使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基 关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

我是弗雷德里克·迪纳（Frederick Dina），俄亥俄州立大学药理学系的副教授。在本演示中，我们将展示如何利用电子顺磁共振（EPR）结合自旋捕获技术，检测细胞释放的一氧化氮和超氧阴离子。

活性氧和活性氮物种已被证实与多种疾病的发生发展相关，因此在生物系统中检测这些物质具有极其重要的意义。目前在生物系统中用于检测活性物种的可靠方法较少，且这些方法在特异性和灵敏度方面均存在局限性。然而，电子自旋捕获技术常用于活性自由基的鉴定，其原理是自由基与硝基自旋捕获剂或金属配合物发生加成反应，生成稳定的自旋加合物，该加合物可通过电子顺磁共振波谱（EPR）进行检测。不同的自由基加合物呈现出特征性的波谱，可用于鉴定所生成的自由基种类，并可提供有关自由基性质及其生成动力学的丰富信息。

一氧化氮合酶催化 L-精氨酸在 NADPH 参与下转化为 L-瓜氨酸，并生成一氧化氮。在氧化应激条件下，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）可能发生解偶联，由生成一氧化氮转为产生超氧阴离子；这一过程被认为是由血红素或四氢生物蝶呤辅因子的氧化所引起。一氧化氮在生物系统中的调控至关重要，因其在细胞信号转导中发挥关键作用，从而介导血管舒张等有益的生理功能；但其过度生成常与炎症状态相关。因此，检测生物体系中的一氧化氮具有重要意义。

生物系统中另一类重要的信号分子是活性氧物质，例如一氧化氮。低浓度的活性氧在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但浓度失控时则可能导致细胞氧化损伤，进而引发氧化应激。超氧阴离子自由基（superoxide radical anion）是最重要的一种活性氧物质，也是生物系统中已知最强氧化性物质的主要前体，例如过氧亚硝酸盐（peroxynitrite）和羟基自由基（hydroxy radical）。因此，在生物系统中检测或清除超氧阴离子具有重要意义，因为其生成标志着氧化爆发的最初信号，出现在启动之前。

本方案按照书面操作步骤，对培养的牛主动脉内皮细胞进行胰蛋白酶消化。将细胞转移至标记好的六孔板中，在37°C和5% CO₂条件下孵育过夜。

从培养箱中取出六孔板，吸去第一孔中的培养基。用一毫升无钙镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）将细胞洗涤两次。通过将0.8毫克硫酸亚铁加入一毫升含氯化钙和氯化镁的DPBS中，配制1.9毫摩尔的硫酸亚铁七水合物溶液。

通过将2.7毫克氨三乙酸镁（MGD）加入含氯化钙和氯化镁的500微升DPBS中，制备MGD溶液。加入210微升新配制的1.9毫摩尔硫酸亚铁七水合物溶液，以及210微升新配制的MGD溶液（摩尔比为1:7），混匀形成悬浮液。再加入4.6微升钙离子四，通过反复吹打混匀溶液。

然后将样品在 37°C 下孵育 36 分钟。收集沉淀在离心管中的上清液。输入 EPR 采集参数：中心磁场为 34.27 高斯，调制幅度为 6 高斯，频率为 9.8 吉赫兹。

由于参数会因仪器和实验条件的不同而有所变化，请参阅文中关于该设备所用其他参数的描述。将上清液转移至EPR平底管中，用石蜡密封后放入EPR谐振腔。实验运行后，以每次扫描10.4秒、共扫描121次的条件，记录约21分钟的谱图。

使用布鲁克 WIN EPR 软件对二维谱图进行基线校正和积分，以降低背景噪声。需要注意的是，扫描时间和扫描次数可能因实验而异。此外，不同软件之间的基线校正方法也可能有所不同。

开始Enos去耦联时，从六孔板的第二孔中移除培养基，并用一毫升DPBS洗涤细胞两次。然后加入100微升已配制的0.5毫摩尔Syn one溶液，并用含10%FBS的DPBS将体积补至两毫升，在37摄氏度和5%CO2条件下孵育细胞两小时。孵育结束后，

用DPBS洗涤细胞两次。然后加入210 µL新配制的2.8 mM硫酸亚铁七水合物溶液，以及210 µL根据前述步骤新配制的19.6 mM MGD溶液。接着加入4.6 µL的1.9 mM钙离子四溶液，并再次混匀。

同前，将细胞在 37 摄氏度下孵育 36 分钟。36 分钟后，收集沉淀在艾诺管中的上清液，并转移至 EPR 平板样品池中。使用与之前相同的采集参数记录 EPR 谱图。

在本方案开始之前，以相同方式处理数据。配制含有0.1毫摩尔DTPA的一摩尔DMPO和PBS的储备液。然后配制每毫升含一毫克的四比十二溶液。

将佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）的DMSO储存液用PBS稀释至终浓度为每毫升10微克，同时加入终浓度为每毫升1毫克的D-葡萄糖和每毫升1毫克的牛血清白蛋白，于1.5毫升离心管中分装成每份1毫升。通过在1.5毫升离心管中反复吹打，制备浓度为每毫升500万至600万个PMN细胞的悬液。配制总体积为60微升的反应混合液，其中包含约1.6 × 10⁶个PMN细胞、10毫摩尔的DMPO以及0.2微克/毫升的PMA。

在本实验中，我们将使用 Bruker ESP 300 X 波段波谱仪。将溶液转移至 EPR 平板样品池，然后将平板样品池放入 EPR 谐振腔中。输入 EPR 采集参数：中心磁场为 3,486 高斯，调制幅度为 0.5 高斯，频率为 9.8 吉赫兹。

由于不同仪器和实验条件下的参数会有所差异，请参阅正文以了解本实验中用于采集光谱的其他参数。在本演示中，我们展示了使用两种不同的自旋捕获剂——铁-亚甲基二硫代氨基甲酸（Fe-MGD）和DNPO，来检测一氧化氮和超氧自由基。

我们证明，用钙离子载体四刺激内皮细胞可产生一氧化氮，而经一氧化氮供体处理后，一氧化氮的生成可被降低。然而，用PMA刺激中性粒细胞，并在存在硝基自旋捕获剂的条件下，会生成羟基自由基ADDA，而非S氧化物，这是由于最初形成的超氧自由基加合物不稳定所致。尽管铁-MGD-亚硝基化合物的自旋捕获机制在本质上相同，但一氧化氮与铁-MGD的结合涉及较快的反应速率，且铁-MGD-一氧化氮加合物形式非常稳定。

事实上，可以将溶液在零下80摄氏度冷冻，以备后续进行电子顺磁共振（EPR）谱图采集，而不会显著降低其EPR信号强度。另一方面，使用硝基自旋捕获剂检测一氧化氮的反应较慢，因此相较于铁-亚甲基二硫代氨基甲酸酯（MGD）复合物用于一氧化氮检测的方法，需要更高浓度的自旋捕获剂。

已有多种方法被成功用于检测超氧加合物形式，本视频中我们不再对此进行展示。例如，使用平底细胞培养装置可因细胞密度更高而获得更强的超氧加合物信号。建议您参考有关此问题的文本资料。

此外，除了使用DMPO外，还可以采用经过认证的自旋捕获剂，如BMPO和VMP，或磷酸化的Nitro DAP MPO，这些捕获剂可产生更稳定的超氧阴离子过氧化物加合物。在利用自旋捕获技术检测超声波时，也可使用环糊精来稳定超氧阴离子过氧化物加合物。强烈建议在超氧阴离子生成后立即采集电子顺磁共振（EP）谱。

因此，使用铁-亚甲基二硫代氨基甲酸盐（iron MGD）检测一氧化氮的效率要高得多，而目前超氧阴离子的PR自旋捕获技术面临的主要挑战是实现铁-MGD-一氧化氮加合物形成过程中所表现出的那些特性，即快速的超氧阴离子反应性和稳定的加合物。目前，我们实验室及其他研究团队正在积极开展具有快速超氧阴离子反应性并能形成稳定自旋加合物的自旋捕获剂的开发工作。