Name: 慢病毒介导的击倒在体外红细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 学习利用慢病毒载体在体外红细胞分化过程中敲低TAL1转录因子的方法。该技术通过四步培养体系将CD34阳性人造血干细胞分化为成熟红细胞，为研究造血机制和血液疾病治疗提供重要工具。

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我们感谢法国巴黎第六大学的 L. Douay 和 M.C. Giarratana 提供的建议 离体 红系分化，D. Allan 和 H. Atkins（加拿大渥太华医院研究学会，样本获取经渥太华医院研究伦理委员会批准，编号#2007804-01H）提供血液样本，D. Trono（洛桑联邦理工学院）提供慢病毒载体，F.J. Dilworth（加拿大渥太华医院研究学会）对稿件进行了关键性审阅。本项目由加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP-82813）资助，M.B. 获得资助。C.G. P. 获安大略省研究基金计算调控组学培训博士后奖学金。M.B. 担任加拿大基因表达调控研究主席。

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未声明任何利益冲突。

此前已有多种方法用于在培养中诱导红系细胞分化，但效果各异。例如，某些无需在MS-5细胞上共培养的方案虽可实现红系细胞的扩增，但在生成完全成熟且无核的红细胞方面效率较低12-17。而另一些方法虽能有效促进细胞脱核，却以牺牲细胞增殖为代价18,19。本研究采用的方法最初由Douay实验室建立6，该方法结合了两个步骤：第一步为液体培养，可在红系分化早期延长细胞扩增时间，从而获得大量早期祖细胞（这对于基因组学和蛋白质组学研究至关重要）；第二步为在MS-5间充质细胞上进行共培养，这对于最大化血红蛋白合成以及实现红细胞完全脱核具有重要意义。本方法存在两点局限性：1）在分化最早阶段的扩增程度仍不足，迄今尚无法在蛋白质水平上充分表征早期红系祖细胞；2）该实验方案成本较高，尤其在大规模应用时更为显著。
细胞培养试剂和细胞因子的质量对于 离体 红系分化。值得注意的是，使用BIT（表2）作为血清替代物至关重要。根据我们的经验，使用BIT可消除此前使用分别来源的牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白时所出现的批间差异（可能源于试剂...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

红细胞生成是研究细胞分化的常用模型系统。在红细胞生成过程中，多能性成人人类造血干细胞（HSCs）会分化为寡能性祖细胞、定向前体细胞以及成熟的红细胞1。这一过程在很大程度上由基因表达水平进行调控，特定的转录因子在激活谱系特异性基因的同时，会抑制其他细胞类型特异性基因的表达2。针对调控红细胞生成的转录因子的研究通常使用人和小鼠的细胞系，这些细胞系在一定程度上代表了处于特定分化阶段的红系细胞3-5。然而，转化的细胞系只能部分模拟红系细胞，更重要的是，它们无法全面研究细胞在向终末红系命运逐步发育过程中所经历的动态变化。因此，当前仍面临一项挑战，即开发一种能够获得足够数量、处于不同分化阶段的相对均一的原代HSCs和红系细胞群体的实验方案，以满足基因组学和蛋白质组学实验的需求。
在此我们描述一种 离体 从脐带血、骨髓或经G-CSF动员的成人外周血（白细胞分离术）中分离的人造血干细胞/祖细胞诱导红系分化的细胞培养方案。该培养体系最初由Douay实验室开发 6，利用细胞因子和间充质细胞的共培养来模拟骨髓微环境。采用这种方法 离体 分化方案中，我们观察到红系祖细胞显著扩增，分化被特异性地诱导至红系谱系，并完全成熟为去核红细胞。因此，该系统为研究造血干细胞沿红系谱系发育过程中转录调控的分子机制提供了良好平台。 
在转录水平研究红细胞生成过程，还需要能够在原代红系细胞中过表达或敲低特定因子的能力。为此，我们采用一种慢病毒介导的基因递送系统，该系统可高效感染分裂期和非分裂期细胞7。本文结果显示，我们能够高效敲低原代人红系细胞中的转录因子TAL1。此外，GFP表达表明慢病毒感染效率接近90%。因此，本实验方案为解析调控红细胞生成的转录因子调控网络提供了一个极为有效的研究体系。

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP 的慢病毒展示了慢病毒介导基因递送的效率。

红细胞生成是研究细胞分化的常用模型系统。在红细胞生成过程中，多能性成人人类造血干细胞……

本实验的总体目标是将人造血干细胞和祖细胞沿红系谱系进行分化，并在体外红细胞生成过程中敲低特定的转录因子。该目标首先通过从脐带血、骨髓或经GCSF动员的外周血中分离CD34阳性的人类干细胞和祖细胞来实现。实验的第二步是利用包含特定细胞因子的四阶段细胞培养程序，并结合基质细胞层共培养，模拟骨髓微环境，从而将这些造血干细胞沿红系谱系进行分化。接下来，制备表达针对目标转录因子的HRNA分子的慢病毒载体颗粒，同时制备作为阴性对照的乱序HRA分子以及用于监测病毒感染效率的GFP蛋白。该实验流程的最后一步是用慢病毒颗粒感染处于特定分化阶段的原代人红系细胞。最终，可通过细胞形态学分析、前体细胞的集落形成能力、血红蛋白的生成以及流式细胞术检测红系特异性标志物的表达，获得有关细胞增殖和红系分化结果的数据。通过流式细胞术检测GFP表达来分析病毒感染效率，并通过反转录定量聚合酶链式反应（R-T-Q-P-C-R）分析目标转录因子的敲低效果。该方法有助于回答造血研究领域中的关键问题，例如各个转录因子调控基因表达的分子机制，且是在原代人细胞所提供的非转化环境中进行研究。这对于理解造血的基本过程（如谱系决定、自我更新增殖或细胞凋亡）具有重要意义。尽管该方法可揭示正常红系分化区域（ROIs）及其在分子水平上的调控机制，也可作为模型系统用于研究由失衡、异常增生和分化障碍所导致疾病的靶向治疗，包括真性红细胞增多症、雄激素性白血病等骨髓增殖性疾病的治疗。人造血干细胞和祖细胞体外红细胞生成的实验方案包括两个步骤：CD34阳性人造血干细胞和祖细胞的分离，以及无血清条件下的红系分化细胞培养。第一步中，采用阳性免疫选择法从脐带血、骨髓或经GCSF动员的人外周血中分离CD34阳性细胞。第二步无血清红系分化包括在液体培养基中培养CD34阳性细胞。根据从DU实验室最初建立的方法改进的四步法，从第0天到第11天，造血细胞在添加了氢化可的松、干细胞因子、白细胞介素-3和促红细胞生成素的改良ECCO培养基中培养。随后从第11天到第15天，在补充了促红细胞生成素（EPO）的IMDM培养基中，将红系细胞与MS5间充质细胞共培养，此为第三步。在收获用于后续实验的夏季红系细胞后，将剩余细胞在添加了补剂的IMDM培养基中与MS5细胞进行共培养，且培养基中不含有细胞因子。最后，从第18天到第26天，将红系细胞浓缩3至4倍，并维持在MS5细胞层上以促进其成熟，同时在添加补剂的IMDM培养基中加入10% FBS，以更好地保存体外培养的红细胞。在本视频文章中，我们将仅演示红系分化过程中的第二步，即在间充质细胞上添加促红细胞生成素（EPO）共培养红系细胞。该操作中最困难的部分是大规模进行以下步骤：洗涤并更换含有AUS五细胞的培养瓶中的培养基，用于共培养，随后将art trade细胞转移至该培养瓶中。因此，我们每次处理一个培养瓶，并同时进

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慢病毒介导的击倒在体外</em人造血干细胞>红细胞

在本视频中，我们演示一种方法，通过将 shRNA...

体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

我们介绍一种 体外 小鼠胎肝成红细胞培养系统，可解析终末红细胞生成的早期与晚期阶段。该系统有助于对不同发育阶段中特定基因的功能进行分析。...

小鼠胎肝培养系统用于解析终末红细胞生成早期和晚期靶基因功能

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本文介绍了利用转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）技术，从小鼠成体成纤维细胞诱导生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的实验方案。...

成年小鼠成纤维细胞直接谱系重编程为红系祖细胞

本方案的目的是从预处理的非人灵长类动物骨髓中分离CD34+细胞，利用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰，并制备可用于回输至自体宿主的产品。整个方案耗时约48小时。...

非人灵长类造血干细胞与祖细胞的制备及基因修饰

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外...

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。...

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

建立红细胞生成模型为理解该过程中各参与因子的生物学意义以及评估可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供了宝贵机会。本文介绍了一种简单且可靠的方法，可高效地将CD34+ 造血干细胞和祖细胞 离体.

体外与离体评估人类红细胞生成效率的综合性流程

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