaxa核转染溶液重悬细胞与DNA，充分混匀后转移至核转染杯中。</li>
<li>将核转染杯放入4D核转染仪中，选择程序CB150（Amaxa/Lonza），按下启动键。</li>
<li>核转染完成后立即向核转染杯中加入500 μl预热的2 ml Cell Genix DC成熟培养基，用移液器轻柔吹打2–3次混匀，然后将转染后的DC转移至已准备好的12孔板中（孔中含剩余的1.5 ml预热DC成熟培养基），放入37°C、5% CO2培养箱继续培养12–18小时。</li>
</ol>
2. T细胞刺激
<ol>
<li>收集并计数核转染后的树突状细胞（DCs），以30Gy剂量进行照射。用10ml CTL培养基（45% RPMI，45% Clicks EHAA，10% FBS，2mM Glutamax）洗涤一次，并重悬于CTL培养基中，浓度为每毫升含3 × 105个DCs。</li>
<li>混合至少7.5×105（2.5ml）至最多15×105（5ml）含有各质粒的DCs，并将混合后的DCs转移至G-Rex装置中，随后将装置放入培养箱。</li>
<li>制备受体细胞时，可使用先前冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）或DC筛选后剩余的非贴壁单个核细胞（通过贴壁法或CD14筛选获得）。将细胞解冻后转移至预温的培养基中，用CTL培养基洗涤一次，再用CTL培养基重悬细胞，计数后调整细胞浓度至每毫升含2×106个细胞。取15×106个细胞（或7.5ml），加入30000U IL-4（终浓度1000U/ml）和300ng IL-7（终浓度10ng/ml）。</li>
<li>将7.5ml PBMCs（含15×106个细胞）转移至G-Rex装置中，并用CTL培养基补足体积至30ml。</li>
<li>将G-Rex装置置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中培养6–7天。</li>
</ol>
3. T细胞扩增
<ol>
<li>在第6-7天，吸出10 ml培养基，然后用10 ml移液管将剩余20 ml培养基中的细胞混匀，使用台盼蓝计数活细胞。若细胞数量&lt;50×106，则补充新鲜培养基加细胞因子；若细胞数量&gt;50×106，则移除10 ml细胞悬液，转移至新的G-Rex培养瓶中，随后向两个G-Rex培养瓶中均加入新鲜CTL培养基加细胞因子进行换液。</li>
<li>继续培养额外4-6天。当细胞扩增达到足够数量后，对CTL细胞进行表型和功能鉴定，并将多余细胞冻存以供后续使用。</li>
</ol>
4. 典型结果：
我们经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）制备流程示意图如下所示 图1。 与传统的多病毒CTL方案使用腺病毒载体和EBV-LCL刺激病毒特异性T细胞相比2 我们已用编码各病毒多种抗原的DNA质粒替代了传染性病毒材料3为刺激三病毒特异性CTL，我们设计了三种多顺反子质粒，分别编码腺病毒的Hexon和Penton、CMV的IE1和pp65，以及EBV的EBNA1、LMP2和BZLF1。选择这些抗原的依据来自我们团队及其他研究团队的临床结果，这些结果表明靶向腺病毒Hexon和Penton的T细胞具有良好的免疫应答2,4-6，且对 CMV-1E1 和 CMV-pp65 具有保护作用 体内7对于EBV，EBNA1是在所有EBV相关恶性肿瘤及正常EBV感染的B细胞中表达的一种免疫优势CD4+ T细胞靶抗原8,9LMP2 在多种 HLA 类型中具有免疫原性，并在大多数 EBV 恶性肿瘤中表达，10,11 而BZLF1编码一种免疫优势性的即刻早期裂解周期抗原，能够刺激大多数个体的CD4+和CD8+ T细胞，可能在控制病毒复制细胞方面具有重要作用12为进一步优化我们的生产工艺，我们与 Nature Technology 合作，生成了最小化、无抗生素（符合 FDA 要求）的质粒用于 CTL 刺激13,14. 采用此策略，我们 consistently 获得的核转染效率为 &gt;35%，同时保持高细胞活力（数据未显示）3. 图2 表明，通过IFNγ ELIspot检测，针对优化后的DNA质粒所产生的病毒特异性T细胞频率高于针对表达相同抗原的传统pShuttle表达质粒（n=8 腺病毒，n=4 巨细胞病毒，n=2 EB病毒）。如图所示，DC:PBMC的最佳比例对于有效T细胞刺激至关重要 图3 其中1:50的比例相比1:20的S:R比例产生的激活效果次优（n=2名供者）。产生具有广泛抗原特异性的足够数量的CTL是实现针对全部三种病毒临床疗效的前提。通过在G-Rex中培养CTL可实现这一目标，因其支持的T细胞扩增效果优于传统的24孔板图 4A)15，而向培养物中添加 IL4 和 IL7 可扩大其库容和特异性，如所示 图 4B 其中评估了在有或无IL4和/或IL7存在下培养的细胞中，针对CMV-pp65衍生的HLA-A2限制性NLV肽反应的T细胞频率16,17为了评估扩增细胞的表型和功能能力，我们进行流式细胞术分析、细胞内细胞因子染色/IFNγ ELIspot 以及 Cr51 对最终用于冷冻保存/输注的产品进行释放检测。通常所获得的细胞为多克隆细胞，包含混合的CD4+和CD8+ T细胞群体，且在两类T细胞中均可检测到抗原特异性。这些细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够杀伤表达病毒抗原的靶细胞，但不能杀伤病毒阴性且部分HLA匹配的靶细胞，表明其不应引发移植物抗宿主病（GvHD）。 体内 (图5).
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="核转染过程示意图；生物反应器中CTL的扩增；质粒DNA的使用；输注结果。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 图1. 重组CTL生成方案。首先，将编码病毒抗原的质粒通过核转染导入树突状细胞（DCs），然后以10:1或20:1的细胞比例与自体外周血单个核细胞（PBMCs）共培养。细胞在G-Rex培养瓶中加入IL-4和IL-7培养10至14天，随后收获、计数，并进行功能、身份鉴定及无菌检测，最后冻存以用于临床应用。
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="通过质粒对照和优化实验比较IFN-γ产生的柱状图" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 图2. 优化的DNA质粒可诱导更强的T细胞激活 体外. 使用编码六邻体（Hexon）和五邻体（Penton）（Adv）、IE1和pp65（CMV），以及EBNA1、LMP2和BZLF1（EBV）的优化型符合FDA标准的质粒，或编码相同抗原的传统pShuttle质粒对树突状细胞（DCs）进行核转染。用这些细胞刺激T细胞，并在刺激后第10天通过IFNγ ELIspot检测分析T细胞特异性。
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="比较免疫反应的柱状图；在1:20和1:50稀释度下，每2×10⁵个CTL中的SFC数对抗原的反应" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 图3. CTL激活的最佳DC:T细胞比例。来自两位供体的DC细胞通过核转染导入三种优化后的质粒，随后以1:20或1:50的DC:PBMC比例用于刺激自体PBMC。在第10天通过IFNγ ELIspot检测再激活T细胞的频率。
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="细胞培养扩增示意图及流式细胞术结果，显示IL-4、IL-7细胞因子的作用。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 图4. 利用促进性细胞因子在G-Rex中进行T细胞扩增。图A展示了G-Rex装置以及通过显微镜观察到的气体可透膜上CTL细胞的形态，同时展示了传统组织培养板与G-Rex中获得的细胞产出量的比较。图B显示了在无细胞因子、单独添加IL-4、单独添加IL-7以及联合添加IL-4和IL-7的条件下扩增培养物中CMV五聚体阳性CTL的频率。
<img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="流式细胞术分析、免疫细胞亚群；CD4/CD8分化、细胞因子反应图谱。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 图5. 扩增的CTL表型与功能。图A展示了扩增多病毒特异性CTL表型的代表性示例，这些细胞为多克隆性，包含CD4+（45%，辅助性）和CD8+（42%，细胞毒性）T细胞的混合群体，其中绝大多数（95%）表达记忆性标志物CD45RO+/CD62L+。图B显示，这些细胞对所有刺激性抗原均具有特异性，并通过细胞内细胞因子染色检测抗原刺激后IFNγ和TNFα的产生，证实其具有多效功能。图C显示，通过Cr51释放实验测定，扩增的CTL具有功能活性。以自体LCL细胞作为靶细胞，单独使用或转导空载体或表达CMV-pp65的腺病毒载体；同种异体反应性则通过使用同种异体PHA活化母细胞作为靶细胞进行评估。

<ol><li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function%3A+a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li>
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<li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li>
<li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li>
<li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4%28%2B%29+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li>
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<li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans%3A+lessons+from+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li>
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<li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li>
<li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pDNAVACCultra+vector+family%3A+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li>
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<li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li>
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</ol>

Juan F. Vera 担任 Wilson Wolf Manufacturing 公司的顾问。其余作者无相关披露信息。

病毒感染在因疾病本身或其治疗而导致免疫功能低下的患者中，是造成显著发病率和死亡率的重要原因。例如，在造血干细胞移植（HSCT）后，由EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）等持续性疱疹病毒以及呼吸道合胞病毒（RSV）等呼吸道病毒引起的感染已被广泛认知；而近年来，腺病毒（Adv）、BK病毒以及人疱疹病毒（HHV）-6所致感染的重要性也逐渐受到重视。尽管某些病毒感染的标准治疗手段为药物治疗，但这些药物往往具有显著的毒性，易诱导耐药株的产生，且疗效常不理想。相比之下，来源于干细胞供体的病毒特异性T细胞在预防和治疗造血干细胞移植（HSCT）环境下的病毒感染或疾病方面已被证实安全且有效2,5,6,18-21。然而，T细胞免疫治疗的广泛应用最终受限于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）制备过程中的高昂成本、技术复杂性以及所需时间较长等问题。
我们在此手稿中描述的生成多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的创新且快速的方法，将显著提高针对病毒性疾病的细胞毒性T细胞治疗的可行性，从而使该策略有望成为免疫功能低下宿主的标准治疗方案。利用质粒核转染的树突状细胞（DC）作为抗原呈递细胞（APC），可在同一细胞中避免病毒载体或多种病毒抗原共表达时可能发生的竞争效应，从而在MHC I类和II类分子上均实现抗原呈递，因为每种质粒分别使用不同的DC细胞群进行处理。3使用IL-4/7可增强T细胞的存活与增殖，从而相应地提高抗原特异性T细胞的频率及其应答谱系16,17最后，在G-Rex中培养可显著降低T细胞在培养过程中的凋亡。气体交换（O₂2 在和 CO2 氧气通过烧瓶底部的透气性硅胶膜进行交换，可防止细胞缺氧，同时允许在细胞上方保留更厚的培养基，从而提供更多营养物质并稀释代谢废物。当保护性抗原被确定后，该平台还可拓展应用于其他病毒。

<table><tbody><tr><td>CellGenix</td><td>CellGenix</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>IL4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>204-IL/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector</td><td>Amaxa</td><td>AAF-1001B &amp; AAF-1001X</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector试剂盒</td><td>Amaxa</td><td>V4XP-3012</td><td></td></tr><tr><td>质粒</td><td>NTC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>215-GM/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>201-LB-025</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>R&amp;D Systems</td><td>206-IL-CF</td><td></td></tr><tr><td>TNF&amp;#945;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-010</td><td></td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6532-1MG</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex</td><td>Wilson Wolf Manufacturing</td><td>AY11-00027</td><td></td></tr></tbody></table>

多病毒特异性t细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

病毒性感染可导致异基因造血干细胞移植（HSCT）受者出现发病率和死亡率。我们及其他研究者已成功利用单核细胞以及经腺病毒载体基因修饰的EB病毒转化的淋巴母细胞样细胞（EBV-LCL）作为抗原呈递细胞（APCs），生成并输注针对EB病毒（EBV）、巨细胞病毒（CMV）和腺病毒（Adv）的特异性T细胞。低至每公斤体重2×105的三病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在输注后可扩增数个数量级，并显示出可预防和治疗其他现有疗法难以控制的严重病毒感染。然而，这一具有前景的方法的大范围应用受到高生产成本、制备工艺复杂以及制备周期长（EBV-LCL生成需4–6周，CTL制备需4–8周，总计10–14周）的限制。为克服这些局限，我们开发了一种新的符合GMP标准的CTL制备方案。首先，我们采用经核转染编码EBV抗原LMP2、EBNA1和BZLF1，Adv抗原Hexon和Penton，以及CMV抗原pp65和IE1的DNA质粒的树突状细胞（DCs）作为抗原呈递细胞，替代腺病毒载体刺激T细胞。这些APC能够重新激活针对所有刺激抗原的特异性T细胞。其次，在含有IL-4（1,000 U/ml）和IL-7（10 ng/ml）的培养体系中培养活化的T细胞，可增加并维持T细胞系中特异性T细胞的多样性及频率。第三，我们采用了一种新型透气性培养装置（G-Rex），可在单次刺激后促进大量细胞的扩增与存活，从而无需使用EBV-LCL，并减少技术人员的干预。通过实施这些改进，我们现在可在仅10天内生产出靶向EBV、CMV和Adv的多特异性CTL，每106个细胞的生产成本降低&gt;90%，且该方法可进一步拓展至其他具有保护性的病毒抗原。我们经美国FDA批准的方法，有望用于高风险异基因HSCT受者的预防和治疗。

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

病毒感染导致异基因造血干细胞移植（HSCT）受者出现发病率和死亡率。我们及其他研究者已成功……

以下实验方案的总体目标是快速生成适合过继性转移至同种异体造血干细胞移植（HSCT）受者的供体来源的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。该目标首先通过将编码病毒抗原的质粒转染树突状细胞（DCs），使其具备抗原提呈能力，从而启动抗原呈递过程。第二步，利用转染后的DCs刺激抗原特异性T细胞，并在IL-4和IL-7存在的条件下，于一种称为GRe的气体可渗透培养装置中进行扩增。接下来，在培养七天后，对细胞进行传代并重新接种，同时更换培养基，以维持细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体外的最大程度扩增。最后，在第12天收获细胞，并检测其纯度、效价和安全性，随后将其冷冻保存，用于后续临床应用。最终，可获得具有多病毒特异性且异体反应性极低的CTL细胞系，其特性可通过细胞内细胞因子染色、γ-干扰素分泌及细胞毒活性加以证实。多病毒特异性细胞毒性T细胞系的制备过程耗时且繁琐。该方法需要使用EB病毒转化的B细胞系和腺病毒载体，整个流程约需三个月。我们的新方法不使用病毒载体。细胞在培养过程中呈指数级生长，且细胞损耗极小，因此该操作步骤快速且成本效益高。本实验操作由实验室临床研究员 Eureka Gerdeman 演示，其负责收获在 Cellgenic 培养基中生成的单核细胞来源的树突状细胞（DCs），该培养基中添加了 IL-4 和 G-M-CS-F；随后，通过使用三毫升移液管轻柔重悬，将细胞在成熟细胞因子中培养 24 小时以诱导成熟。使用台盼蓝对 DCs 进行计数，然后将细胞转移至三个 15 毫升离心管中，每管细胞数量不少于 0.5 × 10⁶，且不超过 2 × 10⁶ 个细胞。随后将DCS在200 × g条件下离心10分钟。在此期间，准备6毫升细胞培养基（Genix培养基），添加与之前相同的树突状细胞成熟细胞因子混合物，并将2毫升培养基分装至12孔组织培养板的三个孔中，在未使用的孔中加入2毫升无菌水。将该培养板转移至37°C、含5% CO₂的培养箱中预热。待细胞离心结束后，吸除上清液，并向每根离管中加入相应的DNA质粒，使每管中DNA的终浓度为5微克。此处将编码IE1和PP65的质粒加入第1管，将编码heon penton的质粒加入第2管，将编码EBNA1、LMP2和BZLF1的质粒加入第3管。用100微升核转染溶液重悬DC细胞与DNA。充分混匀后，将混合物转移至NU核转染比色皿中。将比色皿放入四D核转染仪中，选择程序CB150，并在核转染开始后立即按下启动键。向每个样本中加入500微升预热的CELLGENIC DC成熟培养基，通过轻轻吹打2至3次混匀细胞，然后将转染后的DC转移至已准备好的12孔板中，每孔含有1.5毫升预热的DC成熟培养基。将培养板放入培养箱中继续培养12至18小时，收获细胞并计数，随后对转染后的DC进行辐照。用10毫升CTL培养基洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于培养基中，浓度为每毫升含3×10⁵个DC，收集来自三个转染组的细胞，总量至少为7.5×10⁵个（即2.5毫升）或最多15×10⁵个（即5毫升），将混合后的质粒转染DC转移至G Rex装置中。然后将装置放入培养箱中以制备应答细胞。使用树突状细胞筛选后剩余的非贴壁单个核细胞。将应答细胞转移至预温的培养液中。用CTL培养基重悬细胞，洗涤一次。将细胞悬浮于CTL培养基中。计数细胞，并调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞。取15乘以10的6次方个细胞或7.5毫升，并补充细胞因子IL-4和IL-7。将7.5毫升PBMC转移至G Rex中，并用CTL培养基补足生物反应器至总体积30毫升。最后，将G REX放入培养箱中培养6至7天。在第6至第7天，吸出10毫升培养基。然后用10毫升移液管将剩余的20毫升培养基混匀。如果细胞数量少于50×10⁶个，则使用台盼蓝对细胞进行计数。用新鲜培养基和细胞因子补充培养体系。如果细胞数量超过50乘以10的6次方，则移除10毫升细胞悬液，将细胞转移至新的G rex培养器中，然后用新鲜的CTL培养基和细胞因子同时培养两个G rex中的细胞，继续培养额外的四到六天，以扩增足够数量的细胞，随后收获并计数细胞。将未用于表型或功能分析的细胞进行冻存，以供将来使用。代表性结果表明，多克隆DNA质粒诱导产生的多病毒特异性T细胞（通过干扰素γ酶联免疫斑点法检测）及其反应性细胞频率优于使用表达相同抗原的传统PHU质粒所建立的细胞系。DC 与 PBMC 的最佳比例对于有效的 T 细胞刺激至关重要，如本图所示，当比例为 1:50 时，与 1:20 的效应细胞与反应细胞比例相比，再激活效果次优。在 G rex 培养系统中进行 CTL 培养，其 T 细胞扩增效果优于传统的 24 孔板。在培养体系中添加 IL-4 和 IL-7 可增加扩增细胞的多样性及特异性，如本图所示，在存在或不存在 IL-4 和/或 IL-7 的条件下培养的细胞中，针对 CMV pp65 衍生的 HLA-A*02 限制性 NLV 肽产生反应的 T 细胞频率被评估。本图展示了一个快速扩增的多病毒特异性 CTL 表型的代表性样本，这些 CTL 为多克隆性，包含 CD4 阳性和 CD8 阳性 T 细胞的混合群体，其中大多数表达记忆性标志物 CD45RO 和 CD62L。扩增后的 CTL 对所有刺激抗原均具有特异性，并且具有多功能性，通过胞内细胞因子染色法评估抗原刺激后干扰素 γ 和 TNF-α 的产生，并通过铬释放实验进行验证。扩增后的CTL能够特异性地杀伤病毒靶细胞，但对非病毒性HLA错配靶细胞无非特异性杀伤活性，这是至关重要的安全性考量。观看本视频后，您应能充分理解如何快速制备符合GMP标准、可用于过继性转移治疗病毒相关疾病患者的多病毒特异性细胞毒性T细胞系。该方法的简化将有助于突破专业制备机构的限制，使该技术有望成为免疫功能低下且易感病毒相关疾病患者的标准治疗手段。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

Multivirus特异性T细胞的生成，预防/治疗异基因造血干细胞移植后的病毒感染

本文介绍一种在人外周血单个核细胞中诱导同种抗原特异性无应答的简单技术。该技术可应用于临床，以产生非同种反应性供体细胞。输注这些细胞可改善异基因造血干细胞移植后的免疫重建，并降低毒性反应。...

通过共刺激信号阻断的同种抗原刺激诱导人外周血单个核细胞中同种抗原特异性无应答性

本文描述了首个符合药品生产质量管理规范（GMP）的从脐带血中制备病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，脐带血是主要含有初始T细胞的来源。...

扩增靶向巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的脐带血细胞毒性T淋巴细胞

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+...

利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

新型功能性检测方法，如γ干扰素（IFN-γ）ELISpot，可在单细胞水平检测细胞因子的产生，同时对T细胞应答进行定量和定性表征，可用于评估针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞介导免疫应答。...

开发干扰素-γ ELISpot检测法评估脐带血移植后水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫反应

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

本方案的目的是利用一种台式、自动化、第二代细胞富集装置，制备针对病原体的临床级T细胞。该装置采用封闭式细胞因子捕获系统，无需专业人员操作，也无需使用GMP设施。所生成的巨细胞病毒pp65特异性T细胞可直接用于患者治疗。...

使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性T细胞的自动化富集及其临床应用

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。...

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

学习使用核转染树突状细胞与质粒编码病毒抗原，在G-Rex透气培养装置中快速扩增多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法。该GMP合规方案适用于异基因造血干细胞移植受者的过继免疫治疗。

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

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