多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

以下实验方案的总体目标是快速生成适合过继性转移至同种异体造血干细胞移植（HSCT）受者的供体来源的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。该目标首先通过将编码病毒抗原的质粒转染树突状细胞（DCs），使其具备抗原提呈能力，从而启动抗原呈递过程。第二步，利用转染后的DCs刺激抗原特异性T细胞，并在IL-4和IL-7存在的条件下，于一种称为GRe的气体可渗透培养装置中进行扩增。

接下来，在培养七天后，对细胞进行传代并重新接种，同时更换培养基，以维持细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体外的最大程度扩增。最后，在第12天收获细胞，并检测其纯度、效价和安全性，随后将其冷冻保存，用于后续临床应用。最终，可获得具有多病毒特异性且异体反应性极低的CTL细胞系，其特性可通过细胞内细胞因子染色、γ-干扰素分泌及细胞毒活性加以证实。

多病毒特异性细胞毒性T细胞系的制备过程耗时且繁琐。该方法需要使用EB病毒转化的B细胞系和腺病毒载体，整个流程约需三个月。我们的新方法不使用病毒载体。

细胞在培养过程中呈指数级生长，且细胞损耗极小，因此该操作步骤快速且成本效益高。本实验操作由实验室临床研究员 Eureka Gerdeman 演示，其负责收获在 Cellgenic 培养基中生成的单核细胞来源的树突状细胞（DCs），该培养基中添加了 IL-4 和 G-M-CS-F；随后，通过使用三毫升移液管轻柔重悬，将细胞在成熟细胞因子中培养 24 小时以诱导成熟。使用台盼蓝对 DCs 进行计数，然后将细胞转移至三个 15 毫升离心管中，每管细胞数量不少于 0.5 × 10⁶，且不超过 2 × 10⁶ 个细胞。

随后将DCS在200 × g条件下离心10分钟。在此期间，准备6毫升细胞培养基（Genix培养基），添加与之前相同的树突状细胞成熟细胞因子混合物，并将2毫升培养基分装至12孔组织培养板的三个孔中，在未使用的孔中加入2毫升无菌水。将该培养板转移至37°C、含5% CO₂的培养箱中预热。

待细胞离心结束后，吸除上清液，并向每根离管中加入相应的DNA质粒，使每管中DNA的终浓度为5微克。此处将编码IE1和PP65的质粒加入第1管，将编码heon penton的质粒加入第2管，将编码EBNA1、LMP2和BZLF1的质粒加入第3管。用100微升核转染溶液重悬DC细胞与DNA。

充分混匀后，将混合物转移至NU核转染比色皿中。将比色皿放入四D核转染仪中，选择程序CB150，并在核转染开始后立即按下启动键。

向每个样本中加入500微升预热的CELLGENIC DC成熟培养基，通过轻轻吹打2至3次混匀细胞，然后将转染后的DC转移至已准备好的12孔板中，每孔含有1.5毫升预热的DC成熟培养基。将培养板放入培养箱中继续培养12至18小时，收获细胞并计数，随后对转染后的DC进行辐照。用10毫升CTL培养基洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于培养基中，浓度为每毫升含3×10⁵个DC，收集来自三个转染组的细胞，总量至少为7.5×10⁵个（即2.5毫升）或最多15×10⁵个（即5毫升），将混合后的质粒转染DC转移至G Rex装置中。

然后将装置放入培养箱中以制备应答细胞。使用树突状细胞筛选后剩余的非贴壁单个核细胞。将应答细胞转移至预温的培养液中。

用CTL培养基重悬细胞，洗涤一次。将细胞悬浮于CTL培养基中。计数细胞，并调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞。

取15乘以10的6次方个细胞或7.5毫升，并补充细胞因子IL-4和IL-7。将7.5毫升PBMC转移至G Rex中，并用CTL培养基补足生物反应器至总体积30毫升。最后，将G REX放入培养箱中培养6至7天。在第6至第7天，吸出10毫升培养基。

然后用10毫升移液管将剩余的20毫升培养基混匀。如果细胞数量少于50×10⁶个，则使用台盼蓝对细胞进行计数。用新鲜培养基和细胞因子补充培养体系。

如果细胞数量超过50乘以10的6次方，则移除10毫升细胞悬液，将细胞转移至新的G rex培养器中，然后用新鲜的CTL培养基和细胞因子同时培养两个G rex中的细胞，继续培养额外的四到六天，以扩增足够数量的细胞，随后收获并计数细胞。将未用于表型或功能分析的细胞进行冻存，以供将来使用。代表性结果表明，多克隆DNA质粒诱导产生的多病毒特异性T细胞（通过干扰素γ酶联免疫斑点法检测）及其反应性细胞频率优于使用表达相同抗原的传统PHU质粒所建立的细胞系。

DC 与 PBMC 的最佳比例对于有效的 T 细胞刺激至关重要，如本图所示，当比例为 1:50 时，与 1:20 的效应细胞与反应细胞比例相比，再激活效果次优。在 G rex 培养系统中进行 CTL 培养，其 T 细胞扩增效果优于传统的 24 孔板。在培养体系中添加 IL-4 和 IL-7 可增加扩增细胞的多样性及特异性，如本图所示，在存在或不存在 IL-4 和/或 IL-7 的条件下培养的细胞中，针对 CMV pp65 衍生的 HLA-A*02 限制性 NLV 肽产生反应的 T 细胞频率被评估。本图展示了一个快速扩增的多病毒特异性 CTL 表型的代表性样本，这些 CTL 为多克隆性，包含 CD4 阳性和 CD8 阳性 T 细胞的混合群体，其中大多数表达记忆性标志物 CD45RO 和 CD62L。扩增后的 CTL 对所有刺激抗原均具有特异性，并且具有多功能性，通过胞内细胞因子染色法评估抗原刺激后干扰素 γ 和 TNF-α 的产生，并通过铬释放实验进行验证。

扩增后的CTL能够特异性地杀伤病毒靶细胞，但对非病毒性HLA错配靶细胞无非特异性杀伤活性，这是至关重要的安全性考量。观看本视频后，您应能充分理解如何快速制备符合GMP标准、可用于过继性转移治疗病毒相关疾病患者的多病毒特异性细胞毒性T细胞系。该方法的简化将有助于突破专业制备机构的限制，使该技术有望成为免疫功能低下且易感病毒相关疾病患者的标准治疗手段。