Name: 发展的细胞类型特异性的抗艾滋病毒gp120基因的siRNA传递适配 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 了解利用硝酸纤维素膜SELEX技术筛选靶向HIV-1 gp120的高亲和力RNA适配体的方法。本研究通过12轮迭代选择获得纳摩尔级结合活性的适配体，并构建适配体-siRNA嵌合体用于细胞特异性抗HIV治疗。

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感谢Britta Hoehn、Guihua Sun、Harris Soifer和Lisa Scherer的有益讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）授予J.J.R.的资助项目AI29329和HL07470的支持。以下试剂通过美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）、艾滋病研究部（Division of AIDS, NIAID, NIH）获得：CHO-EE和CHO-gp160细胞系；pNL4-3 luc载体；来自DAIDS、NIAID的HIV-1BaL gp120。

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
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<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
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<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R 和 J. Z. 拥有一项关于“细胞类型特异性适配体-siRNA 递送系统用于 HIV-1 治疗”的待批专利。美国专利商标局，编号 12/328994，公开日期：2009 年 6 月 11 日。

适配体是 体外 经过进化而形成的核酸，能够形成特定且稳定的三维结构，从而对靶向分子实现高度特异性的紧密结合8低纳摩尔级别的结合亲和力以及对靶标的高度特异性，使适配体成为诊断学中的多功能工具， 体内 成像与治疗9随着适体技术在靶向siRNA递送中的出现，现在可以利用适体的结合功能实现受体介导的siRNA内吞作用。10-12针对膜受体筛选获得的适配体已作为一种有前景的递送载体，能够以细胞类型特异性的方式靶向特定疾病或组织13，这可以增强药物的治疗效果，同时减少不必要的毒性副作用。
迄今为止，通过传统的纯化膜蛋白SELEX或全细胞SELEX技术，已成功分离并表征了越来越多能够靶向特定细胞类型或恶性细胞亚群的适配体。然而，在使用重组蛋白进行筛选时，由于目标受体种类不可获得、天然状态不稳定或存在复杂的生化与物理性质等问题，高效生成新的细胞特异性归巢适配体仍面临关键挑战。因此，细胞SELEX为获得可特异性结合特定靶细胞群体的适配体提供了一种替代策略。然而，人们注意到死细胞...

<table><tbody><tr><td>MF-Millipore 膜滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>孔径 0.45 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td>13 mm 直径</td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>DNA纯化</td></tr><tr><td>Microcon YM-30 柱</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>RNA浓度</td></tr><tr><td>Bio-spin 30 柱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>732-6250</td><td>RNA纯化</td></tr><tr><td>Taq PCR DNA聚合酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScript RT-PCR 系统</td><td>Invitrogen</td><td>11146-024</td><td></td></tr><tr><td>DuraScribe T7 转录试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>DS010925</td><td></td></tr><tr><td>PCR用dNTP</td><td>罗氏集团</td><td>1 581 295</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸，来自大肠杆菌的转移RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>tRNA 竞争物</td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;Ba-L&lt;/sub&gt; gp120蛋白</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>4961</td><td>靶蛋白</td></tr><tr><td>Silencer siRNA 标记试剂盒 - Cy3</td><td>Ambion</td><td>1632</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚/氯仿 5/1 溶液（pH 4.5）</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>氯仿/异丙醇 24/1 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶（CIP）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>罗氏集团</td><td>10 901 393 001</td><td>RNA沉淀</td></tr><tr><td>Gamma-P&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;-ATP</td><td>MP Biomedicals</td><td>013502002</td><td>放射性</td></tr><tr><td>40% AccuGel 19:1</td><td>国家诊断公司</td><td>EC-850</td><td></td></tr><tr><td>10xTBE</td><td>国家诊断公司</td><td>EC-860</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N,N&amp;rsquo;- 四甲基乙二胺（TMEMD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸亚砜亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5379-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>7.5% w/v 碳酸氢钠溶液</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）（10'）</td><td>Invitrogen</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（100倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>TA 克隆试剂盒（含 pCR 2.1） </td><td>Invitrogen</td><td>K2040-01</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞类型特异性抗hiv gp120适配体的开发及其用于sirna递送

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

艾滋病病毒（HIV）感染的全球流行使得开发新型抗逆转录病毒药物变得尤为紧迫。小干扰RNA（siRNA）能够有效抑制互补RNA转录本的表达，这一特性正被开发为治疗包括艾滋病在内的多种疾病的一类新型治疗手段。以往许多研究已表明，基于RNA干扰（RNAi）的抗HIV/AIDS治疗策略具有广阔的应用前景；然而，siRNA在治疗应用及临床转化中的一个关键障碍是其递送效率。特别是考虑到RNAi疗法的安全性与有效性，开发一种能够靶向特定细胞群体或组织的细胞内siRNA递送方法显得尤为重要。HIV-1的gp120蛋白是存在于病毒表面的一种糖蛋白包膜成分，在病毒进入CD4细胞的过程中发挥关键作用。gp120与CD4受体的相互作用可触发HIV-1进入细胞并启动细胞融合，该过程已被证实为药物研发中具有临床相关性的抗病毒策略靶点。
本文首先讨论2'-F修饰的抗HIV gp120 RNA适体的筛选与鉴定。采用传统的硝酸纤维素膜筛选（SELEX）方法，从一个包含50个随机核苷酸的RNA文库中分离出多个具有纳摩尔亲和力的新适体。为了成功获得亲和力更高的结合物种，通过精确调控筛选条件以严格控制筛选的严谨性。所筛选出的适体能够特异性结合并快速被表达HIV-1包膜蛋白的细胞内化。此外，这些适体本身即可中和HIV-1的感染性。基于最优适体A-1，我们还构建了一种新型的双功能抑制性抗gp120适体-siRNA嵌合体，其中适体部分和siRNA部分均具有强效的抗HIV活性。进一步地，我们利用gp120适体-siRNA嵌合体实现将siRNA特异性递送至HIV-1感染的特定细胞类型。这种双功能嵌合体在联合应用多种核酸治疗剂（适体与siRNA）以抑制HIV-1感染方面展现出巨大潜力，使适体-siRNA嵌合体成为对高效抗逆转录病毒治疗（HAART）失败患者极具吸引力的治疗候选方案。

通过RNA文库筛选分离出多个针对HIV-1Ba-L gp120、具有纳摩尔亲和力的2’-氟代RNA适配体 体外 SELEX 流程。一种新型双抑制功能抗 gp120 适配体-siRNA 嵌合体被成功构建，在全身性抗 HIV 治疗中展现出显著潜力。

细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

由艾滋病毒感染引发的全球性流行病使得开发新型抗逆转录病毒药物变得尤为紧迫。小干扰RNA（small interfering RNA）强大的基因沉默能力……

以下实验的总体目标是利用硝酸纤维素膜，在体外生成针对HIV-1 GP120蛋白的RNA适配体。该过程通过PCR及随后的体外T7转录实现。为准备初始DNA和随机RNA文库，第二步是将目标蛋白与RNA文库的混合物加至预先润湿的硝酸纤维素滤膜上，从而分离出与蛋白结合的RNA分子和未结合的RNA组分。经过12轮筛选循环后，对RNA文库进行克隆和测序，以从文库中鉴定出单个RNA适配体候选序列。实验结果鉴定出多个具有纳摩尔亲和力的新型适配体，该结论基于凝胶迁移实验和共聚焦显微镜分析得出。该技术相较于现有的方法（如磁珠或柱层析分离方法）主要优势在于操作简便，且无需对蛋白质或文库进行预处理，例如无需将蛋白质固定在磁珠上。用于分离抗HIV gp120 RNA适配体的RNA文库，是由商业合成的DNA文库制备而来，该DNA文库包含50个核苷酸长度的随机序列。单链DNA寡核苷酸文库序列长度为81个核苷酸。如图所示，随机区域两侧为恒定区域，5'端为30个T，3'端为16个MA。恒定区域包含用于体外转录的T7启动子以及用于RT-PCR的3'端标签。通过PCR扩增单链DNA寡核苷酸随机文库，PCR循环数限制在10个循环以内，以保持原始DNA文库的丰度。PCR反应完成后，使用凝胶回收试剂盒回收扩增得到的双链DNA文库。随后，根据试剂盒制造商提供的说明书，利用cript试剂盒将双链DNA转化为RNA文库，在转录反应体系中用两种氟代嘧啶核苷酸（2'-F-CTP和2'-F-UTP）分别替代CTP和UTP，从而生成对核糖核酸酶具有抗性的RNA。转录反应完成后，使用DS一消化反应体系以去除模板DNA，并通过8%聚丙烯酰胺、7摩尔尿素凝胶进行纯化。最后，通过紫外光谱法对纯化的RNA文库进行定量。在进行最优序列筛选之前，配制所需的缓冲液并将其储存于适当的温度条件下。将缓冲液在室温下保存，并将用于RNA复性及RNA结合的缓冲液置于负20摄氏度保存。在开始第一轮筛选前，将随机RNA文库在室温下预孵育于经预润湿的硝酸纤维素滤膜上30分钟，以最大限度减少与滤膜的非特异性结合。30分钟后，移除硝酸纤维素滤膜。将预清除的随机RNA文库与HIV one bowel GP one 20蛋白在低盐RNA结合缓冲液中混合，于室温下在旋转平台上孵育30分钟。接着，将反应液通过预先润湿的硝酸纤维素滤膜，并用1毫升低盐RNA结合缓冲液洗涤，以洗脱滤膜上结合的RNA。从滤器支架中取出硝酸纤维素膜。向膜中加入 200 µL 洗脱缓冲液，在 95 °C 下加热 5 分钟。RNA 从滤膜洗脱后，短暂离心，将 RNA 溶液转移至新管中，并对洗脱液进行苯酚-氯仿抽提。使用 MicroCon YM 30 柱浓缩 RNA，并用 20 µL 无 RNase 水洗脱回收的 RNA。回收的RNA文库随后进行逆转录，并进行15个循环的PCR扩增。将扩增

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

发展的细胞类型特异性的抗艾滋病毒gp120基因的siRNA传递适配

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1...

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

在此，我们介绍一种用于构建原理验证型二价腺病毒5型（Ad5）载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的实验方案。6 通过利用抗原衣壳整合策略，该载体被证明具有良好的适应性，并能够逃逸Ad5阳性血清的中和作用...

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。...

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

通过流式细胞术结合单细胞PCR与克隆技术，BSelex方法可用于从人外周血单个核细胞中鉴定并回收特异性抗原抗体。...

从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

抗体的糖基化模式决定了其临床表现，因此工业界和学术界一直在努力控制糖基化过程。由于典型的糖基工程实验耗时且劳动密集，建立一种通过瞬时沉默技术快速表征糖基化相关基因影响的实验方案将具有重要意义。...

中国仓鼠卵巢细胞中快速抗体糖工程改造

我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选仅结合具有感染性的病毒、而不结合因消毒方法而失去感染性的病毒或其他类似病毒的适配体。这为在便携式快速检测中确定病毒的感染状态提供了可能。...

体外筛选适配体以区分感染性与非感染性病毒

了解利用硝酸纤维素膜SELEX技术筛选靶向HIV-1 gp120的高亲和力RNA适配体的方法。本研究通过12轮迭代选择获得纳摩尔级结合活性的适配体，并构建适配体-siRNA嵌合体用于细胞特异性抗HIV治疗。

细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

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