Name: 加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学习SISCAPA技术进行质谱肽免疫亲和富集与蛋白质定量分析。该方法利用磁珠抗体富集目标肽段，结合稳定同位素稀释质谱实现高通量多肽定量，适用于生物化学与神经科学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国家癌症研究所临床蛋白质组学技术评估中心（CPTAC）基金（编号：U24 CA126476）以及娱乐产业基金会（EIF）和EIF妇女癌症研究基金资助，资助对象为乳腺癌生物标志物发现联盟，同时感谢凯克基金会、坎纳里基金会和保罗·G·艾伦家族基金会的慷慨捐赠。

实验步骤：
该检测需要合成肽段和抗肽抗体。所选肽段应为靶蛋白特有，包含8至22个氨基酸残基，且无已知的翻译后修饰。通常避免使用含蛋氨酸的肽段，同时不推荐使用含有双碱性氨基酸（如KK、KR、RR）的肽段。在本技术中，通常使用稳定同位素标记的肽段作为内标物，在肽段的C端引入重同位素标记的氨基酸（即标记的K或R，如13C和15N标记）。
以下实验方案描述了一种用于检测小鼠骨桥蛋白（Osteopontin）中GDSLAYGLR肽段的方法，该方法使用来自Epitomics Inc.（加利福尼亚州伯林盖姆）的抗肽抗体以及New England Peptide（马萨诸塞州加德纳）提供的合成肽段。本方案包括三个主要步骤（图1）：1）复杂蛋白质混合物的胰蛋白酶消化，2）肽段富集，3）质谱分析。本方法将以添加了小鼠骨桥蛋白的人血浆样本为例进行演示。
1. 胰蛋白酶酶解及纯化
<ol>
<li>在湿冰上解冻10 μL纯血浆等分试样。</li>
<li>通过BCA法测定总蛋白浓度，并离心样品以去除任何悬浮固体。</li>
<li>用移液器将10 μL等分试样从储存管转移至1000 μL深孔板中，并用可穿刺封膜覆盖。</li>
<li>向每个样品中加入20 μL新鲜配制的9M尿素/30mM二硫苏糖醇（DTT）（终浓度为6M尿素/20mM DTT）。</li>
<li>在37°C孵育30分钟。</li>
<li>向每个样品中加入3 μL新鲜配制的500 mM碘乙酰胺（IAM）（终浓度为50 mM IAM）。</li>
<li>在室温下避光孵育30分钟。</li>
<li>加入257 μL 100 mM Tris（pH 8）（将尿素稀释至约0.6M）。</li>
<li>加入10 μL胰蛋白酶储存液（1 μg/μL；酶与底物比例为1:50）。</li>
<li>在37°C孵育过夜（12–16小时）。</li>
<li>加入3 μL纯甲酸（终浓度为1%）。</li>
<li>加入稳定同位素标准品（若进行多重检测，则加入多个标准品，通常约为10 μL，含有50–100 fmol的同位素标记肽标准品）。</li>
<li>用500 μL含0.1%甲酸的80%乙腈洗涤Oasis小柱板孔，弃去穿流液。重复此步骤3次。</li>
<li>通过加入500 μL含0.1%甲酸的水溶液平衡小柱板，并弃去穿流液。重复此步骤4次。</li>
<li>将消化后的样品加载至小柱板，并调节真空度使流速非常缓慢。</li>
<li>用500 μL含0.1%甲酸的水溶液洗涤，弃去穿流液。重复此步骤3次。</li>
<li>用2 × 500 μL含0.1%甲酸的80%乙腈洗脱肽段，收集至1000 μL深孔板中（勿弃穿流液）。</li>
<li>将洗脱液冷冻干燥（或使用真空浓缩仪）至完全干燥。（推荐使用冷冻干燥法）</li>
<li>加入50 μL PBS + 0.03% CHAPS，重新溶解干燥的肽段。</li> 
</ol>
2. 肽段免疫亲和富集
<ol>
<li>将样品转移至标准的 Kingfisher 96 孔板中。</li>
<li>每个靶标加入 1 μg 抗体和 1.5 μL 蛋白G包被的磁珠（可选择在加入前将抗体交联至磁珠上）。通过振荡或涡旋确保磁珠充分悬浮。</li>
<li>用铝箔覆盖板孔。</li>
<li>在温和振荡条件下孵育过夜（12–16 小时），以确保磁珠保持悬浮状态。</li>
<li>将板以 32 × g 离心 5 秒，去除铝箔表面的液体。</li>
<li>移除铝箔盖。</li>
<li>磁珠的洗涤与洗脱可手动进行，也可自动化操作。本流程描述的是在 Kingfisher 平台上自动化的操作步骤。</li>
<li>用 200 μL PBS + 0.03% CHAPS 洗涤磁珠 2 次（每次洗涤 1 分钟）。</li>
<li>用 200 μL PBS + 0.03% CHAPS 的 1:10 稀释液洗涤磁珠 1 次（1 分钟）。</li>
<li>使用 25 μL 含 5% 乙酸 + 0.03% CHAPS 的溶液进行肽段洗脱。</li>
<li>将洗脱板置于磁架上，小心转移洗脱液至新的 96 孔板中，避免转移残留的磁珠。</li>
<li>用密封垫密封板孔。</li>
<li>含有洗脱液的板将被送至三重四极杆质谱仪进行分析。</li>
</ol>
3. 多重反应监测-质谱分析
<ol>
<li>用于SRM/MRM分析的跃迁可通过对含有30%乙腈/0.1%甲酸的1皮摩尔每微升肽标准品溶液进行质谱仪直接进样来选择和优化 0.5 μL/min喷雾稳定后，采集二级质谱（MS/MS）谱图。 </li>
<li>通过在噪声较少的质谱区域中识别出三个丰度较高的碎片离子，从二级质谱（MS/MS）谱图中选择跃迁。对于多电荷肽离子，检测到的 y 离子碎片位于 m/z &gt; 母离子 m/z 通常是进行 SRM/MRM 检测方法开发的最佳选择。 图2 显示 MS/MS 谱图及选定的过渡离子 476.3 &gt; 508.3、579.3、692.4（重稳定同位素标准品481.3的跃迁） &gt; 518.3、589.3、702.4（未显示）对应于肽段GDSLAYGLR。 </li>
<li>根据所使用的质谱仪型号，每种离子转换均有多个可优化的参数。在此，我们通过梯度增加碰撞能量并监测信号强度，对每种选定离子转换的碰撞能量进行了优化。最终每种离子转换均采用25的碰撞能量。 </li>
<li>简而言之，SRM/MRM 分析的典型配置如下：流动相（A）0.1% 甲酸；（B）90% 乙腈 / 0.1% 甲酸，0.3 x 5 mm C18 捕获柱， 75 μm ID x 15 cm C18 分析柱（Reprosil-Pur C18 AQ，120 Å）° 孔）。注射体积为 10 μL 样品在总流速下以3% B的条件加载5分钟 3 μL/min 以3–45%B的线性梯度在10分钟内以300–400 nL/min的流速洗脱。在4000 QTRAP（ABSCIEX，Foster City，CA）上的条件为喷雾电压2.3 kV，离子源温度 150 °C，第12个GS为GS1，帘气为15。 </li>
<li>通过进样，采用选择反应监测/多反应监测（SRM/MRM）对样品进行分析 10 μL 样品的峰面积使用Skyline程序对轻链和重链肽段进行积分。14 使用背景噪声-free 的最丰富裂解峰（此处为 y5 裂解峰，轻肽 476.3）计算每个样品中未标记/标记肽的峰面积比（PAR） &gt; 579.3，重标肽 481.3 &gt; 589.3). </li>
</ol>
4. 代表性结果：
通过测量内源性轻肽与加入的重同位素标记肽的峰面积比值，可对目标肽段进行定量分析。图3展示了SISCAPA富集样品中轻肽和重肽的典型色谱图。请注意，轻肽和重肽在同一时间洗脱，且可对每种肽段监测多个跃迁离子对，以确认其身份。
<img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="蛋白质分析流程：胰蛋白酶消化、免疫亲和、质谱图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. SISCAPA 流程的示意图。复杂的蛋白质混合物被消化成肽段。利用固定在蛋白G包被的磁性微粒上的抗肽抗体，富集目标肽分析物（内源性分析物和添加的稳定同位素标记的内标）。在分离后，目标肽段从磁性微粒上洗脱，并通过质谱分析，相对于内标进行定量。
<img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="质谱图，m/z 与强度关系，肽段碎裂，离子峰标注为 y4、y5、y6。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 肽段 GDSLAYGLR 的 MS/MS 谱图，显示为 SRM/MRM 转换选择的三个碎片。 

<img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="色谱结果；分析物与内标物；保留时间图谱；数据分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 示例色谱图显示了轻链肽分析物（红色）和重链稳定同位素标记的内标物（蓝色）的峰形特征。图中展示了轻链肽的 y5 转换（476.3 &gt; 579.3）和重链稳定同位素标记内标物（481.3 &gt; 589.3）在洗脱过程中随时间变化的色谱曲线。

<ol><li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li>
<li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+%28SISCAPA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li>
<li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li>
<li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li>
<li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins%3A+model+application+with+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li>
<li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li>
<li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thyroglobulin%2C+a+low-abundance+serum+protein%2C+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li>
<li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li>
<li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li>
<li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS%2FMS%3A+assay+development+for+total+salivary+pepsin%2Fpepsinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li>
<li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li>
<li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li>
<li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents%2C+surfactants%2C+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li>
<li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+immunoaffinity+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine%3A+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

如文中所述，该实验方案中最关键的步骤是确保在孵育期间磁珠始终保持充分混匀。若允许磁珠沉降到孔板或小管底部，将导致实验变异性的增加。此外，在孵育结束后，必须离心去除可能残留在孔板或小管顶部的液体。可重复的胰蛋白酶消化同样至关重要。本研究所描述的消化程序已在本实验室与SISCAPA技术联合使用多年；然而，针对特定目标蛋白组，其他消化方法也可能经过优化后适用15。游离抗体的洗脱不会干扰肽段的检测，这可能是由于抗体被排除在色谱柱之外，或其洗脱时间晚于肽段；但在大规模实验中，或当游离抗体造成干扰时，可在亲和富集前将抗体交联至Protein G磁珠上。我们还发现，在自动进样器的样品板下方放置磁铁，以及以与上样相反的方向冲洗捕获柱，有助于去除任何残留的磁珠或颗粒物。除了本文所述的磁珠方法外，该技术也可适配为柱层析形式（即亲和层析）12, 16。
当用户熟悉整体实验方案后，该技术还可进行多种改进以提升整体检测效果11。首先，可在富集步骤中联合使用多种抗体，从而在单次检测中分析多个分析物（即多重检测）。质谱仪能够同时分析大量分析物。其次，增加原始样本的体积可提高检测的灵敏度。

<table><tbody><tr><td>1000 µL 深孔96孔板</td><td>Eppendorf</td><td>951032786</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 1 cc 柱板，Sep-pak，40 mg 96孔板</td><td>Waters</td><td>186003966</td><td></td></tr><tr><td>Kingfisher 96孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>97002540</td><td></td></tr><tr><td>透明96孔，白色壁板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>96孔板封口铝箔膜</td><td>Excel Scientific</td><td>12-169</td><td></td></tr><tr><td>Axymat 96孔板密封垫</td><td>Axygen Scientific</td><td>521-01-151</td><td></td></tr><tr><td>X pierce 膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722502</td><td></td></tr><tr><td>配备PCR磁头的Kingfisher磁珠处理器</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HSP 9601</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表1：材料</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6031</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液（Trizma base）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>20291</td><td>&quot;no-weigh dithiothreitol&quot;</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega Corp.</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>蛋白G磁珠，2.8 µm</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>L5401</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28300</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>EMD Millipore</td><td>11670</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A998-1</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表2：试剂</td></tr><tr><td>100 mM Tris，pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 M 尿素 / 30 mM DTT 溶于 100 mM Tris（pH 8）</td><td></td><td></td><td>每次使用前必须新鲜配制</td></tr><tr><td>500 mM IAM 溶于 100 mM Tris（pH 8）</td><td></td><td></td><td>每次使用前必须新鲜配制</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）1 mg/mL 溶于 100 mM Tris，pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor）1 mg/mL 溶于 100 mM Tris，pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>稳定同位素标准母液混合物（Stable isotope standard mastermix）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗肽抗体母液混合物（Anti-peptide antibody mastermix）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表3：需配制的溶液</td></tr></tbody></table>

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

定量检测蛋白质的方法存在巨大需求。传统的夹心免疫测定法在定量分析中被广泛视为金标准，但其成本高昂、周期长，且存在诸多缺陷（例如异嗜性抗体、自身抗体干扰、“钩状效应”等）1。一种替代技术是将肽段亲和富集与定量质谱分析相结合，通常称为SISCAPA（稳定同位素标准品与抗肽抗体捕获法）2。该技术通过稳定同位素稀释法进行肽段亲和富集，并利用选择/多反应监测质谱法（SRM/MRM-MS）进行检测，从而实现对肽段的定量测量，以代表其对应蛋白质的含量。SRM/MRM-MS在小分子准确定量方面已有成熟应用3, 4，近年来已被改进用于测定血浆和细胞裂解液中蛋白质的浓度5-7。为了实现蛋白质的定量，通常先使用胰蛋白酶等酶将这些大分子蛋白质消化为肽段。随后，从样本中选择并富集一个或多个在该物种中仅目标蛋白特有的肽段序列（即“蛋白质组型”肽段），利用抗肽抗体对其进行富集，并作为蛋白质浓度的定量化学计量替代物进行测量。因此，结合稳定同位素稀释（SID）方法（即加入稳定同位素标记的肽段标准品），SRM/MRM可用于在复杂生物基质中测定蛋白质组型肽段的浓度，从而实现对蛋白质的定量。相比传统免疫测定法，该方法具有多项优势：试剂制备成本相对较低，分析物特异性优异，可实现高度多重检测，可在未经去除高丰度蛋白的血浆中直接进行富集，且该技术适用于多种目标蛋白质或其修饰形式的检测8-13。在本视频中，我们将演示该方法在磁珠平台上的基本操作流程。

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。

定量检测蛋白质的分析方法目前需求迫切。传统的夹心免疫测定法在很大程度上被视为……

以下实验流程的总体目标是从复杂的混合物中分离并定量作为相应蛋白质替代物的肽段。首先，利用胰蛋白酶等酶将混合物中的大分子蛋白质消化成其组成的肽段。然后，使用固定在蛋白G编码的磁性微粒上的抗肽抗体，对目标肽分析物和加入的稳定同位素标记内标进行富集，随后完成分离。靶向肽段从磁性颗粒中洗脱后，通过质谱分析，相对于内标进行定量。该技术相较于传统免疫测定等现有方法的主要优势在于，建立大量检测方法时速度更快、成本更低。该方法成功率高，易于实现多重检测，相关操作步骤将在下文详述。一名技术人员在实验室中将10微升血浆Eloqua置于湿冰上。将样品转移至1000微升深孔板中，并用封口膜覆盖，加入20微升新鲜的9摩尔尿素和30毫摩尔DTT至每个样品中，在37摄氏度孵育30分钟。向每个样品中加入3微升新鲜的500毫摩尔碘乙酰胺，并在室温下避光孵育30分钟。现在用100毫摩尔Tris（pH 8）将尿素稀释至0.6摩尔，并加入10微升浓度为1微克/微升的胰蛋白酶储存液，使酶与底物的比例达到1:50。将反应在37摄氏度孵育过夜后，加入三微升纯甲酸，使其终浓度为1%，随后继续加入稳定同位素内标或多种内标。若进行多重检测，则用500微升含0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗涤Oasis固相萃取板的小孔，弃去穿流液。然后加入500微升含0.1%甲酸的水溶液平衡固相萃取板，弃去穿流液。将消化后的样品上样至柱板中，并调节真空压力使流速非常缓慢。用500 µL含0.1%甲酸的水溶液洗涤三次，弃去穿流液。再用500 µL含0.1%甲酸的80%乙腈溶液将肽段洗脱两次，然后将洗脱液冷冻干燥或真空离心浓缩至干燥，并将干燥后的肽段重新溶解于50 µL PBS缓冲液（含0.03% Chaps）中。将样品转移至标准的Kingfisher 96孔板，每种目标物加入1 µg抗体和1.5 µL蛋白G偶联的磁珠。在加入前需涡旋振荡磁珠。为确保珠子充分悬浮，用铝箔覆盖酶标板，并在400 RPM转速下轻轻振荡孵育过夜。随后以400 RPM离心10秒，去除铝箔表面的液体。移除铝箔盖。在 Kingfisher 自动化平台上进行样本操作。用 200 µL PBS 加 0.03% CHAPS 洗涤磁珠两次，再用 200 µL PBS 加 0.03% CHAPS 一比十稀释液洗涤一次，随后用 25 µL 5% 乙酸加 0.03% CHAPS 洗脱肽段。将洗脱板置于磁铁上，小心转移洗脱液至96孔板中，注意不要转移残留的磁珠。用封板膜覆盖该板，将含有洗脱液的板送至三重四极杆质谱仪进行分析。通过获取目标肽段的串联质谱图，选择并优化最佳的跃迁碎片离子，从而建立MRM方法。通常，多反应监测（MRM）分析采用C18捕获柱和分析柱，并使用两种流动相。上样10微升样品，通过线性梯度洗脱。积分轻链和重链肽段的峰面积，并计算每个样品中未标记肽段与标记肽段的峰面积比值。轻链和重链肽段同时洗脱，且可对每种肽段监测多个跃迁离子对。为确认肽段身份，通过测量内源性肽段峰面积相对于内标物峰面积的比值，从而实现对目标肽段的定量分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在实验室中应用该技术。该技术可用于定量任何目标蛋白质，适用于生物研究中的广泛领域。

quantification-proteins-using-peptide-immunoaffinity-enrichment

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

在本视频中，我们演示了从肽段混合物中使用抗体进行磷酸化肽段的免疫沉淀。富集后的磷酸化肽段经真空浓缩并保存，用于后续分析。...

磷酸化肽富集：一种基于抗体的免疫沉淀技术，用于从复杂的肽混合物中分离特异性的磷酸化肽

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文介绍了一种利用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）技术对复杂生物液体中蛋白质进行定量的实验方案。...

使用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）进行肽和蛋白质定量

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本方案描述了一种从前列腺癌细胞系或组织中提取并富集磷酸化肽段以进行磷酸化蛋白质组分析的实验方法 通过...

磷酸化肽段富集联合非标记定量质谱法研究前列腺癌磷酸化蛋白质组

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

学习SISCAPA技术进行质谱肽免疫亲和富集与蛋白质定量分析。该方法利用磁珠抗体富集目标肽段，结合稳定同位素稀释质谱实现高通量多肽定量，适用于生物化学与神经科学研究。

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

探索更多视频