条形码酵母图书馆竞争力的基因屏幕
August 11th, 2011
我们已经开发出全面的，无偏见的全基因组的屏幕，了解基因药物和基因与环境的相互作用。筛选这些突变集合的方法。
以下实验的总体目标是使用全基因组条形码微生物集合以高度平行的方式了解基因药物和基因环境相互作用。这是通过在药物存在下筛选微生物集合的 5 到 20 代生长来实现的，使用机器人技术维持细胞呈指数级生长。作为第二步，收集细胞，这使我们能够同时从 4， 000 到 6， 000 个个体中提取基因组 DNA。
接下来，使用微阵列杂交或条形码测序对包含扩增条形码的 PCR 产物进行定量，以定量条形码，从而确定复杂库中每种菌株的丰度。最终，获得的结果显示，哪些条形码突变体对处理敏感，因此在实验过程中从池中耗尽。我们今天将要看到的技术的主要优点是，我们可以提取数万或数十万种不同的菌株，并将其作为一个单一的池进行分析，而不是单独处理菌株作为平板上的菌落或单独的液体培养物。
因此，一旦我们意识到这种检测的强大功能，我们就需要将其自动化，幸运的是，我当时在斯坦福基因组技术传感器工作，周围都是允许我完成这项工作的工程师，今天演示该协议的是我实验室的高级研究生 Andrew Smith，他将介绍所有协议和相关程序， 以及 Tanya Durick，她将向我们展示如何进行实验方案的测序方面。该方案利用了在诱变时转座生成的加拿大白色念珠菌突变体库，其中每个突变体都带有条形码标签，以将单个突变体组合成一个池。将库的副本复制到 3 84 上。
含有 edia 的孔板在 30 摄氏度下培养菌落 2 到 3 天，直到它们达到最大大小。然后在微生物学环境中使用火焰和无菌 LabWare，用 5 到 10 mL 培养基浸入每个托盘，并浸泡 5 分钟。复苏，用细胞铺展器悬浮集落，并将液体和细胞倒入 50 毫升锥形离心管中。
将 DMSO 加入 7%用含有 7% DMSO 的培养基将细胞调整至最终 OD 600 浓度为每毫升 50 个，然后在 PCR 试管中等分试样和 40 微升体积，合并的细胞等分试样可以在零下 80 摄氏度下无限期储存。要开始此过程，在冰上解冻混合的细胞等分试样，立即将池轻轻稀释到含有所选药物或条件的培养基中，以 OD 600 为 0.0625 的浓度接种，总体积为 700 μL/孔在 48 孔板中。在本视频中，将准备两个条件的一式三份。
在板上至少包括一个适当的溶剂对照。用塑料板密封板密封板，在分光光度计或温控摇床中培养细胞，在 30 摄氏度下以实验确定的摇动方案摇动。例如，摇晃 14 分钟，读取孔 1 分钟，然后继续摇晃。
机器人可以收集部分细胞悬液，并将其保存在机器人甲板上的煤板上。在用户定义的生成时间点，通常为 5、10、15 和 20 代增长。每个样品和时间点至少收获 2 od 600 个细胞。
将收获的细胞样品转移到 Safe Lock 微量离心管中。然后，这些细胞可用于基因组 DNA 提取，这将在开始此过程的旁边显示。使用酵母星试剂盒从不同时间点收获的细胞中纯化的基因组 DNA。
根据制造商的说明，用一次修饰洗脱，用 300 μL 的 0.1 XTE 洗脱 DNA。接下来，为每个样品设置两个 PCR 反应。一个用于 UPT 标签，一个用于 down 标签。
检查凝胶上得到的 PCR 产物。扩增子预计两种 PCR 的 60 个碱基对产物，用于杂交，如泳道 1 和 3 所示。在此示例中，用于条形码测序的扩增子需要 130 个碱基对产品，如泳道 5 和 7 所示。
此时，PCR 产物可用于微阵列分析或直接条形码测序，具体取决于生成的 PCR 产物。为了准备微阵列分析，将杂交炉温度预热至 42 摄氏度，并设置沸水浴和装有冰水浆料的冰桶。通过缓慢填充 120 μL 的 one x 杂交来预润湿阵列。缓冲区。
在孵育阵列时，将阵列在 42 摄氏度和 20 RPM 的杂交缓冲液中孵育 10 分钟，准备具有 120 微升杂交的锁顶 0.5 毫升试管。混合每个样品，外加一个额外的样品作为每个试管的缓冲液。向杂交混合物中加入 30 μL 摄取、PCR 和 30 μL 下标 PCR，总体积为 150 μL。
煮沸 2 分钟，然后在冰水中凝固至少 2 分钟。使用前短暂旋转试管。从阵列中取出预杂交缓冲液，并加入 120 μL 杂交 PCR 混合物以防止蒸发。
用坚硬的点覆盖阵列垫片，在 42 摄氏度和 20 RPM 下杂交 16 小时。从杂交炉中取出阵列，并从芯片上去除顽固的斑点。用移液管从阵列中缓慢去除杂交混合物并填充阵列。
用 120 μL 的清洗液将阵列加载到灌注的流体站的清洗器中。将使用基因 Flex SV 3 4 50 方案洗涤阵列，并进行以下修改。染色前一个额外的步骤，洗涤 A。
洗涤 B，温度为 42 摄氏度而不是 40 摄氏度，在流流站上以 42 摄氏度而不是 25 摄氏度染色。在液流作之后，运行液流站，关闭四个 50 方案。确保没有气泡后卸下洗衣机。
将阵列放入扫描仪中，并以 560 纳米的发射波长进行扫描。130 个碱基对的 PCR 产物用于下一代条形码测序，以在 12% 页面凝胶上完成第一个单独的 12 池 DNA 样品。接下来，用 Cyber Green 对凝胶进行染色，并切出感兴趣的凝胶条带。
然后，使用 CBOT 和单读长簇生成试剂盒，通过实时 PCR 对从凝胶中提取的 DNA 进行定量，在单读长流动槽上生成簇。将流通池加载到测序仪中，观察第一个碱基脱落。此处显示的测序仪是在协议的某些点收集的代表性数组数据。
在抗真菌药物克霉唑存在下，标记的标记突变体库生长 20 代，并在 DMSO 中作为对照对数计算并绘制每个基因的 2 比率。所有对克霉唑治疗显着敏感且对数 2 比率为 2 的菌株均以红色突出显示。本例显示了四种菌株，NCP、1、ERG、2 和 ERG 11 的两个独立等位基因。
在混合筛选中检测到敏感的抗真菌药物克霉唑菌株的已知蛋白质靶标应在相同浓度药物存在下在单个生长测定中验证其敏感性。下图在此处显示了确认实验的结果。筛选中检测到的 4 株菌株相对于野生型亲本菌株生长缓慢。
BWP 17 以黑色表示。这些单独的生长曲线突出了这种混合基因药物筛选的一个重要特征，即特定菌株的绝对等级不一定反映其确切的敏感性水平。此外，结果显示了每个基因具有多个等位基因的价值。
在这种情况下，两个 ERG 11 破坏突变体对药物的敏感性略有不同。一旦掌握，这项技术可以在五天内完成，从接种筛选到分析数据（如果执行得当）。因此，虽然每个单独的实验都具有生物学启示性，但当您进行了大量实验并收集了一个数据库，以便您现在能够预测基因功能和药物作用时，真正的力量就会出现。
看完这个视频，你应该对如何准备用于池筛选的全基因组条形码突变体集合，以及如何使用显微射线或测序来识别感兴趣的基因发育后有了很好的了解。这项技术使功能基因组学领域的研究人员能够探索酵母基因组中 6， 000 个不同基因中的每一个基因的功能。
概述
本研究提出了一种使用全基因组条形码微生物集合来理解基因-药物和基因-环境相互作用的综合方法。该方法允许同时高通量筛选数千个突变体。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 微生物学
- 药物相互作用研究
背景
- 全基因组筛选对于识别基因和药物之间的相互作用至关重要。
- 条形码微生物集合有助于并行分析多个菌株。
- 筛选自动化提高了效率和通量。
- 该研究利用白色念珠菌突变体库进行实验。
研究目的
- 开发筛选基因-药物相互作用的方法。
- 自动化突变体集合分析过程。
- 量化复杂池中菌株的丰度。
使用的方法
- 条形码微生物集合在药物存在下进行生长筛选。
- 从收获的细胞中提取基因组DNA用于分析。
- PCR产物通过微阵列杂交或条形码测序进行定量。
- 实施自动化以高效处理大规模筛选。
主要结果
- 识别了对药物治疗敏感的条形码突变体。
- 证明了高通量筛选方法的有效性。
- 显示了同时分析大量菌株池的潜力。
- 为未来基因-药物相互作用研究提供了详细协议。
结论
- 开发的方法显著增强了对基因-药物相互作用的理解。
- 筛选自动化允许更高效的数据收集。
- 这种方法可以应用于未来的各种微生物研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Competitive genomic screens using barcoded yeast libraries enable high-throughput interrogation of gene function and drug response across thousands of mutants in parallel. This approach accelerates target validation by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a scalable, quantitative format. The method supports early discovery de-risking by providing reproducible fitness measurements that inform mechanistic hypotheses and prioritize candidates for downstream screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables systematic interrogation of gene-drug interactions by measuring mutant fitness depletion under selective pressure.
- Operational Value: Facilitates parallel analysis of thousands of strains, reducing the need for individual strain characterization.
- Predictive Value: Generates quantitative abundance data that supports hypothesis generation for target mechanism and pathway involvement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces reproducible barcode abundance readouts via microarray or sequencing, enabling standardized fitness scoring.
- Operational Value: Supports automation-ready workflows for drug-gene interaction profiling across diverse compound libraries.
- Scalability: Allows screening of 10,000 to 1,000,000 gene-gene or drug-gene interactions in a single experiment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses disease-relevant models like Candida albicans to assess antifungal sensitivity and resistance mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Identifies genetic determinants of drug response, such as ERG pathway mutations, to validate target engagement.
- Allelic Resolution: Enables detection of differential sensitivity across multiple alleles, improving confidence in genotype-phenotype links.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting genetic screening to hit validation and lead optimization through quantitative fitness profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free identification of genes involved in drug response via competitive growth assays.
- Screening: Generates assay-ready pooled data that enables rapid comparison of mutant abundance across treatment and control conditions.
- Analytics: Delivers quantitative readouts (e.g., log2 ratios) that allow statistical comparison of strain fitness and sensitivity scoring.
- Translational Research: Uses pathogen models to bridge basic gene function with clinically relevant drug resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic interactions across microbial systems and compound sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to fitness under drug pressure.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized pooling, automation, and parallel readout.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, system-level insights into drug mechanism and resistance pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic interaction profiles and conservation across strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics, pooled screening, and nucleic acid quantification.
- Depends on access to PCR, microarray, or sequencing infrastructure for barcode detection.
- Necessitates standardized protocols for culture maintenance, drug exposure, and time-point harvesting.
- Involves considerations for adapting the system to non-model microbes with limited genetic tools.
- Relies on sufficient barcode diversity and strain representation to ensure screen saturation and statistical power.
