Name: 单果蝇 Ommatidium解剖和影像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 学习单果蝇小眼解剖与成像技术，用于神经退行性疾病模型中的细胞内事件研究。该方法可制备原代神经元培养物，支持药物处理和高级成像分析。

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感谢 Bernard Charroux 的讨论交流。本工作由 KCL 医学院资助。

1. 解剖 果蝇 视网膜
<ol>
<li>在3孔玻璃载片的一个孔中加入磷酸盐缓冲液（PBS 1X），然后用CO2麻醉果蝇。本实验可使用雄性和雌性果蝇。</li>
<li>果蝇麻醉后，用镊子夹取一只果蝇，放入PBS小培养皿中。</li>
<li>在解剖显微镜下，用镊子夹住果蝇的喙部，再用另一把镊子剪断颈部，将头部与身体分离。</li>
<li>用镊子夹住果蝇头部的喙部，用显微剪沿左右中线将头部纵向剪开，以暴露脑组织。</li>
<li>用剪去尖端的移液器吸头取出视网膜，并转移至3孔玻璃载片的另一个孔中，该孔内预先加入Schneider培养基。</li>
<li>首先剥离大部分头部的头壳，然后用镊子取出脑组织，保持视网膜夹在视叶与角膜之间。</li>
<li>接着，将视网膜转移至载片表面的一滴新鲜Schneider培养基（50 μl）中。</li>
</ol>
2. 小眼的解剖
<ol>
<li>根据解剖的最终目的（即时成像或培养）以及荧光显微镜的光学结构（直立或倒置），此步骤可在载玻片或24孔板中进行。本解剖的最终目的是将小眼直接解剖到玻璃载玻片上。</li>
<li>用镊子夹住视网膜的最背侧或最腹侧末端，使用显微剪刀沿背腹中线将视网膜剪成两半，以暴露眼组织中央的小眼结构。</li>
<li>继续夹持视网膜，使角膜朝下、视神经纤维层（lamina）朝上。使用细钨针将小眼从视神经纤维层和角膜上分离下来。</li>
<li>单个小眼或小眼群体会聚集在孔板底部或载玻片上。在继续操作前，清除可能积聚的较大碎片。</li>
</ol>
3. 处理、染色与成像
<ol>
<li>为分析自噬，将Lysotracker以1:1000比例稀释于Schneider液滴中（先用Schneider培养基1:10稀释，然后取0.5 μl加入载玻片上的液滴），混匀后静置10秒。</li>
<li>小心移除载玻片上多余的液体，注意保留眼小面结构。建议使用细尖的凝胶上样枪头进行此操作。</li>
<li>加入一滴Vectashield封片剂覆盖眼小面，盖上盖玻片，并用指甲油密封。</li>
</ol>
4. 典型结果：

正确执行该方案后，应得到大量单个的小眼以及由视网膜碎片连接在一起的小眼小簇，但在角膜侧则应清晰分离。这些结构可如本示例所示进行成像，以观察 Atg8:GFP 和溶酶体示踪剂（Lysotracker），从而显示自噬体、溶酶体及自噬溶酶体（图 3）。该方法可用于活体成像，但需注意 Schneider 培养基的自发荧光会干扰弱强度荧光信号的识别。另一个问题是，仍附着在光感受器上的色素颗粒具有强烈荧光，尤其在红色通道中明显。因此，可能需要拍摄明场图像以将其与真正的细胞器区分开来。
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="果蝇解剖流程图，展示视网膜制备与成像的步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 从果蝇视网膜中获取单个或少量小眼的解剖操作流程图。
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="复眼小眼解剖流程图，关联嵌合技术、衰老处理、染色及成像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 本简易实验方案可能的多种变异，包括在解剖与染色或培养（最长24小时）之前引入果蝇遗传学操作和衰老处理，以及在解剖之后进行药物干预。
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="荧光显微镜，GFP:Atg8 和 LysoTracker，自噬分析，细胞成像结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 来自一只 w; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP::Atg8/+ 果蝇的单个分离小眼，经共聚焦扫描显示自噬体与溶酶体的分布，该果蝇表达多聚谷氨酰胺Atrophin突变体，并在29°C下培养12天。右上角的明场图像显示小眼几乎完整的结构，框线表示扫描区域。红色标记溶酶体，绿色标记自噬体，两种细胞器融合形成的自噬溶酶体呈黄色。箭头指示两个正在进行的自噬体与溶酶体融合事件。

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的单个小眼解剖技术能够获取关于神经变性等过程更深入的细胞生物学信息，这些过程可在Drosophila eye中建模研究。感光神经元比其他神经元更容易获取，且其细胞质特别丰富，因此非常适合在活体in vivo中用于量化神经变性的同一类细胞中研究囊泡动态。该解剖技术的关键在于必须对未固定的组织进行操作，且组织绝不能暴露于空气中或干燥。该基础技术具有广泛的拓展可能性（图2），有望彻底改变从神经变性眼部模型中获得的信息，使初级神经元培养中可行的各种操作与果蝇中卓越的遗传修饰能力相结合成为可能。
结合在神经退行性研究中极为有用的嵌合技术9，该方法可能实现在同一果蝇体内，于野生型对照存在的条件下，鉴定特定突变小眼细胞中的细胞生物学改变。
将解剖得到的单眼小体在体外培养时，对雷帕霉素10或百草枯11等药物的反应相比在活体果蝇中给药更易于控制和定量。该系统的主要局限在于解剖后单眼小体在培养中的存活时间，目前我们尚未能将其显著延长至24...

<table><tbody><tr><td>便携式 CO2 分配器</td><td>Flystuff</td><td>59-150</td><td>也可购买补充装</td></tr><tr><td>DUMONT 镊子 No 5</td><td>Agar Scientific</td><td>T5034</td><td></td></tr><tr><td>三孔玻璃载片</td><td>EMS</td><td>71561-01</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>VWR international</td><td>HAMMHSB516-09</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Medium</td><td>VWR international</td><td>733-1663</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 载玻片</td><td>VWR international</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>631-1336</td><td></td></tr></tbody></table>

单个drosophila小眼的解剖与成像

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

果蝇Drosophila melanogaster为神经科学研究做出了不可估量的贡献，因其强大的遗传学工具而被广泛用作神经退行性疾病的模型1。其中，果蝇复眼尤其成为神经退行性研究的首选器官，因为它是Drosophila神经系统中最易接近且对生存非必需的部分。然而，完整复眼的主要局限在于，由于色素的强烈自发荧光，难以对自噬动态等细胞内事件2进行成像，而这些事件对于理解神经退行性过程至关重要。
我们最近采用了单个小眼的解剖与培养技术3，该技术对于理解齿状核-红核-苍白球-路易体萎缩症（DRPLA）果蝇模型中自噬功能障碍至关重要3, 4。
本文现报告该技术的全面描述（图1），该技术改编自电生理学研究5，有望极大地拓展果蝇在神经退行性疾病模型中的应用前景。该方法可适用于活体观察亚细胞事件，并监测药物对感光细胞的有效递送（图2）。若与嵌合体技术结合使用6-8，可同时平行检测遗传背景不同的细胞的反应（图2）。

利用成年 Drosophila 眼研究神经变性和细胞生物学的主要限制因素是细胞内过程的成像困难。我们描述了单个单眼的解剖方法，以建立真正意义上的原代神经元细胞培养体系，该体系可用于药物处理和高级成像分析。

单个Drosophila小眼的解剖与成像

果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为神经科学研究做出了不可估量的贡献，被广泛用作神经退行性疾病的模型……

本实验的总体目标是解剖并成像单个果蝇或拟暗果蝇，以研究神经退行性模型中的细胞内事件。该过程首先将果蝇头部与身体其余部分分离，然后将其切开。接下来，将脑组织和其他组织从头部内取出。然后去除角质层，并将每只视网膜切成两半。该操作步骤的最后一步是用钨针挖出O形组织，并将其置于载玻片上。最终，可以通过荧光共聚焦显微镜获得显示细胞质中自噬细胞器的结果。该技术的主要优势在于，它能够在神经退行性变的果蝇模型中实现高分辨率的细胞生物学分析，而此前该领域仅能提供遗传学层面的见解，这表明该实验方案具有可变性。本实验由我实验室的一名研究生在中心组织学与显微镜技术员 Daniel Mackay 的协助下完成。首先，在三孔玻片的一孔中加入磷酸盐缓冲液，然后用二氧化碳麻醉果蝇。待果蝇被麻醉后，用镊子夹取一只果蝇，放入盛有PBS的小培养皿中。在解剖显微镜下，用镊子夹住果蝇的喙部，然后剪断颈部，将头部与身体分离。用第二把镊子夹住果蝇的喙部固定头部，用显微剪刀沿头侧吻侧中线将头部切为两半。为暴露大脑，使用剪去尖端的移液枪头拾取头部并连同视网膜一起转移至另一含有 Schneider 培养基的孔中。用镊子剥离大部分头部的头壳，随后取出大脑。将视网膜保持在脉络膜和角膜之间。接着，将视网膜转移至一滴50微升的新鲜Schneider培养基中。将培养基直接置于载玻片上，用镊子夹住视网膜的最背侧或最腹侧末端，并使用微型剪刀进行操作。沿背腹中线将视网膜切成两半，以暴露眼球中部的AMIA。继续夹持视网膜，使角膜朝下，视神经纤维层（lamina）朝上。使用细钨针，先将oia从视神经纤维层分离，再从角膜处分离。单个油滴和成群的油滴将聚集在孔板或载玻片底部。在继续操作前，去除可能聚集的较大气泡。为分析自噬，将Lito tracker用一滴Schneider培养基按1:1000比例稀释，混匀后静置10秒。从载玻片上移除多余的液体，注意保留 AMIA。加入一滴封片剂以覆盖 AMIA。使用共聚焦显微镜观察，将盖玻片封片并用指甲油密封，可在一只表达突变型atropin的果蝇中分离出的单个精小管内同时观察到由gfp标记的TG八号吞噬体以及由LyoTracker标记的溶酶体。右上角的明场图像显示了精小管近乎完整的结构，框线表示扫描区域。其中，红色标记溶酶体，绿色标记自噬体。自噬溶酶体由两种细胞器融合而成，呈黄色。完成此操作后，可进行其他方法，如材料培养和药物处理，以回答不同的科学问题，例如在不同遗传背景的神经元细胞中，对自噬标志物具有有效作用的化合物。结合果蝇遗传学的优势与细胞培养中可行的某些先进细胞生物学分析方法。

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单果蝇 Ommatidium解剖和影像

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