加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量

以下程序的总体目标是分离和定量复杂混合物中的肽，这些肽充当其各自蛋白质的替代物。首先，使用胰蛋白酶等酶将混合物中的大蛋白消化成组分肽。然后，使用抗肽抗体富集靶向肽分析和加标稳定同位素标记的内标，分离后将其固定在蛋白 G 编码的磁性颗粒上。

从磁性颗粒中得到目标肽，并通过质谱分析，以便相对于内标进行定量。与传统免疫测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它在构建大量分析时更快、更具成本效益。它的成功率很高，并且很容易被多路复用，证明将要布置该程序。

实验室的技术人员在湿冰上对 10 μL 血浆 Eloqua 进行 Haw。将样品转移到 1000 微升深孔板中，并用比喻膜覆盖，使蛋白质在 20 微升新鲜的 9 摩尔尿素 30 毫摩尔 DTT 中变性 每个样品，并孵育 30 分钟在 37 摄氏度下，向每个样品中加入 3 微升新鲜的 500 毫摩尔 I oto 乙酰胺，并在室温下避光孵育 30 分钟。现在用 100 毫摩尔 tris pH 8 将尿素稀释至 0.6 摩尔，并每微升行程添加 10 微升 1 微克和储备溶液，酶与底物的比例为 1：50。

在 37 摄氏度下用 3 μL 纯甲酸孵育反应过夜至终浓度为 1% 后，继续添加稳定同位素标准品或多个标准品。如果进行多重检测，则用 500 μL 0.1% 甲酸和 80% ACE 丁腈溶液充分清洗 Oasis 小柱板，丢弃流出物。然后通过在水中加入 500 μL 0.1% 甲酸来平衡小柱板，并丢弃流出液。

将消解样品加载到柱板上并调节真空度，使流速非常慢。用 500 微升 0.1% 甲酸的水中洗涤 3 次，弃去流路，用 500 微升 0.1% 甲酸在 80% 乙酸试验中洗脱肽两次，然后冻干或加速洗脱液至干，在 50 微升 PBS 加 0.03%Chaps 中重构干燥的肽，将样品转移到标准 Kingfisher 96 孔板中，加入 1 微克抗体和 1.5 微升蛋白 G每个靶标编码磁珠。添加前涡旋珠子。

确保珠子悬浮良好。用箔纸盖住板，然后用温和的滚揉离心机孵育过夜。以 400 RPM 的速度将板板放置 10 秒，以去除铝箔表面的任何液体。

取下铝箔盖。样品作在 Kingfisher 平台上的自动化 Kingfisher 平台上进行。用 200 微升 PBS 加 0.03% Chaps 洗涤珠子两次，用 200 微升 1 至 10 稀释的 PBS 加 0.03% Chap 洗涤一次，现在用 25 微升 5% 乙酸加 0.03% Chaps 洗

将洗脱板放在磁力架上，将洗脱液转移到 96 孔板中，注意不要转移剩余的珠子。用天花板垫盖住板，将含有洗脱液的板输送到三重、四重质谱仪进行分析。MRM 方法是通过获得目标肽的串联质谱来构建的，而不是选择和优化最佳过渡碎片离子。

通常，MRM 分析配置使用 C 18 捕集阱和具有两个流动相的分析柱。上样 10 μL 样品，按线性梯度洗脱。对轻肽和重肽的峰面积进行积分，并计算每个样品中未标记肽与标记肽的峰面积比。

轻肽和重肽同时洗脱，可以监测每个肽的多个离子对为了确认身份，测量内源性肽的峰面积相对于内标的面积，以提供目标肽的定量测量。观看此视频后，您应该对如何在实验室中实施这项技术有很好的了解。它可用于定量任何感兴趣的蛋白质，使其适用于生物研究中的广泛应用。