单个Drosophila小眼的解剖与成像

本实验的总体目标是解剖并成像单个果蝇或拟暗果蝇，以研究神经退行性模型中的细胞内事件。该过程首先将果蝇头部与身体其余部分分离，然后将其切开。

接下来，将脑组织和其他组织从头部内取出。然后去除角质层，并将每只视网膜切成两半。该操作步骤的最后一步是用钨针挖出O形组织，并将其置于载玻片上。

最终，可以通过荧光共聚焦显微镜获得显示细胞质中自噬细胞器的结果。该技术的主要优势在于，它能够在神经退行性变的果蝇模型中实现高分辨率的细胞生物学分析，而此前该领域仅能提供遗传学层面的见解，这表明该实验方案具有可变性。本实验由我实验室的一名研究生在中心组织学与显微镜技术员 Daniel Mackay 的协助下完成。

首先，在三孔玻片的一孔中加入磷酸盐缓冲液，然后用二氧化碳麻醉果蝇。待果蝇被麻醉后，用镊子夹取一只果蝇，放入盛有PBS的小培养皿中。在解剖显微镜下，用镊子夹住果蝇的喙部，然后剪断颈部，将头部与身体分离。

用第二把镊子夹住果蝇的喙部固定头部，用显微剪刀沿头侧吻侧中线将头部切为两半。为暴露大脑，使用剪去尖端的移液枪头拾取头部并连同视网膜一起转移至另一含有 Schneider 培养基的孔中。用镊子剥离大部分头部的头壳，随后取出大脑。

将视网膜保持在脉络膜和角膜之间。接着，将视网膜转移至一滴50微升的新鲜Schneider培养基中。将培养基直接置于载玻片上，用镊子夹住视网膜的最背侧或最腹侧末端，并使用微型剪刀进行操作。

沿背腹中线将视网膜切成两半，以暴露眼球中部的AMIA。继续夹持视网膜，使角膜朝下，视神经纤维层（lamina）朝上。使用细钨针，先将oia从视神经纤维层分离，再从角膜处分离。

单个油滴和成群的油滴将聚集在孔板或载玻片底部。在继续操作前，去除可能聚集的较大气泡。为分析自噬，将Lito tracker用一滴Schneider培养基按1:1000比例稀释，混匀后静置10秒。

从载玻片上移除多余的液体，注意保留 AMIA。加入一滴封片剂以覆盖 AMIA。

使用共聚焦显微镜观察，将盖玻片封片并用指甲油密封，可在一只表达突变型atropin的果蝇中分离出的单个精小管内同时观察到由gfp标记的TG八号吞噬体以及由LyoTracker标记的溶酶体。右上角的明场图像显示了精小管近乎完整的结构，框线表示扫描区域。其中，红色标记溶酶体，绿色标记自噬体。

自噬溶酶体由两种细胞器融合而成，呈黄色。完成此操作后，可进行其他方法，如材料培养和药物处理，以回答不同的科学问题，例如在不同遗传背景的神经元细胞中，对自噬标志物具有有效作用的化合物。

结合果蝇遗传学的优势与细胞培养中可行的某些先进细胞生物学分析方法。