加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量
July 31st, 2011
稳定同位素标准和捕捉反肽抗体（SISCAPA）夫妇亲和富集稳定同位素稀释质谱（MRM - MS）的肽作为代理人为各自的蛋白质肽的定量测量提供。在这里，我们描述了一个部分自动化的格式使用磁性粒子的协议。
以下程序的总体目标是分离和定量复杂混合物中的肽，这些肽充当其各自蛋白质的替代物。首先，使用胰蛋白酶等酶将混合物中的大蛋白消化成组分肽。然后，使用抗肽抗体富集靶向肽分析和加标稳定同位素标记的内标，分离后将其固定在蛋白 G 编码的磁性颗粒上。
从磁性颗粒中得到目标肽，并通过质谱分析，以便相对于内标进行定量。与传统免疫测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它在构建大量分析时更快、更具成本效益。它的成功率很高，并且很容易被多路复用，证明将要布置该程序。
实验室的技术人员在湿冰上对 10 μL 血浆 Eloqua 进行 Haw。将样品转移到 1000 微升深孔板中，并用比喻膜覆盖，使蛋白质在 20 微升新鲜的 9 摩尔尿素 30 毫摩尔 DTT 中变性 每个样品，并孵育 30 分钟在 37 摄氏度下，向每个样品中加入 3 微升新鲜的 500 毫摩尔 I oto 乙酰胺，并在室温下避光孵育 30 分钟。现在用 100 毫摩尔 tris pH 8 将尿素稀释至 0.6 摩尔，并每微升行程添加 10 微升 1 微克和储备溶液，酶与底物的比例为 1：50。
在 37 摄氏度下用 3 μL 纯甲酸孵育反应过夜至终浓度为 1% 后，继续添加稳定同位素标准品或多个标准品。如果进行多重检测，则用 500 μL 0.1% 甲酸和 80% ACE 丁腈溶液充分清洗 Oasis 小柱板，丢弃流出物。然后通过在水中加入 500 μL 0.1% 甲酸来平衡小柱板，并丢弃流出液。
将消解样品加载到柱板上并调节真空度，使流速非常慢。用 500 微升 0.1% 甲酸的水中洗涤 3 次，弃去流路，用 500 微升 0.1% 甲酸在 80% 乙酸试验中洗脱肽两次，然后冻干或加速洗脱液至干，在 50 微升 PBS 加 0.03%Chaps 中重构干燥的肽，将样品转移到标准 Kingfisher 96 孔板中，加入 1 微克抗体和 1.5 微升蛋白 G每个靶标编码磁珠。添加前涡旋珠子。
确保珠子悬浮良好。用箔纸盖住板，然后用温和的滚揉离心机孵育过夜。以 400 RPM 的速度将板板放置 10 秒，以去除铝箔表面的任何液体。
取下铝箔盖。样品作在 Kingfisher 平台上的自动化 Kingfisher 平台上进行。用 200 微升 PBS 加 0.03% Chaps 洗涤珠子两次，用 200 微升 1 至 10 稀释的 PBS 加 0.03% Chap 洗涤一次，现在用 25 微升 5% 乙酸加 0.03% Chaps 洗
珠子。将洗脱板放在磁力架上，将洗脱液转移到 96 孔板中，注意不要转移剩余的珠子。用天花板垫盖住板，将含有洗脱液的板输送到三重、四重质谱仪进行分析。MRM 方法是通过获得目标肽的串联质谱来构建的，而不是选择和优化最佳过渡碎片离子。
通常，MRM 分析配置使用 C 18 捕集阱和具有两个流动相的分析柱。上样 10 μL 样品，按线性梯度洗脱。对轻肽和重肽的峰面积进行积分，并计算每个样品中未标记肽与标记肽的峰面积比。
轻肽和重肽同时洗脱，可以监测每个肽的多个离子对为了确认身份，测量内源性肽的峰面积相对于内标的面积，以提供目标肽的定量测量。观看此视频后，您应该对如何在实验室中实施这项技术有很好的了解。它可用于定量任何感兴趣的蛋白质，使其适用于生物研究中的广泛应用。
概述
本文描述了稳定同位素标准和抗肽抗体捕获（SISCAPA）技术，该技术结合了肽的亲和力富集和稳定同位素稀释质谱法，用于定量肽测量。该协议在部分自动化格式下使用磁性颗粒以提高效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 质谱法
背景
- SISCAPA 允许将肽作为蛋白质的替代物进行定量。
- 该方法在速度和成本效益方面改进了传统的免疫测定法。
- 它适用于多重测定，能够同时分析多个肽。
- 该技术涉及将蛋白质消化成肽并使用特定抗体进行富集。
研究目的
- 从复杂混合物中分离和定量肽。
- 展示一种提高肽分析效率的协议。
- 提供一种可广泛应用于生物学研究的方法。
使用的方法
- 使用胰蛋白酶消化蛋白质以生成肽。
- 在磁性颗粒上用抗肽抗体富集目标肽。
- 用于肽定量的质谱分析。
- 使用 Kingfisher 平台实现部分自动化工作流。
主要结果
- SISCAPA 方法为肽定量提供了高成功率。
- 它展示了有效多重测定的能力。
- 通过比较轻质和重质肽比实现定量测量。
- 该技术可以适用于各种感兴趣的蛋白质。
结论
- SISCAPA 是生物样品中肽定量的稳健方法。
- 该协议可以在实验室中应用于多种应用。
- 它相较于传统方法提供了优势，成为研究中的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative protein measurement remains a critical bottleneck in target validation and biomarker discovery, where traditional immunoassays face cost, lead time, and interference limitations. SISCAPA offers a scalable, multiplexable alternative that enhances predictive confidence in early discovery by providing stoichiometric, antibody-independent quantification of proteotypic peptides. This supports risk-adjusted portfolio decisions and translational continuity from hypothesis to preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise quantification of target proteins in complex matrices.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by using proteotypic peptides as stoichiometric surrogates for protein concentration.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering reproducible, multiplexable data for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated peptide enrichment workflows compatible with downstream SRM/MRM-MS quantification.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through stable isotope internal standards and magnetic bead enrichment.
- Scalability: Facilitates multiplexed assay development for parallel target evaluation without plasma depletion.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing quantitative peptide readouts translatable across sample types.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through specific, interference-resistant peptide detection in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions via quantitative, antibody-free protein measurement.
Pipeline & Workflow Integration
SISCAPA integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling quantitative measurement of proteins as a foundation for assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying target proteins in native biological contexts.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible peptide enrichment and quantitative MS readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides light/heavy peptide peak area ratios as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation through standardized peptide quantification.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiplexed target quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, antibody-based enrichment, and mass spectrometry.
- Depends on access to SRM/MRM-capable mass spectrometers and magnetic bead handling platforms.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation and peptide selection criteria.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including plasma, cell lysates, and tissue extracts.
- Involves practical limitations related to antibody availability for specific peptides and trypsin digestion efficiency.
