Name: Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode om RNA-virusfidelityvarianten te isoleren en te karakteriseren via mutagenese en sequencen. Deze techniek helpt onderzoekers polymerasefouten en virale evolutie te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Medical and Health Research subsidie ​​van de stad Parijs, de Franse Nationale subsidie ​​ANR-09-JCJC-0118-1 en de ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Project nee. 242719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

Keuze van cellijn. De werkzaamheid van de basis-analogen als RNA mutagene correleert met hun relatieve opname door verschillende celtypes 11. Als de cel lijn die normaal gesproken wordt gebruikt voor het virus passage blijkt te zijn ongevoelig voor de opname of te gevoelig is (hoge cel toxiciteit) mutageen, kan het nodig zijn naar een andere cel lijn die aan deze eisen voldoet en is nog steeds tolerant om virale replicatie gebruiken. Zodra de weerstand mutageen variant is geïsoleerd, kan de rest van de karakterisering worden uitgevoerd in de oorspronkelijke, bij voorkeur cellijn. In onze ervaring, HeLa cellen gemakkelijk nemen mutageen; BHK cellen nodig hebben tot en met 10-voudig hogere concentraties en Vero-cellen ongevoelig mutageen opname. Keuze van de mutagene stof. In een poging om trouw varianten isoleren door mutageen behandeling, de kans op succes neemt toe als er meer dan een type van de mutagene stof wordt gebruikt. Base analoge mutagene stoffen van andere structuur, die ten onrechte zijn opgenomen in het genoom tijdens de replicatie zal vooral leiden resulteren in een specifieke subset van de mutaties in de volgende replicatie cycli: ribavirine behandeling gunsten GtoA en CtoU overgang mutaties 12, 5-azacytidine heeft een soortgelijke vooringenomenheid, met de toevoeging van CtoG en GtoC transversies 13, 5-fluorouracil bij voorkeur induceert AtoG en UTOC overgangen 14. Als alternatief, hogere concentraties van Mg 2 + of Mn 2 + kan worden aangevuld tot het medium om de totale mutatie frequentie van RNA-virussen te verhogen zonder de bias hierboven beschreven 12. Afhankelijk van codon van het virus &#39;sequenties, en het codon veranderingen die nodig zijn om een ​​trouw variant te genereren, een aantal van deze voorwaarden zal de opkomst van deze variant ten opzichte van andere gunst. Voor de grotere natuurgetrouwheid poliovirus G64S en Coxsackie virus A372V, ribavirine behandeling het gemakkelijkst geselecteerd voor de varianten omdat de vereiste AtoG overgang op de codon locatie overeen met de mutaties voornamelijk gegenereerd door deze ribavirine. MOI vs grootte van de populatie. In virologie, protocollen voor weefselkweek infectie bijzondere aandacht besteden aan de veelheid van infectie (MOI), om de accumulatie van defecte storende deeltjes (low MOI) te vermijden of om recombinatie te bevorderen tussen virussen (hoog MOI), voor voorbeeld van. Te selecteren voor de opkomst events via seriële passage, is het ook belangrijk om te overwegen virus grootte van de populatie. Omdat de resistente mutant er aanvankelijk sprake is van lage frequentie, is het best om een zo groot bevolkingsomvang mogelijke transfer van een doorgang naar de volgende (10 5 -10 6 virussen, bijv.) om te voorkomen dat deze nieuwe varianten bij elke passage. Het opschalen van de grootte van goed of kolf (aantal geïnfecteerde cellen) kan helpen om de toename van de MOI een minimum te beperken als dit van belang. Aan de andere kant, voor experimenten waarbij de gevoeligheid van een virus om mutageen wordt getest, is laag MOI infectie uitgevoerd om het aantal van replicatie cycli die zich in het experiment te vergroten en de redding van gemutageniseerd genomen te voorkomen door een hogere fitness genomen door complementatie in co-geïnfecteerde cellen. Dit is belangrijk omdat de mutaties gegenereerd op nakomelingen genomen tijdens de eerste ronde van de replicatie niet onmiddellijk worden opgespoord. De meeste van deze gemutageniseerde RNA&#39;s worden nog steeds verpakt in virion. Het is in de volgende ronde van de infectie die dodelijke mutaties aanwezig zijn in deze genomen zal resulteren in een afgebroken replicatie cyclus, en vermindering van de virus titer. Het kan nodig zijn om voor de verschillende rondes van de accumulatie van mutaties voor een significant effect van dodelijke mutagenese wordt waargenomen. Ten slotte, als over de passage-serie in de aanwezigheid van de mutagene stof, het virus titers blijven dalen tot uitsterven, dan is de onderzoeker moet proberen passage virus in steeds grotere hoeveelheden van de mutagene stof (uitgaande van een zeer lage concentratie). Isolatie en generatie van de RNA-mutageen resistente kloon van de RNA mutageen-resistente populatie. RNA mutagene stoffen te introduceren meerdere willekeurige mutaties aan elke genoom, maar selectie op weerstand zal alleen maar verrijken (en vast tot consensus sequentie), de weerstand mutatie. Het identificeren van deze mutatie, hebben we de volgorde van de mutagene resistente populatie (consensus van de bevolking) en niet van individuele virussen. Vandaar dat de single, willekeurige mutaties die door de mutageen niet gedetecteerd in de volgorde, alleen de mutaties die resulteren in consensus veranderingen na selectie worden gevonden. In onze ervaring hebben we slechts melding gemaakt van een of twee van dergelijke consensus sequentie veranderingen. Zodra de mutageen resistente bevolking wordt verkregen en de weerstand mutatie is geïdentificeerd, is het noodzakelijk om het genereren van een meer pure voorraad van deze variant. Hierboven beschreven we een plaque zuivering procedure. Anderzijds, als het virus van belang niet gemakkelijk te identificeren plaques leidt, kunnen de gewenste variant worden PurifIED door beperkende verdunning. Deze aanpak is in wezen een TCID 50 in 96-well formaat, waar het virus voorraad is verdund zodanig dat minder dan 50% van de putten zijn besmet. Met behulp van deze verdunning is dezelfde aanpak als hierboven genomen, in het isoleren van maximaal 10 individuele varianten en bevestigen van hun sequenties. Zoals gezegd, in het beste geval, een aanstekelijke cDNA-kloon van de virusstam beschikbaar is. Isolatie van de variant zou dus niet nodig. In onze ervaring, trouw varianten zijn het resultaat van enkele aminozuursubstituties en kan dus worden gegenereerd met behulp van eenvoudige, gecommercialiseerd mutagenese kits, zoals Quikchange (Agilent). Een tweede optie is het gebruik van een cDNA-kloon van een nauw verwante stam. Echter, als een verwante stam wordt gebruikt, raden we u aan zowel deze aanpak en virusisolatie (bijv. plaque zuivering), omdat we hebben vastgesteld dat dezelfde trouw te veranderen mutatie op twee nauw verwante virussen niet noodzakelijk hetzelfde effect hebben. Fidelity en replicatie. Selectie van RNA mutageen resistente varianten hebben geleid tot de isolatie van zowel de hogere en lagere trouw varianten met groei-eigenschappen die vergelijkbaar zijn met hun wild type tegenhangers 4,12,15. Op dit moment is de schakel tussen polymerase-activiteit tarieven en trouw niet volledig begrepen. In vitro biochemische met gebruikmaking van gezuiverd RNA-polymerase hebben aangetoond dat een hogere betrouwbaarheid varianten tragere verwerking tarieven zijn, terwijl lagere trouw varianten hebben de neiging om een snellere verwerking 1-3,12 hebben. In weefselkweek, deze verschillen zijn meestal niet evident, wat suggereert dat de beschikbaarheid van middelen, in plaats van intrinsieke polymerase activiteit kinetiek, is de snelheidsbeperkende stap. Als de trouw variant repliceert met een kinetiek die niet significant verschillend van wild-type, dan is een vergelijking van hun mutatie frequenties kunnen direct worden gemaakt. Als een zeer belangrijke verandering in de kinetiek replicatie bestaat, dan is de gegevens moeten worden genormaliseerd om rekening te houden kinetische verschillen, bijvoorbeeld door het vergelijken van virussen die zijn onderworpen aan dezelfde aantal replicatie cycli. In onze ervaring, hoewel geen significante verschillen in de een-staps groeikinetiek waargenomen tussen wild-type en de high-fidelity varianten, zagen we dat hogere betrouwbaarheid varianten consequent titer hoger (binnen een log) in vergelijking met wild-type, maar ze maken iets minder RNA (binnen dezelfde orde van grootte), verder wat suggereert dat de genomen ze produceren minder mutaties bevatten en zijn dus, meer aanstekelijk. Monstervoorbereiding en sequencing. Voor alle stappen in deze protocollen, is het noodzakelijk dat high-fidelity, proof-reading enzymen worden gebruikt voor PCR en RT-PCR te beperken tot invoering van aanvullende mutaties, omdat zij niet kunnen worden onderscheiden van biologisch relevante mutaties. Het is van cruciaal belang dat het virus de bevolking te vergelijken zijn opgesteld in dezelfde omstandigheden (passage geschiedenis, weefselkweek medium, temperatuur, RNA-extractie methode, RT-PCR-protocollen, etc.) Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat er voldoende uitgangsmateriaal was verkregen uit de RNA-extractie zodanig dat een sterke band wordt gegenereerd door RT-PCR. A 1 / 100 verdunning van het RNA-monster moet geven ook een detecteerbaar RT-PCR band, wat aangeeft dat de steekproef voldoende van RNA-moleculen om de vertegenwoordiging partijdigheid te vermijden (het versterken van de zelfde genoom herhaaldelijk) bevat. Omdat mutatie frequentie is een distributie, zou men verwachten dat vergelijkbare waarden, ongeacht de grootte van de populatie worden verkregen, op voorwaarde dat de hiervoor genoemde vooroordeel niet plaatsvindt. Zoals figuur 6 laat zien, een 10 5-voudige verdunning van een virus voorraad geeft een mutatie frequentie die niet significant verschillend van het ouderlijk voorraad. Tot de optimale omstandigheden voor TopoTA klonen worden gevonden, bevestigen de aanwezigheid van inserts na blauw / wit screening, door de kolonie PCR voor sequencing. Als een controle voor mutatie-ruis (mutaties geïntroduceerd door RT-PCR en sequencing), kloon een PCR-product van een plasmide met dezelfde virale sequentie en / of klonen en sequentie RT-PCR-producten van in-vitro getranscribeerde RNA die overeenkomt met virus genoom (be ervan bewust dat verschillende in vitro transcriptie enzymen hebben verschillende fouten en nuttige informatie niet te geven over de werkelijke achtergrond fout in uw procedure). Sommige virus sequenties giftig kunnen zijn voor bacteriën, dus is het belangrijk om dit te verifiëren alvorens te beslissen over de regio van virale genoom worden gesequenced voor mutatie frequentie. Bij de analyse van sequenties die zijn verkregen door TopoTA, er rekening mee dat elke kloon alleen een insert / sequentie bevatten. Als er een dubbele piek wordt waargenomen, hetgeen duidt op een gemengde bevolking, is het mogelijk dat twee naburige kolonies werden geselecteerd. Het is ook mogelijk, hoewel zeer onwaarschijnlijk, gezien de lage frequenties mutatie in bacteriële replicatie, dat de mutatie werd geïntroduceerd tijdens de versterking van het plasmide in de bacteriële cultuur. In plaque purified populaties, kan een dubbele piek vertegenwoordigen overlappende plaques, of een virus dat is het verwerven van een nieuwe mutatie of een terugkeer van een mutatie tijdens de plaque ontwikkeling. Wees consistent en beslissen over het al dan tellen of tellen niet mee deze mutaties. Tot slot, houd er rekening mee dat de mutatie frequenties hier gebruikt zijn relatieve waarden. Ze zijn alleen geldig in het vergelijken van virus populaties gegroeid onder dezelfde voorwaarde, en gesequenced over dezelfde regio! Zij moeten niet worden beschouwd als absolute waarden van de mutatie snelheid, of de mutatie frequentie van het genoom als geheel. Echter, wanneer de omstandigheden onder controle zijn, hebben ze mogelijk reproduceerbaar, kwantitatieve vergelijkingen van de verschillen in de mutatie distributie en frequentie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> ribavirine </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> Sigma </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan blauw </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA klonen kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutagenese kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Als een cDNA-kloon besmettelijk is beschikbaar </td></tr><tr><td> 96-well Miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Of andere uitlijning software </td></tr></tbody></table>

isolatie van fidelity varianten van rna-virussen en karakterisering van mutatie van de virussen frequency

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA-virussen gebruik van RNA-afhankelijke RNA polymerase van hun genoom repliceren. De intrinsiek hoge foutenmarge van deze enzymen is een grote bijdrage aan het genereren van extreme diversiteit die de bevolking virus aanpassing en evolutie mogelijk maakt. Steeds meer bewijs toont aan dat de intrinsieke fout tarieven, en de daaruit voortvloeiende mutatie frequenties, van de RNA-virussen kan worden gemoduleerd door subtiele aminozuur veranderingen in het virale polymerase. Hoewel de biochemische testen bestaan ​​voor sommige virale RNA-polymerasen die kwantitatieve meting van oprichting trouw mogelijk te maken, hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het meten mutatie frequenties van RNA-virussen die heeft bewezen te worden zo nauwkeurig als biochemische aanpak in het identificeren van trouw veranderen mutaties. De aanpak maakt gebruik van conventionele virologische en sequencing technieken die kunnen worden uitgevoerd in de meeste biologische laboratoria. Gebaseerd op onze ervaring met een aantal verschillende virussen, hebben we de belangrijkste stappen die moeten worden geoptimaliseerd om de kans op het isoleren van trouw varianten en het genereren van gegevens van statistische significantie te verhogen. De isolatie en karakterisering van trouw te veranderen mutaties kunnen nieuwe inzichten in polymerase structuur en functie 1-3. Bovendien kunnen deze trouw varianten handige tools zijn in het karakteriseren van de mechanismen van het virus aanpassing en evolutie 4-7.

In dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om te isoleren en te karakteriseren RNA polymerase trouw varianten van RNA-virussen en hoe je mutatiefrequentie gegevens gebruiken om trouw veranderingen in weefselkweek te bevestigen.

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA-virussen maken gebruik van RNA-afhankelijke RNA-polymerasen om hun genomen te repliceren. De intrinsiek hoge foutmarge van deze enzymen draagt in grote mate bij aan de ...

RNA-virussen maken gebruik van viraal gecodeerde RNA-polymerasen om hun genomen te repliceren. Deze polymerasen hebben een intrinsiek hogere foutmarge, waardoor het virus zich snel kan aanpassen en evolueren. Deze video presenteert een geoptimaliseerde methode om virussen te screenen en te identificeren met mutaties in hun RNA-polymerase die de foutmarge of getrouwheid tijdens replicatie beïnvloeden.Eerst worden mutagenen toegepast op virale gastheercellen om het maximale niveau van het mutagen te bepalen dat kan worden gebruikt zonder de cellen te doden of het virus te remmen. Zodra de optimale omstandigheden zijn bepaald, wordt het virus gepassaged onder de selectieve druk van RNA-mutagenen. De mutagenenresistente populatie wordt vervolgens gesequenced om de verantwoordelijke mutatie te identificeren.Vervolgens wordt de mutagen-resistente mutant geïsoleerd. De replicatiekinetiek wordt gemonitord en de resultaten tonen toenames of afnames in de getrouwheid van de polymerase. Dit gaat gepaard met een brede resistentie tegen RNA-mutagenen en veranderingen in de mutatiefrequentie van de viruspopulatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals biochemische getrouwheidsmetingen met gezuiverde polymerasen, is dat deze technieken geldig zijn voor elk RNA-virus dat in kweekmedium kan worden gecultiveerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de virologie, zoals de rol van polymerase-foutgevoeligheid bij de adaptatie en evolutie van virussen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden omdat de door hen gehanteerde selectieve druk ofwel te sterk of te zwak is, en omdat de grootte van de geanalyseerde sequentie-regio en het aantal klonen niet zijn geoptimaliseerd voor statistische kracht.Begin dit experiment door het bereik van mutageenconcentraties te bepalen die in de volgende experimenten kunnen worden gebruikt zonder dat dit tot celdood leidt. Aspireer het medium uit zeswellplaten met subconfluente monolagen van hilaire cellen. Voeg vervolgens twee milliliters mutageen-gesupplementeerd medium toe; hierbij worden de mutagenen ribovirine, 5-fluorouracil, 5-azacitidine, magnesiumchloride en mangaanchloride gebruikt.Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Gebruik vervolgens elke 24 uur gedurende de volgende twee tot zeven dagen één plaat cellen om de levensvatbaarheid te controleren via trypanblauw-exclusie. Bereken met behulp van een hemocytometer het percentage levensvatbare cellen voor elke concentratie mutagen, inclusief de onbehandelde controlecondities die resulteren in minder dan 50% celsterfte aan het einde van de infectie.Wanneer de maximale titers zijn bereikt en optimaal zijn, is de volgende stap van de procedure het bepalen van de concentratie mutagen die een optimale selectiedruk uitoefent zonder de populatie bij de juiste concentraties overmatig te muteren. Elk genoom wordt op ten minste één of twee posities gemuteerd. Het mutagen zal zo de resistentiemutatie genereren, die vervolgens tijdens de passage zal worden geselecteerd.Als er te veel mutaties worden geïntroduceerd, zullen de mutanten die de resistentiemutatie dragen zelf letaal zijn. Het mutagen belemmert hun isolatie in zes-wellplaten gezaaid met cellen. Onze cellen in twee milliliter mutagen-gesupplementeerd medium gebruiken dezelfde concentratiebereiken als voorheen, met uitzondering van concentraties die leidden tot meer dan 50% celdood.Incubeer gedurende twee uur om de opname van het mutagen na de incubatie mogelijk te maken. Aspireer het medium en infecteer met virus bij een lage multiplicity of infection in 200 µL; incubeer gedurende 15 tot 60 minuten om het virus de cellen te laten infecteren, waarbij de plaat met regelmatige tussenpozen wordt geschud om te garanderen dat het inoculum de cellaag bedekt. Aspireer het geïnoculeerde virus en was tweemaal met twee milliliter PBS om zoveel mogelijk van het inoculum te verwijderen.Voeg vervolgens medium met mutagen tot elke well toe en incubeer de cellen voor het equivalent van drie tot zes replicatiecycli, gewoonlijk twee tot zeven dagen. Oogst het virus uit elke well en voer een standaard plaque-assay of limiterende verdunning uit om het antivirale effect op de virustiter te bepalen op basis van de berekende titers. Identificeer de concentratie van het mutagen die de virustiters met 0,5 tot twee logs verlaagt ten opzichte van de onbehandelde controle-infectie en die bovendien niet sterk toxisch is voor de cellen.Bij voorkeur minder dan 50% toxiciteit om mutagen-resistente varianten te isoleren. Begin met het passeren van het virus in healer-cellen met de optimale concentratie van elk mutagen; het virus moet mogelijk tot 30 keer gepasseerd worden. Bepaal bij elke passage de virustiter en herhaal de infectie en incubatie met mutagen zoals hier getoond. De virustiters van mutagen-behandelde monsters zouden tijdens de eerste paar passages moeten dalen in vergelijking met de oorspronkelijke virustiter en de titers van het onbehandelde controlevirus. Zodra de virustiters voor een bepaalde reeks dezelfde grootte bereiken als de titers van de onbehandelde controle, duidt dit op resistentie.Extraheer het virale RNA voor sequencing met behulp van primers die de polymerase- of replicatiegenen van het betreffende virus amplificeren. Genereer cDNA van het virale genoom via RT-PCR en sequence vervolgens het DNA. Zodra de sequentie-informatie is verkregen.Gebruik alignmentsoftware om de resulterende sequenties uit te lijnen met de referentieconsensus en identificeer de nieuwe puntmutaties. Controleer daarnaast de chromatogrammen op minderheidspieken die mogelijk door de alignmentsoftware zijn gemist. Een mutant die 20 tot 30% van de totale populatie vertegenwoordigt, zal nog steeds als piek zichtbaar zijn, maar is te klein om bij een standaard sequentieanalyse als gemengd nucleotide te worden geïdentificeerd. Om de mutatie van belang te identificeren, moet er worden gezocht naar enkelvoudige nucleotidepolymorfismen die uitsluitend voorkomen in de met mutagenen behandelde populatie vergeleken met de onbehandelde controle van dezelfde passage, zoals hier wordt getoond. Zodra een mutatie is geïdentificeerd, moet de resistente variant worden geregenereerd vanuit infectieus cDNA of worden geïsoleerd in weefselkweek, waarna het resistentiefenotype moet worden bevestigd.Hier passen we een plaque-assay toe om de geïdentificeerde mutanten te isoleren. Bereid een seriële verdunning van het stikstofresistente monster voor en voeg deze toe aan celmonolagen op zeswellplaten voor een plaque-assay, na een incubatie van één uur bij 37 °C en 5% CO₂. Voeg twee tot vijf dagen na infectie een agarose-overlay toe.Plaques moeten duidelijk zichtbaar zijn. Idealiter produceert een van de platen tussen de 10 en 50 goed gescheiden plaques. Markeer de locatie van de plaques op de plaat met een stip met behulp van een marker; zorg er hierbij voor dat de overlays niet verschuiven of loskomen door voorzichtig een P 200 filtertip door de agarose-overlay te steken.Om de plaque te bereiken, tilt u de punt voorzichtig uit de overlay en brengt u de aros-plug over naar een microcentrifugebuis met 250 µL medium. Er zal een voldoende hoeveelheid virus worden overgedragen, ongeacht of de aros-plug uit de punt wordt bevrijd; vortex de buis en neem tot tien keer per behandeling op. Bewaar een deel van het monster om het levende virus later te amplificeren.Extraheer vervolgens het RNA uit het resterende deel van het monster en voer R-T-P-C-R uit om de plaque-sample te identificeren die de gewenste mutatie bevat. Sequence het cDNA. Controleer of er geen aanvullende mutaties aanwezig zijn.Maak vervolgens een grotere voorraad van dit virus voor alle daaropvolgende studies. Bevestig daarna de resistentie die door de geïdentificeerde mutatie wordt verleend. Herhaal de mutagenese-assay onder verschillende mutagene condities.Als de variant resistent is tegen meerdere mutagenen, heeft deze waarschijnlijk een verhoogde getrouwheid. Aangezien mutaties die de getrouwheid beïnvloeden in de polymerase gelokaliseerd zijn, is het belangrijk om te bevestigen dat de replicatiekinetiek niet significant is gewijzigd. Voordat de mutatiefrequenties worden bepaald, dient de replicatie te worden onderzocht via ten minste twee complementaire benaderingen.Bijvoorbeeld kan een methode die de virusproductie onderzoekt, zoals een plaque-assay of TCID 50, worden uitgevoerd in aanvulling op een methode die de RNA-synthese onderzoekt, zoals kwantitatieve R-T-P-C-R of een northern blot. Vervolgens worden de frequenties van getrouwheidsmutaties gemeten om te bevestigen dat de geïdentificeerde polymeraseverandering die resistentie tegen mutagenen verleent, de replicatie beïnvloedt. Dit kan worden uitgevoerd op zowel de levensvatbare als de totale viruspopulatie.Om de mutatiefrequenties van de totale viruspopulatie te bepalen, inclusief levensvatbare en niet-levensvatbare varianten, wordt het RNA geëxtraheerd en een regio van 800 tot 1.200 nucleotiden uit een coderende sequentie die bekend staat om genetische varianten, zoals die voor een structureel eiwit, via RT-PCR geamplificeerd. Vervolgens wordt het gezuiverde product voor elke te bestuderen viruspopulatie via topo TA-cloning gekloond. Selecteer 96 kolonies die door middel van blue-white screening op X-gal-gecoate platen zijn geïdentificeerd als positief voor een insert.Voer een single colony PCR uit om de validiteit van de blauw-wit screening te bevestigen. Op basis van de fragmentgrootte en de bovenstaande condities zou ongeveer 90% van de kolonies positief moeten zijn. Gebruik voor elke positieve witte kolonie een tandenstoker om elke kolonie over te brengen naar één milliliter LB-medium in een 96-wells plaat.Incubeer de bacteriële cultuurplaten overnacht bij 37 °C onder constant schudden. Isoleer de volgende dag het DNA door mini-preps voor te bereiden in een 96-well formaat en sequenceer elke plaat met voldoende primers om maximale dekking van het gekloonde segment te verkrijgen.Twee primers met een dekking van 600 basen zouden voldoende moeten zijn. Voer de sequentieanalyse uit met behulp van een referentie- of consensussequentie voor elke populatie en geschikte alignment-software die hier gemakkelijk enkelnucleotide-polymorfismen kan identificeren. Raadpleeg software van DNA star laser.Gene wordt eerst gebruikt om sequenties van slechte kwaliteit te verwijderen, zoals sequenties met foutieve base calling, te veel uiteinden of sequenties met een te korte lengte. Lijn de resterende sequenties uit. Identificeer het nucleotidebereik dat door alle sequenties in de analyse wordt gedekt.Verwerp klonen die niet volledig gedekt zijn over deze regio. Om vergelijkingsredenen is het essentieel dat dezelfde regio volledig gedekt is. Identificeer en tel de enkelnucleotidepolymorfismen die verschillen van de referentiestam.Bereken de mutatiefrequentie door het totaal aantal enkelvoudige nucleotidepolymorfismen te delen door het totaal aantal gesequentieerde nucleotiden. Presenteer dit getal als het gemiddelde aantal mutaties per 10.000 gesequentieerde nucleotiden. Indien hetzelfde enkelvoudige nucleotidepolymorfisme voorkomt in een groot aantal klonen, presenteer dan twee waarden: één inclusief en één exclusief deze herhaalde mutaties.Bepaal de mutatieverdeling. Maak een gerangschikte lijst van het aantal klonen in elke populatie dat 0, 1, 2, 3 enzovoort mutaties vertoont. Mutaties in de gesequentieerde regio als optie.Gebruik de bewerkte sequenties om alle mogelijke paarsgewijze vergelijkingen binnen een monster te berekenen om gemiddelde waarden van de populatiediversiteit te verkrijgen. Hiervoor zijn verschillende alignment-programma's beschikbaar. Het programma voor moleculaire evolutionaire genetica-analyse, ook wel mega genoemd, wordt gebruikt om de optimale condities te bepalen voor de selectie van RNA-mutageenresistentie.Onze cellen werden behandeld met toenemende concentraties ribovirine en geïnfecteerd met wild-type Cox AKI B virus met een multipliciteit van infectie van 0,0 1 48 uur na infectie. Het nakomstvirus werd geoogst en de titers werden bepaald via TCID₅₀. Deze figuur geeft het percentage cellen aan dat de behandeling heeft overleefd, onderaan de x-as aangegeven, bepaald door trypaanblauw-kleuring 48 uur na infectie.De resultaten laten zien dat concentraties van 100 en 200 micromolair de virustiter met één tot twee log verminderen zonder de celviabiliteit te beïnvloeden. Om mutagen-resistente populaties te selecteren, werd het CHI-gangavirus gekweekt in hilar-cellen in aanwezigheid van (grijze balken) of afwezigheid van (zwarte balken) 50 micromolair ribavirine; na elke passage werd het nakomelingenvirus gekwantificeerd via een klassieke plaque-assay op BHK-cellen, zoals hier te zien is. Het mutagene effect is duidelijk tijdens de eerste passages, waarbij de behandelde virustiter met twee log daalde.Geleidelijk keerde de titers terug naar normale, onbehandelde niveaus. Er zijn geen significante verschillen waargenomen in vijf met mutagenen behandelde populaties vergeleken met onbehandelde populaties, wat suggereert dat resistente varianten zijn geselecteerd. Sequencing identificeerde inderdaad unieke mutaties in de viruspopulatie die een ribovirin-behandeling onderging om brede resistentie tegen RNA-mutagenen van verschillende structuren te bevestigen; de high-fidelity A 3 72 V variant van COA virus B three, die aanvankelijk bij de screening was geïsoleerd, werd getest op verminderde gevoeligheid voor verschillende concentraties van de RNA-mutagenen RIBOVIRIN, vijf-fluorouracil en vijf-azacitidine.Hiermee werden onze cellen behandeld met de aangegeven concentraties ribavirine en geïnfecteerd met wild-type Cox AKI-virus B drie bij een multipliciteit van infectie van 0,01. 48 uur na infectie werd het nakomelingenvirus geoogst en werden de titers bepaald via TCID₅₀. Hier worden de titers van het wild-type en een A372-variant weergegeven als functie van de mutageenconcentratie. A372V vertoonde consequent hogere titers dan het wild-type.Onder alle geteste condities om de groeikinetiek van de virusproductie in één stap te bepalen, werden onze cellen geïnfecteerd met een multipliciteit van infectie van 10 met óf het wildtype, de high-fidelity variant A 3 72 V, óf de replicatiedeficiënte variant CX 64 van het Cox AKI virus B drie. Op de aangegeven tijdstippen werd virusnageslacht geoogst uit cellen en supernatanten door middel van vries-dooi cycli en getitreerd via TCID₅₀. De toename in getrouwheid van A 3 72 V gaat niet gepaard met een waarneembaar replicatiedefect in weefselkweek. De variant CX 64 vertoont een aanzienlijke vertraging in de replicatiekinetiek en bereikt maximale titers die 1000 maal lager zijn dan die van het wildtypevirus.Met de in deze video beschreven aanpak is elke gesequentiede kloon afkomstig van een uniek genoom binnen de totale viruspopulatie en draagt deze dus unieke mutaties. Deze figuur toont een typische alignment na het opschonen van sequenties van slechte kwaliteit en de visualisatie van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen. De totale hoeveelheid enkelvoudige nucleotidepolymorfismen binnen een populatie is geteld en het aantal enkelvoudige nucleotidepolymorfismen dat in elke kloon voorkomt is genoteerd.Bijvoorbeeld, de kloon die is onderstreept met een balk bevat twee unieke mutaties, terwijl acht andere klonen een enkele unieke mutatie bevatten. Deze gegevens worden gebruikt om een tabel op te stellen, zoals de hier getoonde tabel. De tabel toont de gerangschikte distributie van gesequentieerde klonen op basis van het aantal mutaties.Een statistische vergelijking van gerangschikte waarden kan bepalen of de ene distributie significant verschilt van de andere. Voor een eenvoudigere interpretatie kunnen de numerieke gegevens uit de sequentie- en statistische analyse worden weergegeven als een grafiek of histogram. Zoals hier is te zien, genereert het A 3 72 V-virus minder mutaties dan het wildtype en vertoont het een significant lagere mutatiefrequentie met een P-waarde van minder dan 0,01.Dezelfde populatie van het chicken ganga-virus geeft vergelijkbare mutatiefrequenties, ongeacht of de virusstock of een verdunning van 10⁵ wordt gebruikt voor RNA-extractie. Na het volgen van deze procedure kunt u in vitro biochemische assays of kristallisatieonderzoeken uitvoeren om de mechanistische en structurele basis van de getrouwheid in deze polymerasevariant beter te begrijpen.Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de biologie om de correlatie tussen genetische diversiteit en de fitness van virussen in vivo te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de kansen op het isoleren van fidelity-varianten van RNA-virussen kunt vergroten en hoe u mutatiefrequenties kunt gebruiken om deze verschillen in fidelity te identificeren.

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

We bieden een nieuwe strategie om virale replicatiecompartimenten (RC) te isoleren van adenovirus (Ad)-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze aanpak vertegenwoordigt een celvrij systeem dat kan helpen om de moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en -expressie reguleren, evenals de regulatie van virale-gastheerinteracties die in het RC worden gevestigd, te verduidelijken.

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Dit protocol beschrijft een snelle en breed toepasbare methode voor onbevooroordeelde RNA-sequencing van virale monsters van humane klinische isolaten.

Onpartijdige Deep Sequencing van RNA-virussen uit klinische monsters

Hier presenteren we twee protocollen, één voor het meten van de specifieke groeisnelheid en de andere voor het vermogen van de cel-bindende van rotavirus met behulp van de plaque assay en RT-qPCR. Deze protocollen zijn beschikbaar voor het bevestigen van de verschillen in fenotypen rotavirus stammen.

Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Leer een geoptimaliseerde methode om RNA-virusfidelityvarianten te isoleren en te karakteriseren via mutagenese en sequencen. Deze techniek helpt onderzoekers polymerasefouten en virale evolutie te begrijpen.

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

Meer video's verkennen