Name: 条形码酵母图书馆竞争力的基因屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 了解如何使用条形码微生物文库进行高通量基因药物相互作用筛选。本方法利用自动化机器人技术和微阵列杂交或测序分析，同时检测数千个突变菌株的丰度变化，为功能基因组学研究提供高效平台。

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感谢多伦多大学 HIP HOP 实验室的 Ron Davis、Adam Deutschbauer 及全体成员提供的讨论与建议。C.N. 的研究得到了美国国家人类基因组研究中心（资助号 HG000205）、RO1 HG003317、加拿大卫生研究院（CIHR MOP-84305）以及加拿大癌症学会（#020380）的资助支持。J.O. 得到了美国国家人类基因组研究中心资助的斯坦福基因组培训项目（资助号 T32 HG00044）以及美国国立卫生研究院（资助号 P01 GH000205）的支持。GG 的研究由 NHGRI RO1 HG003317 和加拿大癌症学会（资助号 #020380）提供支持。TD 和 Donnelly 测序中心部分得到了加拿大创新基金会向 Brenda Andrews 博士和 Jack Greenblatt 博士提供的资助支持。A.M.S. 得到了多伦多大学开放奖学金的支持。

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文概述了一种实验方案，经过适度修改后，该方案可轻松适用于多种不同微生物的条形码突变体文库，从而构建带标签的突变体文库。需要强调的是，尽管我们报道的是针对致病性酵母菌C. albicans的标签化转座子诱变方案，但非常相似的方案亦可适用于多种单细胞真菌。经修改后，该方案在细菌中同样有效13，目前多个其他真菌和细菌基因组的文库正在构建中。目前，该检测方法是唯一可用于全基因组范围、无偏倚筛选基因与小分子相互作用的综合性方法。该方法尤为突出的一个特点是无需事先了解目标基因或小分子的任何信息。尽管此类检测方法具有广泛的适用性和强大的功能，但其在其他实验室的推广应用在一定程度上受到初始资金投入以及结果分析所需生物信息学工具的限制。随着下一代测序读出技术的采用以及强大分析工具的配套使用，我们预期该方法的应用将日益广泛。

条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

得益于新一代测序技术的进步，我们几乎每天都能获得新的基因组序列。这一进展的速度正在加快，预示着更深入、更广泛的应用前景。面对如此迅猛的发展，快速、并行地定义基因功能的方法变得愈发重要。酵母和大肠杆菌（E. coli）的全基因组缺失突变体文库已被广泛用作基因功能表征的重要工具，但该方法难以扩展：目前的基因删除策略要求对基因组中成千上万个基因逐一进行敲除并验证，只有完成这一繁重工作后，才能开展高通量的表型分析。在过去十年中，本实验室优化了一系列可并行操作的、小型化、高通量的全基因组筛选方法。这种并行化得以实现的关键在于将DNA“标签”或“条形码”引入每个突变体中，条形码可作为突变的替代标记，通过检测条形码的丰度即可评估突变体的适应性。在本研究中，我们旨在填补DNA序列信息与条形码标记的突变体文库之间的空白。为此，我们提出了一种转座子破坏与条形码标记相结合的新方法，使新测序但尚未充分表征的微生物也能适用于并行条形码筛选。为展示该方法的应用，我们构建了一个新的白色念珠菌（Candida albicans）条形码标记的破坏突变文库，并描述了如何利用基于微阵列和基于新一代测序的平台，在单次实验中检测10,000至1,000,000个基因-基因及药物-基因相互作用。

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。

得益于下一代测序技术的进步，我们几乎每天都能获得新的基因组序列。这些进展的速度……

以下实验的总体目标是利用全基因组条形码微生物文库，以高度并行的方式研究基因-药物以及基因-环境之间的相互作用。该目标通过在药物存在条件下，使用机器人系统将微生物文库培养5至20代，并始终维持细胞处于指数生长期来进行筛选而实现。第二步是收集细胞，从而能够同时从4,000至6,000个个体中提取基因组DNA。接下来，通过微阵列杂交或条形码测序对包含扩增条形码的PCR产物进行定量，以量化各条形码，从而确定复杂混合物中每种菌株的丰度。最终获得的结果可显示哪些带有条形码的突变体对处理敏感，因此在实验过程中从混合物中逐渐减少。我们今天将要介绍的这一技术的主要优势在于，无需像传统方法那样单独处理平板上的菌落或单独的液体培养物，而是可以同时提取数万至数十万种不同的菌株，并将它们作为一个单一的混合群体进行分析。因此，当我们意识到该检测方法的强大之处后，就需要将其自动化。幸运的是，我当时在斯坦福基因组技术中心工作，周围有许多工程师，使我能够实现这一目标。今天由我实验室的高年级博士生安德鲁·史密斯（Andrew Smith）演示该实验方案，他将逐步讲解所有操作步骤及相关流程；同时还有塔尼娅·杜里克（Tanya Durick）为我们展示该方案中测序部分的操作。本方案使用了通过转座子诱变法构建的白色念珠菌（Candida albicans）突变体文库，其中每个突变体均携带一个条形码标签，以便将多个独立的突变体合并为一个混合池。该文库的一个拷贝被复制到3个84孔板上。将含有培养基的培养板置于30摄氏度条件下培养两至三天，直至菌落达到最大尺寸。随后，在微生物操作环境（使用火焰和无菌实验器具）中，向每块培养板加入5至10毫升培养基，浸泡5分钟。用细胞涂布棒重悬菌落，并将液体与细胞混合物倒入50毫升锥形离心管中。将DMSO加入至7%。用含7% DMSO的培养基将细胞调整至终浓度为每毫升OD600为50，然后分装至PCR条状管中，每管40微升。分装后的细胞样品可在-80摄氏度长期保存。开始该操作时，将分装的细胞样品置于冰上解冻，立即轻柔地将其稀释至含有选定药物或处理条件的培养基中，在48孔板中每孔总体积为700微升，接种时OD600为0.0625。在本视频中，将制备两种条件的三个重复样本。在平板上至少设置一个合适的溶剂对照。用塑料板封膜密封平板，在分光光度计或温度控制摇床中于30摄氏度培养细胞，摇床振荡条件根据实验确定。例如，振荡14分钟，读取微孔板1分钟，然后继续振荡。可由机器人收获部分细胞悬液，并保存在机器人操作台的培养板上。在用户自定义的世代时间点（通常为生长5代、10代、15代和20代）进行收获，每个样本和时间点至少收获两个OD600的细胞。将收获的细胞样品转移至带安全锁的微量离心管中。这些细胞可用于基因组DNA提取，接下来将展示该操作步骤。使用酵母基因组DNA提取试剂盒，从不同时间点收获的细胞中纯化基因组DNA。根据生产商说明书进行操作，仅作一处修改：用 300 微升 0.1 XTE 缓冲液洗脱 DNA。接着，为每个样本设置两个 PCR 反应，一个用于扩增 UPT 标签，另一个用于扩增下游标签。在琼脂糖凝胶上检测PCR产物。用于杂交的扩增子应产生两条均为60个碱基对的条带，如第1道和第3道所示。在此示例中，用于条形码测序的扩增子应产生130个碱基对的条带，如第5道和第7道所示。此时，PCR 产物可根据所生成的产物类型，用于微阵列分析或直接条形码测序。为微阵列分析做准备，需将杂交炉预热至 42 摄氏度，并准备好沸水浴及装有冰水混合物的冰桶。通过缓慢加入 120 微升 1× 杂交缓冲液对芯片进行预湿处理。将芯片置于杂交缓冲液中，在 42 摄氏度、20 RPM 条件下孵育 10 分钟。在芯片孵育的同时，准备带有密封盖的 0.5 毫升离心管，每管加入 120 微升杂交液（每个样本加一管，另多准备一管作为缓冲液）。向杂交混合液中加入 30 微升上标签 PCR 产物和 30 微升下标签 PCR 产物，使总体积达到 150 微升。煮沸两分钟，然后置于冰水中至少两分钟。使用前短暂离心试管。从芯片上移除预杂交缓冲液，并加入120微升杂交PCR混合液以防止蒸发。用封口膜覆盖芯片垫圈，在42摄氏度、20 RPM条件下杂交16小时。从杂交炉中取出芯片，移除芯片上的封口膜。用移液器缓慢吸出芯片上的杂交液，并用洗涤液填充芯片。使用 120 微升洗涤液，将芯片装入已预启动的流体工作站的洗涤装置中。芯片将采用基因 Flex SV 3 4 50 方案进行洗涤，并作如下修改：在染色前增加一步使用洗涤液 A 的额外洗涤步骤。洗涤 B，在 42 摄氏度下进行，而非 40 摄氏度，并在流体工作站上于 42 摄氏度染色，而非在 25 摄氏度。完成流体操作后，运行流体工作站，执行关闭四 50 协议。在确认无气泡存在后，卸载洗涤仪。将芯片放入扫描仪，在560纳米发射波长下进行扫描。使用130个碱基对的PCR产物进行下一代条形码测序，以在12% PAGE凝胶上首先分离12个DNA样本池。接着，用Cyber Green染色凝胶，并切下目标凝胶条带。从凝胶中提取的DNA随后通过实时PCR进行定量，并使用CBOT和单端读长簇生成试剂盒在单端读长流动池中生成簇。将流动池装入测序仪并观察首个碱基的读出。此处显示的测序仪为代表性阵列，在实验方案的某些时间点收集数据。在抗真菌剂克霉唑存在下以及以DMSO作为对照的条件下，将标记的突变体文库培养了20代，针对每个基因计算并绘制了log2比值。所有在克霉唑处理下表现出显著敏感性且log2比值为2的菌株以红色标出。本示例中展示了四个菌株：NCP1、ERG2以及ERG11的两个独立等位基因。在混合筛选中被检测为对克霉唑敏感的菌株，应通过在相同药物浓度下的单独生长实验来验证其敏感性。下图展示了本实验的验证结果。筛选出的四个菌株相对于野生型亲本菌株的生长均有所下降。以黑色标示的 BWP 17。这些单独的生长曲线凸显了此类混合基因药物筛选的一个重要特征，即特定菌株的绝对排名并不一定反映其确切的敏感程度。此外，结果还表明了为每个基因提供多个等位基因的重要性。在这种情况下，两个ERG11基因破坏突变体对药物的敏感性略有不同。如果操作得当，掌握该技术后，从接种筛选到数据分析可在五天内完成。因此，尽管单个实验在生物学上已具有揭示意义，但真正的优势在于进行大量实验并积累数据库后，能够据此预测基因功能和药物作用机制。观看本视频后，您应能充分理解如何制备用于混合筛选的全基因组条形码突变体文库，以及如何在该技术建立后利用微阵列或测序方法鉴定目的基因。该技术使功能基因组学领域的研究人员能够探索酵母基因组中约6,000个不同基因各自的功能。

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