Name: 从细胞中一氧化氮和超氧负离子自由基的电子顺磁共振光谱的检测，使用自旋陷阱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 了解利用电子顺磁共振光谱和自旋陷阱技术检测细胞中一氧化氮和超氧负离子自由基的方法。该技术有助于研究活性氧和氮物种在疾病发展中的作用机制。

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本工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所基金 RO1 HL81248 资助。

1. 牛主动脉内皮细胞（BAEC）的培养
<ol>
 <li>遵循正确的无菌操作技术。</li>
 <li>在水浴中将不含抗生素的培养基加热至 37 °C。</li>
</ol>
注意：培养基由不含酚红的 Dulbecco 改良必需培养基（DMEM）组成，其中含 4.5 g/L D-葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸，并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2.5 mg/L 内皮细胞生长因子。
<ol start="3">
 <li>从培养箱中取出含有细胞的 T75 培养瓶，在放入生物安全柜前，用 70% 乙醇擦拭瓶体表面。</li>
 <li>使用移液器吸除旧培养基，并用 5 ml 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次。</li>
 <li>加入 2 ml 胰蛋白酶，孵育 4–5 分钟使细胞脱落，期间定期在显微镜下观察细胞状态。</li>
 <li>加入 3 ml 培养基，用移液器反复吹打混匀，使细胞充分分散，形成均匀的细胞悬液。</li>
 <li>将含胰蛋白酶的 5 ml 培养基转移至 15 ml 离心管中，在 121 g 条件下离心 5 分钟。</li>
 <li>用移液器吸除上清液，加入 5 ml DPBS 并充分混匀，随后在 121g 条件下离心 5 分钟。</li>
 <li>吸除上清液，加入 6 ml 培养基重悬细胞沉淀。</li>
 <li>在 6 孔板中，每孔加入 1 ml 细胞悬液，再加入 1 ml 培养基，用移液器轻轻吹打混匀。</li>
 <li>标记培养板，并在 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。</li>
</ol>
2A. 使用 BAEC 细胞检测 NO
<ol>
 <li>遵循正确的无菌操作技术。</li>
 <li>从培养箱中取出6孔板，吸除第一孔中的培养基，用1 ml DPBS洗涤细胞两次。</li>
 <li>加入210 μl新配制的1.9 mM硫酸亚铁七水合物（FeSO4.7H2O，将0.8 mg溶于含CaCl2和MgCl2的1 ml DPBS中）和210 μl新配制的N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐（MGD，将2.7 mg溶于含CaCl2和MgCl2的500 μl DPBS中），两者的体积比为1:7。（注意：由于过量MGD存在时Fe3+-MGD的产率最高，因此传统上采用此比例制备Fe2+-MGD复合物。溶液中无需额外添加抗坏血酸来稳定Fe2+-MGD，因为生成的NO-Fe3+-MGD可在内源性抗坏血酸、氢醌或半胱氨酸作用下高效（转化率可达99.9%）还原为EPR可检测的NO-Fe2+-MGD。Fe2+的低自旋抗磁态使得可在室温下使用扁平细胞或毛细管进行NO检测，无需低温设备）15。</li>
 <li>轻轻振荡混匀后，加入4.6 μl钙离子载体（CaI）（用DMSO将1 mg溶于1 ml配制成1.9 mM储备液后稀释使用）。</li>
 <li>再次轻轻振荡混匀，并于37 °C孵育36分钟，以进一步促进NO-Fe3+-MGD还原为EPR可检测的NO-Fe2+-MGD。</li>
 <li>收集上清液（425 μl）至EP管中，转移至EPR扁平细胞（或50 μl毛细管）中。</li>
 <li>EPR采集参数如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3427 G；调制幅度：6.0 G；扫描宽度：100 G；接收增益：1 × 105；微波功率：10 mW；总扫描次数：121；扫描时间：10 s；时间常数：20 ms。（注意：由于不同仪器和实验条件下的参数可能存在差异，因此仅中心磁场、频率和调制幅度是最关键的参考参数。）</li>
 <li>在室温下记录谱图，使用Bruker WinEPR数据处理软件或其他数据处理软件对二维谱图进行积分以降低背景噪声并校正基线。为定量分析加合物的形成，可使用NO供体SNAP建立浓度与信号强度（或峰面积）之间的标准曲线。</li>
</ol>
2B. eNOS 去偶联实验
<ol>
 <li>从培养箱中取出6孔板，吸去第二孔中的培养基，并用1 ml DPBS洗涤两次。</li>
 <li>使用过氧亚硝酸盐供体5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑鎓氯化物（SIN-1）以解偶联eNOS16。加入100 μl 0.5 mM SIN-1（Mr 206.6 g/mol，由10 mM储备液新鲜配制，方法是将1 mg SIN-1溶解于500 μl无钙/镁离子的PBS中），再用DPBS和10% FBS稀释至2 ml。</li>
 <li>在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
 <li>从培养箱中取出培养板，用DPBS洗涤两次。</li>
 <li>加入210 μl 2.8 mM FeSO4·7H2O和210 μl根据上述方法新鲜配制的19.6 mM MGD。</li>
 <li>轻轻摇动溶液，然后加入4.6 μl 1.9 mM CaI。</li>
 <li>再次轻轻摇动溶液，并在37 °C下孵育36分钟。</li>
 <li>收集上清液（425 μl）至EP管中，转移至EPR平面样品池。</li>
 <li>EPR采集参数如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3427 G；调制幅度：6 G；扫描宽度：100 G；接收增益：1 × 105；微波功率：10 mW；总扫描次数：121；扫描时间：10 s；时间常数：20 ms。</li>
 <li>记录谱图，并对二维谱图进行积分以降低背景噪声，同时按上述方法进行基线校正。</li>
</ol>
3. 多形核中性粒细胞（PMNs）中O2•-的检测
<ol>
 <li>中性粒细胞按照先前所述方法从人血液样本中分离17。</li>
 <li>在含有0.1 mM二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的PBS中配制1 M DMPO*的储备液。DMPO的熔点为25–29 °C，因此将液态DMPO（25 °C时密度约为1.02 g/ml）移入玻璃小瓶中更为方便（注意：不要使用塑料小瓶称重，因为纯DMPO会与塑料发生反应）。冷冻的DMPO可通过在小瓶上冲淋温水使其融化（注意：不要使用热水，以免DMPO分解）。</li>
 <li>必须使用高纯度DMPO（> 99%），因为某些市售的自旋捕获剂含有顺磁性杂质，因此必须单独检测DMPO溶液的EPR谱图（本实验中为10 mM）。关键在于不应出现任何背景信号（见图3A）。</li>
 <li>将佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）用DMSO配制成1 mg/ml的储备液。再用PBS稀释至10 μg/ml，分装保存。</li>
 <li>在1.5 ml离心管中，按以下添加顺序配制总体积为0.6 ml的溶液：每ml含约106个PMN细胞、D-葡萄糖（1 mg/ml）和白蛋白（1 mg/ml）、10 mM DMPO以及0.2 μg/ml PMA。（注意：PMA为自由基激活剂，应最后加入）</li>
 <li>将溶液转移至EPR平头样品管中。</li>
 <li>EPR采集参数条件如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3486 G；调制幅度：0.5 G；扫描宽度：100 G；接收增益：5 × 105；总扫描次数：10；扫描时间：30 s；微波功率：20 mW；时间常数：81 ms。为定量加合物的形成，可使用稳定的氮氧自由基（如TEMPO或3-羧基-PROXYL）建立浓度与信号强度（或面积）之间的标准曲线。</li>
</ol>
* 关于DMPO使用的注意事项：通过使用扁平细胞，可增加细胞密度，从而增强自旋加合物的信号强度，但O₂⁻的半衰期会缩短2•-DMPO加合物的寿命较短（t1/2 ~1 分钟）分解为 DMPO-OH。可使用相同浓度的 EMPO、BMPO 或 DEPMPO 替代 DMPO，这些试剂可从商业途径获得，与 t 的加合物具有更高的稳定性1/2 约8分钟和14分钟，分别。
4. 代表性结果
采用 Fe2+-MGD 进行 NO 自由基的自旋捕获。Fe2+-MGD 或 Fe2+-MGD 与 CaI 混合物均未显示 EPR 信号（图 2A 和 2B），表明这些试剂不产生 NO 背景信号。经 CaI 刺激后，BAEC 释放 NO，NO 与 Fe2+-MGD 反应形成自旋加合物 NO-Fe2+-MGD，在 EPR 谱图中呈现特征性的三重峰信号，其超精细分裂常数（hfsc）为 aN = 12.66 G，g 因子为 g = 2.040（图 2C）。超精细分裂常数通过 NIEHS EPR 软件数据库网站可下载的 WINSIM 模拟程序测定。实验测得的 hfsc 值与文献报道的 NO-Fe2+-MGD 加合物的 aN = 12.70 G 和 g = 2.04118 一致。类似地，SIN-1 对 BAEC 的作用因 eNOS 解偶联而降低了 NO 的生成，如 图 2D 所示。
采用DMPO自旋捕获法检测O2•-。如图3A所示，单独使用DMPO未产生信号，证实该自旋捕获剂不含顺磁性杂质。图3B为仅含DMPO和PMN的谱图，同样未见可检测信号，表明DMPO不会引起NADPH氧化酶的激活。图3C显示了PMA刺激PMN后观察到的EPR信号。该信号的超精细耦合常数测定值为aN =14.71 G，aβ-H =11.40 G和aγ-H =1.25 G，与文献报道的DMPO-O2H加合物的aN =14.3 G，aβ-H =11.7 G和aγ-H =1.3 G19相符。
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="显示DMPO-O2和NO-Fe2-MGD加合物生成与分析过程的电子顺磁共振（EPR）波谱示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 利用EPR自旋捕获技术检测中性粒细胞和BAEC中自由基的流程图。（A）将PMN与DMPO和PMA混合，随后将混合液转移至EPR平底样品池进行数据采集。（B）在培养板上培养BAEC，用DPBS洗涤。加入自旋捕获剂Fe(MGD)2和CaI，充分混匀后孵育。将混合液转移至EPR平底样品池进行EPR数据采集。
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="电子自旋共振谱图，显示信号变化，顺磁性物质的分析研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 从BAEC细胞中检测NO的电子顺磁共振（EPR）。(A) 仅含Fe2+-MGD的谱图；(B) Fe2+-MGD加CaI的谱图；(C) 使用CaI刺激细胞后，Fe2+-MGD捕获NO产生的三重峰谱图；(D) 细胞经0.5 mM SIN-1处理后NO生成减少的谱图。
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="显示光谱数据的电子自旋共振波谱图，用于分析磁场对样品物种的影响。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 活化中性粒细胞中DMPO-O2H的EPR检测。（A）仅10 mM DMPO的谱图。（B）单独PMN在含有10 mM DMPO条件下的谱图。（C）PMN经PMA激活并在含有10 mM DMPO条件下的谱图。

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</ol>

无利益冲突声明。

电子顺磁共振（EPR）自旋捕获技术已广泛应用于多种生物医学领域，用于定量和鉴定自由基。自旋捕获方法具有高度灵敏性，可检测浓度范围为纳摩尔（nM）至微摩尔（μM）的自由基，因此适用于生物系统中的应用。顺磁性加合物NO-Fe的形成2+-MGD 是一氧化氮检测的基础 通过 电子顺磁共振。铁2+-MGD 与 NO 迅速反应18 以约 10 的速率6 M-1 s-1. NO-Fe2+-MGD加合物具有较长的半衰期且高度稳定。事实上，在采集样品后，将含有NO-Fe的溶液于-80 °C冷冻，可在24小时内仍获得EPR谱图2+-MGD 在信号强度无明显损失的情况下（未发表结果）。Fe 的缺点2+-MGD 对空气敏感，通常需要加入5个或更多摩尔当量的配体至Fe(II)。Fe的氧化2+-毫克铁当量（MGD）至铁（Fe）3+- 空气中的微生物气溶胶污染（MGD）不可避免且难以控制，然而，在 体...

<table><tbody><tr><td> 无酚 DMEM 培养基&lt;br/&gt; 高糖 1X</td><td>GIBCO</td><td>31053</td><td> </td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200</td><td> </td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td> </td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td> </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td> </td></tr><tr><td>内皮生长因子</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td> </td></tr><tr><td>CaI</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>A-23187</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>SIN-1</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN245-0020</td><td> </td></tr><tr><td>DMPO</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>D048-10</td><td> </td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422-250G</td><td>溶于含 Ca 和 Mg 的 PBS</td></tr><tr><td>MGD</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-014-M050</td><td>溶于含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 PBS</td></tr><tr><td>BAEC 细胞</td><td>Cell Systems</td><td>2B2-C75</td><td> </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td> </td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td> </td></tr><tr><td>含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td> </td></tr><tr><td>佛波酯-豆蔻酸乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79346-1MG</td><td> </td></tr></tbody></table>

使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基

关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

低浓度的活性氮/氧物种（ROS/RNS）在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但浓度失控时则会对细胞活力造成损害1, 2。尽管生物体在进化过程中已形成内源性和膳食来源的抗氧化防御机制以调控ROS的生成，ROS仍会作为氧气正常代谢的天然副产物持续产生，并可导致生物分子的氧化损伤，引起蛋白质功能丧失、DNA断裂或脂质过氧化3，最终引发氧化应激，导致细胞损伤或死亡4。
超氧阴离子自由基（O2•-）是生物系统中一些最强氧化性物质（如过氧亚硝酸盐和羟基自由基）的主要前体。O2•- 的产生标志着氧化爆发的最初信号，因此在生物系统中对其进行检测和/或捕获具有重要意义。在本实验中，O2•- 由多形核中性粒细胞（PMNs）产生。通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）的趋化性刺激，PMNs 激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，从而生成 O2•-5。
一氧化氮（NO）合酶存在三种同工酶形式，分别为诱导型、神经元型和内皮型NOS，即iNOS、nNOS和eNOS，可利用NADPH催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，同时生成NO6。本文中，我们由内皮细胞生成NO。在氧化应激条件下，eNOS可能从生成NO转变为生成超氧阴离子（O2•-），该过程称为eNOS去偶联，被认为是由血红素7或辅因子四氢生物蝶呤（BH4）8的氧化所导致。
在生物系统中检测自由基的可靠方法很少，且这些方法在特异性和灵敏度方面存在局限性。电子自旋捕获（spin trapping）常用于自由基的鉴定，其原理是自由基与自旋捕获剂发生加成反应，生成稳定的自旋加合物，该加合物可通过电子顺磁共振（EPR）波谱法进行检测。不同的自由基加合物表现出特征性的谱图，可用于识别所产生的自由基，并可提供关于自由基生成性质和动力学的丰富信息9。
环状亚硝基化合物，如5,5-二甲基吡咯啉-N-氧化物（DMPO10）、磷酸酰基取代的DEPMPO11以及酯基取代的EMPO12和BMPO13，已被广泛用作自旋捕获剂——其中后者的O2•-加合物具有更长的半衰期。铁(II)-N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐Fe(MGD)2因加合物形成速率高且自旋加合物稳定性高，常用于捕获NO14。

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)2 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物 DMPO，检测牛主动脉内皮细胞中的一氧化氮和人中性粒细胞中的超氧阴离子自由基。

低浓度的活性氮/氧物质（ROS/RNS）在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但在……

我是弗雷德里克·迪纳（Frederick Dina），俄亥俄州立大学药理学系的副教授。在本演示中，我们将展示如何利用电子顺磁共振（EPR）结合自旋捕获技术，检测细胞释放的一氧化氮和超氧阴离子。活性氧和活性氮物种已被证实与多种疾病的发生发展相关，因此在生物系统中检测这些物质具有极其重要的意义。目前在生物系统中用于检测活性物种的可靠方法较少，且这些方法在特异性和灵敏度方面均存在局限性。然而，电子自旋捕获技术常用于活性自由基的鉴定，其原理是自由基与硝基自旋捕获剂或金属配合物发生加成反应，生成稳定的自旋加合物，该加合物可通过电子顺磁共振波谱（EPR）进行检测。不同的自由基加合物呈现出特征性的波谱，可用于鉴定所生成的自由基种类，并可提供有关自由基性质及其生成动力学的丰富信息。一氧化氮合酶催化 L-精氨酸在 NADPH 参与下转化为 L-瓜氨酸，并生成一氧化氮。在氧化应激条件下，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）可能发生解偶联，由生成一氧化氮转为产生超氧阴离子；这一过程被认为是由血红素或四氢生物蝶呤辅因子的氧化所引起。一氧化氮在生物系统中的调控至关重要，因其在细胞信号转导中发挥关键作用，从而介导血管舒张等有益的生理功能；但其过度生成常与炎症状态相关。因此，检测生物体系中的一氧化氮具有重要意义。生物系统中另一类重要的信号分子是活性氧物质，例如一氧化氮。低浓度的活性氧在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但浓度失控时则可能导致细胞氧化损伤，进而引发氧化应激。超氧阴离子自由基（superoxide radical anion）是最重要的一种活性氧物质，也是生物系统中已知最强氧化性物质的主要前体，例如过氧亚硝酸盐（peroxynitrite）和羟基自由基（hydroxy radical）。因此，在生物系统中检测或清除超氧阴离子具有重要意义，因为其生成标志着氧化爆发的最初信号，出现在启动之前。本方案按照书面操作步骤，对培养的牛主动脉内皮细胞进行胰蛋白酶消化。将细胞转移至标记好的六孔板中，在37°C和5% CO₂条件下孵育过夜。从培养箱中取出六孔板，吸去第一孔中的培养基。用一毫升无钙镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）将细胞洗涤两次。通过将0.8毫克硫酸亚铁加入一毫升含氯化钙和氯化镁的DPBS中，配制1.9毫摩尔的硫酸亚铁七水合物溶液。通过将2.7毫克氨三乙酸镁（MGD）加入含氯化钙和氯化镁的500微升DPBS中，制备MGD溶液。加入210微升新配制的1.9毫摩尔硫酸亚铁七水合物溶液，以及210微升新配制的MGD溶液（摩尔比为1:7），混匀形成悬浮液。再加入4.6微升钙离子四，通过反复吹打混匀溶液。然后将样品在 37°C 下孵育 36 分钟。收集沉淀在离心管中的上清液。输入 EPR 采集参数：中心磁场为 34.27 高斯，调制幅度为 6 高斯，频率为 9.8 吉赫兹。由于参数会因仪器和实验条件的不同而有所变化，请参阅文中关于该设备所用其他参数的描述。将上清液转移至EPR平底管中，用石蜡密封后放入EPR谐振腔。实验运行后，以每次扫描10.4秒、共扫描121次的条件，记录约21分钟的谱图。使用布鲁克 WIN EPR 软件对二维谱图进行基线校正和积分，以降低背景噪声。需要注意的是，扫描时间和扫描次数可能因实验而异。此外，不同软件之间的基线校正方法也可能有所不同。开始Enos去耦联时，从六孔板的第二孔中移除培养基，并用一毫升DPBS洗涤细胞两次。然后加入100微升已配制的0.5毫摩尔Syn one溶液，并用含10%FBS的DPBS将体积补至两毫升，在37摄氏度和5%CO2条件下孵育细胞两小时。孵育结束后，用DPBS洗涤细胞两次。然后加入210 µL新配制的2.8 mM硫酸亚铁七水合物溶液，以及210 µL根据前述步骤新配制的19.6 mM MGD溶液。接着加入4.6 µL的1.9 mM钙离子四溶液，并再次混匀。同前，将细胞在 37 摄氏度下孵育 36 分钟。36 分钟后，收集沉淀在艾诺管中的上清液，并转移至 EPR 平板样品池中。使用与之前相同的采集参数记录 EPR 谱图。在本方案开始之前，以相同方式处理数据。配制含有0.1毫摩尔DTPA的一摩尔DMPO和PBS的储备液。然后配制每毫升含一毫克的四比十二溶液。将佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）的DMSO储存液用PBS稀释至终浓度为每毫升10微克，同时加入终浓度为每毫升1毫克的D-葡萄糖和每毫升1毫克的牛血清白蛋白，于1.5毫升离心管中分装成每份1毫升。通过在1.5毫升离心管中反复吹打，制备浓度为每毫升500万至600万个PMN细胞的悬液。配制总体积为60微升的反应混合液，其中包含约1.6 × 10⁶个PMN细胞、10毫摩尔的DMPO以及0.2微克/毫升的PMA。在本实验中，我们将使用 Bruker ESP 300 X 波段波谱仪。将溶液转移至 EPR 平板样品池，然后将平板样品池放入 EPR 谐振腔中。输入 EPR 采集参数：中心磁场为 3,486 高斯，调制幅度为 0.5 高斯，频率为 9.8 吉赫兹。由于不同仪器和实验条件下的参数会有所差异，请参阅正文以了解本实验中用于采集光谱的其他参数。在本演示中，我们展示了使用两种不同的自旋捕获剂——铁-亚甲基二硫代氨基甲酸（Fe-MGD）和DNPO，来检测一氧化氮和超氧自由基。我们证明，用钙离子载体四刺激内皮细胞可产生一氧化氮，而经一氧化氮供体处理后，一氧化氮的生成可被降低。然而，用PMA刺激中性粒细胞，并在存在硝基自旋捕获剂的条件下，会生成羟基自由基ADDA，而非S氧化物，这是由于最初形成的超氧自由基加合物不稳定所致。尽管铁-MGD-亚硝基化合物的自旋捕获机制在本质上相同，但一氧化氮与铁-MGD的结合涉及较快的反应速率，且铁-MGD-一氧化氮加合物形式非常稳定。事实上，可以将溶液在零下80摄氏度冷冻，以备后续进行电子顺磁共振（EPR）谱图采集，而不会显著降低其EPR信号强度。另一方面，使用硝基自旋捕获剂检测一氧化氮的反应较慢，因此相较于铁-亚甲基二硫代氨基甲酸酯（MGD）复合物用于一氧化氮检测的方法，需要更高浓度的自旋捕获剂。已有多种方法被成功用于检测超氧加合物形式，本视频中我们不再对此进行展示。例如，使用平底细胞培养装置可因细胞密度更高而获得更强的超氧加合物信号。建议您参考有关此问题的文本资料。此外，除了使用DMPO外，还可以采用经过认证的自旋捕获剂，如BMPO和VMP，或磷酸化的Nitro DAP MPO，这些捕获剂可产生更稳定的超氧阴离子过氧化物加合物。在利用自旋捕获技术检测超声波时，也可使用环糊精来稳定超氧阴离子过氧化物加合物。强烈建议在超氧阴离子生成后立即采集电子顺磁共振（EP）谱。因此，使用铁-亚甲基二硫代氨基甲酸盐（iron MGD）检测一氧化氮的效率要高得多，而目前超氧阴离子的PR自旋捕获技术面临的主要挑战是实现铁-MGD-一氧化氮加合物形成过程中所表现出的那些特性，即快速的超氧阴离子反应性和稳定的加合物。目前，我们实验室及其他研究团队正在积极开展具有快速超氧阴离子反应性并能形成稳定自旋加合物的自旋捕获剂的开发工作。

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