Name: 一个细胞检测系统估算的GM - CSF抗体的中和能力，采用重组可溶性GM - CSF受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解利用重组可溶性GM-CSF受体建立无细胞检测系统，用于定量评估GM-CSF自身抗体的中和能力。该方法具有高重现性，可准确测量抗体对受体结合的抑制效果。

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我们非常感谢 K. Nakagaki、H. Ishii 博士、K. Suzuki 博士、A. Yamagata 和 K. Oofusa 所做出的宝贵贡献。

1. sGMRα 的制备与纯化
<ol>
<li>通过聚合酶链式反应（PCR）从人胎盘cDNA文库中扩增sGMRα的cDNA。</li>
<li>通过另一次PCR，在PCR扩增产物的3'端添加50个碱基的杆状病毒多角体基因5'-UTR序列以及27个碱基编码的RGS His标签。</li>
<li>将扩增后的PCR产物插入质粒pMSG1.1MG中。</li>
<li>将构建体psGMR/M1.1MG与辅助载体pHA3PIG共同注射入家蚕pnd-w1品系的蚕卵中。</li>
<li>在25°C条件下饲养孵化的G0代幼虫至成虫，通过兄妹交配或与pnd-w1交配获得G1代胚胎，并筛选眼部具有MGFP表达的个体，以获得携带sGMRα基因的转基因家蚕。</li>
<li>使用含有500 mM NaCl的磷酸盐缓冲液从转基因家蚕的蚕茧中提取重组sGMRα，并在4°C下搅拌24小时。</li>
<li>以20000 g离心15分钟，去除沉淀物。</li>
<li>将上清液上样至镍亲和层析柱。</li>
<li>用含10 mM咪唑、500 mM NaCl和20 mM磷酸钠（pH 6.3）的缓冲液洗涤层析柱，然后用10 mM至250 mM咪唑的线性梯度进行洗脱。合并含有纯化sGMRα的洗脱组分，并将其对磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）进行透析。</li>
</ol>
2. 重组GM-CSF的生物素标记
<ol>
<li>通过透析去除山梨醇制备物，透析液为 PBS。</li>
<li>在冰上，向溶液中加入 1ml 冰冷的 20 mM 高碘酸钠溶液（4°C）。</li>
<li>将样品在冰上避光孵育 30 分钟。</li>
<li>向溶液中加入甘油，终浓度为 15 mM。</li>
<li>用 100 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.5）对溶液进行透析。</li>
<li>向溶液中加入生物素酰肼，终浓度为 5 mM，并在室温下持续振荡反应 2 小时。</li>
<li>通过 PBS（pH 7.4）透析去除未反应的物质。</li>
</ol>
3. 一种无细胞的 GM-CSF 受体-配体结合检测方法
<ol>
<li>在4°C条件下，用50μl单克隆抗多聚组氨酸抗体包被微量滴定板，孵育过夜。</li>
<li>用500μl PBST洗涤五次。</li>
<li>加入100μl封闭液，在4°C下孵育3小时。</li>
<li>用500μl PBST洗涤五次。</li>
<li>加入50μl含sGMRα的封闭液，在4°C下孵育过夜。</li>
<li>用500μl PBST洗涤五次。</li>
<li>加入25μl含GM-CSF自身抗体的样本，随后加入25μl生物素标记的GM-CSF，在4°C下孵育1小时，以形成sGMRα-GM-CSF复合物。</li>
<li>用500μl PBST洗涤五次。</li>
<li>加入50μl 0.4mM链霉亲和素碱性磷酸酶，在4°C下孵育1小时，用于检测与生物素标记的GM-CSF结合的sGMRα。</li>
<li>用500μl PBST洗涤五次。</li>
<li>向反应体系中加入50μl化学发光底物，在室温下孵育1小时。</li>
<li>使用化学发光酶标仪检测化学发光信号。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
GM-CSF受体信号转导通路的第一步是GM-CSF与其细胞表面的GM-CSF受体α亚基结合。由于GM-CSF自身抗体可在体外特异性结合GM-CSF并阻断其与受体的结合16,17，我们推测这些自身抗体通过直接结合GM-CSF来抑制这一初始反应。如先前所述（参考文献9-15），我们采用转基因家蚕技术获得了大量高纯度的重组可溶性GMRα（sGMRα）。
当在非还原条件下将家蚕来源的重组sGMRα进行SDS-PAGE电泳时，sGMRα显示出单体（45 kDa）和二聚体（90 kDa）两种形式，而在还原条件下仅检测到单体形式（图1B），表明该重组sGMRα是单体与二硫键连接的二聚体的混合物18。
利用无细胞系统（图 2A），我们评估了 GM-CSF 自身抗体对 GM-CSF 与 sGMRα 结合的抑制作用（图 2B 和图 2C）。这些方法已在 Urano 等人的参考文献 19 中描述。在不同浓度的 GM-CSF 自身抗体条件下，生长抑制与结合抑制之间存在高度相关性（r=0.988，p=0.002）（图 3A）19。同样，结合抑制与生长抑制之间也表现出显著相关性。GM-CSF 自身抗体以剂量依赖的方式增强结合抑制效应（图 3B）19。来自不同患者的血清 IgG 组分在这两个参数之间也相互相关（r=0.589，p=0.006，图 3C）。结合抑制和生长抑制均与 Kd 值无相关性，因此这两个参数不受结合亲和力的影响19。因此，我们评估了三次独立实验中三个不同样本所获得的结合抑制与生长抑制数据的可重复性。变异系数表明，无细胞系统的性能优于生物活性测定法（表 1）。
<img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="家蚕基因编辑过程；包含遗传构建体和SDS-PAGE蛋白质分析结果的示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 利用转基因家蚕生产sGMRα的操作流程图。A) 转化载体的结构9-11。B) 纯化的sGMRα在还原和非还原条件下的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色结果。sGMRα，可溶性GM-CSF受体α；MGFP，monster绿色荧光蛋白；BmNPVpol5'-UTR，Bombyx mori核型多角体病毒多角体蛋白基因的5'-非翻译区序列；SV40 polyA，SV40 polyA信号序列；P3xP3，3xP3启动子；Pser1，ser1启动子；fibL polyA，丝心蛋白L链polyA信号序列；hr3，Bombyx mori核型多角体病毒hr3增强子。
<img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="用于检测GM-CSF抗体的ELISA示意图，显示非中和性抗体与中和性抗体的信号响应差异。" fo:content-width="6in" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 无细胞检测系统的示意图。A) 利用家蚕表达的sGMRα进行的竞争性结合实验。B) 中和性与非中和性抗体在无细胞系统中对结合抑制的影响。C) 不同浓度的中和性抗体与非中和性抗体在结合抑制效果上的差异。GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；sGMRα，可溶性GM-CSF受体α；His，RGS-His标签；AP，碱性磷酸酶。
<img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="抗体抑制中的静态平衡；图表显示相关性、IC&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt;及统计结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. GM-CSF多克隆抗体或自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）患者血清IgG组分对GM-CSF与其可溶性受体α亚基（sGMRα）结合的抑制作用。A）GM-CSF自身抗体对结合抑制与生长抑制之间的关系。B）不同浓度GM-CSF自身抗体下的结合抑制情况。C）血清IgG组分对结合抑制率与生长抑制率的IC50之间的关系19。IC50，50%抑制浓度；GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>样品</td>
 <td>A</td>
 <td>B</td>
 <td>C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="4">批间变异</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>测定次数</td>
 <td>3</td>
 <td>3</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>平均值（% 结合抑制）</td>
 <td>61.6 </td>
 <td>63.8</td>
 <td>69.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>平均值（% 生长抑制）</td>
 <td>21.0</td>
 <td>73.4</td>
 <td>82.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>变异系数（%）（% 结合抑制）</td>
 <td>6.0</td>
 <td>5.6</td>
 <td>8.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>变异系数（%）（% 生长抑制）</td>
 <td>64.4</td>
 <td>18.3</td>
 <td>10.4</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
两种检测均在5 ng/ml GM-CSF及等浓度GM-CSF自身抗体条件下进行。
表1. 通过三次独立实验获得的结合率与生长抑制率的变异系数比较。

<ol><li>Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neutralizing+capacity+of+GM-CSF+reflects+disease+severity+in+a+patient+with+pulmonary+alveolar+proteinosis+successfully+treated+with+inhaled+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF.</a> Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).</li>
<li>Tazawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+lung+immunity+in+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).</li>
<li>Inoue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+large+cohort+of+patients+with+autoimmune+pulmonary+alveolar+proteinosis+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan.</a> Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).</li>
<li>Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+autoantibodies+specifically+eliminate+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+activity+in+the+lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis.</a> Blood. 103, 1089-1098 (2004).</li>
<li>Sakagami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+GM-CSF+autoantibodies+and+reproduction+of+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis.</a> N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).</li>
<li>Raines, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular+cloning+of+a+soluble+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).</li>
<li>Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+soluble+form+of+the+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor+alpha+chain+from+a+myelomonocytic+cell+line.+Expression%2C+biologic+activity%2C+and+preliminary+analysis+of+transcript+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution.</a> Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).</li>
<li>Prevost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29+and+inflammatory+stimuli+up-regulate+secretion+of+the+soluble+GM-CSF+receptor+in+human+monocytes%3A+evidence+for+ectodomain+shedding+of+the+cell+surface+GM-CSF+receptor+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit.</a> J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).</li>
<li>Iizuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+recombinant+mouse+monoclonal+antibody+in+transgenic+silkworm+cocoons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons.</a> FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).</li>
<li>Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+enhancement+of+recombinant+protein+synthesis+in+transgenic+silkworms+by+a+5%27-untranslated+region+of+polyhedrin+gene+of+Bombyx+mori+Nucleopolyhedrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus.</a> J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).</li>
<li>Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+combinatorial+protein+library+displayed+on+yeast+cell+surface+using+DNA+random+priming+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method.</a> J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).</li>
<li>Tamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).</li>
<li>Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+silkworms+produce+recombinant+human+type+III+procollagen+in+cocoons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons.</a> Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).</li>
<li>Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+silkworm+that+secretes+recombinant+proteins+in+the+sericin+layer+of+cocoon%3A+production+of+recombinant+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin.</a> J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).</li>
<li>Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+germline+transgenic+silkworm+that+secretes+recombinant+proteins+in+the+sericin+layer+of+cocoon%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon.</a> Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).</li>
<li>Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+as+an+autoimmune+disease+with+neutralizing+antibody+against+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 190, 875-880 (1999).</li>
<li>Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungs+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+alveolar+proteinosis+express+a+factor+which+neutralizes+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor.</a> FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).</li>
<li>Brown, C., Pihl, C., Murray, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+soluble+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+receptor%3A+identification+of+the+functional+ligand-binding+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species.</a> Cytokine. 9, 219-225 (1997).</li>
<li>Urano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+assay+to+estimate+the+neutralizing+capacity+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies.</a> J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).</li>
<li>Hayashida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+second+subunit+of+the+receptor+for+human+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28GM-CSF%29%3A+reconstitution+of+a+high-affinity+GM-CSF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).</li>
<li>Hansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+GM-CSF+receptor+complex+reveals+a+distinct+mode+of+cytokine+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation.</a> Cell. 134, 496-507 (2008).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

该无细胞检测法能够以优异的重复性和快速性评估GM-CSF自身抗体的中和能力。本检测方法可用于评价GM-CSF自身抗体或患者血清IgG组分对结合的抑制作用。实验数据显示，无细胞检测法的结合抑制作用与利用TF-1细胞进行的生物活性检测中的生长抑制作用之间存在相关性。尽管该生物活性检测已被广泛使用，但在不同实验机构及不同时间点之间比较数据时存在困难，而采用这一新系统可避免此类问题。
GM-CSF 与 sGMRα 以低亲和力结合，形成二元复合物20。最近的研究表明，人源 GM-CSF 在细胞表面与 GM-CSF 受体 α 和 GM-CSF 受体 β 结合，形成具有高亲和力的十二聚体复合物21。因此，基于单体 GM-CSF 受体 α 和二聚体 GM-CSF 受体 β 组成的三元复合物的检测系统，可能成为未来改进无细胞检测方法的候选体系。

<table><tbody><tr><td>人胎盘 cDNA 文库</td><td>Takara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镍亲和层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>生物素酰肼（EZ-Link Biotin Hydrazide）</td><td>PIERCE</td><td>21339</td><td></td></tr><tr><td>重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF，Leukine）</td><td>Genzyme Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immobilizer Amino 氨基化固相载体</td><td>Nalge Nunc International</td><td>436007</td><td></td></tr><tr><td>小鼠源单克隆抗多聚组氨酸抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1029</td><td>0.2ml</td></tr><tr><td>封闭液（StabilCoat）</td><td>Surmodics</td><td>SC01-1000</td><td>1000ml</td></tr><tr><td>ZyMAX 链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>43-8322</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Star 即用型显色液（含 Sapphire-II）</td><td>Applied Biosystems</td><td>T2214</td><td></td></tr><tr><td>化学发光板式读数仪</td><td>BERTHOLD TECHNOLOGIES</td><td>TriStar LB 941</td><td></td></tr></tbody></table>

利用重组可溶性 gm-csf 受体评估 gm-csf 抗体中和能力的无细胞检测系统

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

背景：此前，我们已证实，在自身免疫性肺泡蛋白沉积症（PAP）患者中，GM-CSF 自身抗体的中和能力而非其浓度与疾病严重程度相关1-3。由于肺部 GM-CSF 生物活性的丧失很可能是导致自身免疫性 PAP 的原因4,5，因此检测 GM-CSF 自身抗体的中和能力，有望用于评估每位 PAP 患者的疾病严重程度。
迄今为止，GM-CSF 自身抗体的中和能力主要通过评估其对 GM-CSF 刺激的人骨髓细胞或 TF-1 细胞增殖的抑制作用来测定6-8。然而，在该生物活性检测体系中，由于在技术上难以将细胞维持在稳定的恒定状态，常常难以获得可靠的数据，也难以对不同实验室之间的数据进行比较。
目的：利用无细胞受体结合实验，模拟粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其细胞表面受体的结合。
方法：采用转基因家蚕技术获得大量高纯度的重组可溶性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α（sGMRα）9-13。重组sGMRα存在于丝胶蛋白的亲水层中，未与丝蛋白融合，因此可通过中性水溶液从蚕茧中简便地提取出纯度良好的产物14,15。幸运的是，其寡糖结构与GM-CSF结合密切相关，且相较于其他昆虫或酵母表达系统所产生的产物，更接近于人源sGMRα的糖结构。
结果：使用sGMRα的无细胞检测系统获得了高可塑性和高可靠性的数据。多克隆GM-CSF自身抗体以剂量依赖的方式抑制GM-CSF与sGMRα的结合，其模式与使用TF-1细胞的生物活性检测相似，表明我们新建立的基于sGMRα的无细胞检测系统在测定GM-CSF自身抗体的中和活性方面，比使用TF-1细胞或人骨髓细胞的生物检测系统更具优势。
结论：我们建立了一种无细胞检测方法，用于定量测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）自身抗体的中和能力。

我们设计了一种无细胞受体结合实验，用于评估粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与受体的结合情况。该方法能够以优异的重复性，检测GM-CSF自身抗体对生物素标记的GM-CSF与可溶性GM-CSF受体α结合的竞争性抑制作用。

利用重组可溶性 GM-CSF 受体评估 GM-CSF 抗体中和能力的无细胞检测系统

背景：此前，我们已证明，GM-CSF 自身抗体的中和能力而非其浓度与疾病相关……

本实验的总体目标是建立一种无细胞检测方法，用于定量测定抗G-M-C-S-F自身抗体的中和能力。我们首先获取转基因家蚕，导入人源SGMRα基因以表达重组SGMRα蛋白，随后通过bioTE技术对重组人G-M-C-S-F进行标记。接下来，我们通过研究G-M-C-S-F自身抗体对G-M-C-S-F与SGMRα结合的抑制作用，评估无细胞系统与常规生物活性检测之间的相关性。实验结果表明，生物活性检测中的生长抑制效应与无细胞系统中血清IgG组分及纯化的G-M-C-S-F自身抗体所导致的结合抑制效应之间存在显著相关性。该技术相较于现有的TF-1生物活性检测等方法的主要优势在于，该系统具有高通量分析能力，且重复性良好，可用于准确测定GM-CSF自身抗体的中和能力。由于GM-CSF自身抗体可导致自身免疫性原发性预后不良，该技术的应用意义延伸至诊断领域。该方法还可应用于竞争性配体结合实验，例如使用重组细胞因子受体检测BEGF和TNFA受体的结合能力。本实验操作将由我实验室的一名博士研究生Ano进行演示。他首次开发了这种无需pH调节的系统。本视频展示了用于生产重组SGMRα的家蚕。第一步是通过聚合酶链式反应，从人胎盘cDNA文库中扩增SGMRα的cDNA，得到PCR扩增产物。随后进行第二次PCR，以在5'端添加一段50个碱基的ULA病毒多顺反子5'非翻译区（UTR）序列。将RRG的标签连接至三端，将扩增的PCR产物R克隆到质粒P MSG 11 mg中，将构建体PS GMR/M1 1 mg与辅助载体PHA3 pig共同注射到家蚕PNDW1品系的卵中。在25摄氏度下饲养孵化的G0幼虫至成蛾。随后通过同胞交配或与PNDW1交配筛选G1胚胎，以眼睛中MG FP的表达作为携带转基因家蚕的标志。通过含有500毫摩尔氯化钠的磷酸盐缓冲液从转基因家蚕的茧中提取重组SGMR alpha蛋白，并在4摄氏度下搅拌24小时。将样品在20,000 ×g下离心15分钟。为去除沉淀物，将上清液上样至镍亲和柱中。用10毫摩尔到250毫摩尔的线性梯度洗脱液洗涤层析柱并稀释蛋白。收集含有纯化SGMRα的组分，并对磷酸盐缓冲生理盐水进行透析。首先用PBS缓冲液透析样品。为了从 G-M-C-S-F 制备液中去除山梨醇，加入 1 毫升 20 毫摩尔的冷亚甲基二膦酸钠溶液，在冰上避光孵育 30 分钟。然后向溶液中加入甘油，使其终浓度为 15 毫摩尔，并用 100 毫摩尔的醋酸钠缓冲液进行透析。接着，向溶液中加入叠氮生物素，使其终浓度为 5 毫摩尔，在室温下混合反应 2 小时。最后，通过透析去除非反应性物质，用50微升单克隆抗polyhis抗体在4摄氏度下包被微孔板过夜。用PBST洗涤五次。然后加入100微升封闭液，在4摄氏度下孵育三小时。再次用PBST洗涤五次。在封闭液中加入50微升SGMR α，用PBST洗涤五次后，于4°C孵育过夜。加入25微升含有G-M-C-S-F自身抗体的样品，然后加入25微升生物素标记的G-M-C-S-F，在4°C孵育1小时。为了形成SGMRα G-M-C-S-F复合物，继续用PBST洗涤五次，然后在4°C下加入50 µL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，孵育1小时，以检测与SGMRα结合的生物素化G-M-C-S-F。用PBST洗涤五次后，向溶液中加入50 µL化学发光底物，在室温下孵育1小时，随后使用酶标仪测定化学发光活性。在SDS-PAGE分析中，家蚕来源的重组SDMRα在非还原条件下以单体和二聚体形式存在，而在还原条件下仅以单体形式存在。SGMR α 的这种重组单体与二硫键连接的二聚体混合物在竞争性结合实验中具有功能活性。生物素标记的 G-M-C-S-F 与 SGMR α 形成的复合物具有特异性，可通过加入不同浓度的中和抗体解离，而加入非中和抗体则不能解离。此外，随着 G-M-C-S-F 中和抗体浓度的增加，结合抑制率呈剂量依赖性正相关升高。与预期一致，G-M-C-S-F 非中和性抗体的结合抑制作用不具有剂量依赖性。该无细胞系统显示，G-M-C-S-F 自身抗体对 G-M-C-S-F 与 SGMR alpha 结合的抑制作用与计算值之间具有高度相关性，相关系数 r 为 0.988，P 值为 0.002。G-M-C-S-F 自身抗体以剂量依赖方式增强了结合抑制作用。类似地，结合抑制作用与入核转运的生长抑制作用之间存在显著相关性。本实验方法具有应用价值，可通过血清IgG组分对结合抑制的IC50值与生长抑制百分率之间的关系，对自身免疫性肺泡蛋白沉积症患者血清IgG组分进行分析，如本研究所示。此外，不同实验间的变异系数表明，无细胞系统相较于生长抑制生物测定法具有优势。一旦掌握要领，该无细胞GM-CSF受体配体结合检测可在38小时内成功完成。需要注意保持反应温度和孵育时间。该技术为研究人员筛选新型抗体药物的生物活性提供了新途径，可替代传统的生物检测方法。

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