细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

以下实验的总体目标是利用硝酸纤维素膜，在体外生成针对HIV-1 GP120蛋白的RNA适配体。该过程通过PCR及随后的体外T7转录实现。为准备初始DNA和随机RNA文库，第二步是将目标蛋白与RNA文库的混合物加至预先润湿的硝酸纤维素滤膜上，从而分离出与蛋白结合的RNA分子和未结合的RNA组分。

经过12轮筛选循环后，对RNA文库进行克隆和测序，以从文库中鉴定出单个RNA适配体候选序列。实验结果鉴定出多个具有纳摩尔亲和力的新型适配体，该结论基于凝胶迁移实验和共聚焦显微镜分析得出。该技术相较于现有的方法（如磁珠或柱层析分离方法）主要优势在于操作简便，且无需对蛋白质或文库进行预处理，例如无需将蛋白质固定在磁珠上。用于分离抗HIV gp120 RNA适配体的RNA文库，是由商业合成的DNA文库制备而来，该DNA文库包含50个核苷酸长度的随机序列。

单链DNA寡核苷酸文库序列长度为81个核苷酸。如图所示，随机区域两侧为恒定区域，5'端为30个T，3'端为16个MA。恒定区域包含用于体外转录的T7启动子以及用于RT-PCR的3'端标签。

通过PCR扩增单链DNA寡核苷酸随机文库，PCR循环数限制在10个循环以内，以保持原始DNA文库的丰度。PCR反应完成后，使用凝胶回收试剂盒回收扩增得到的双链DNA文库。随后，根据试剂盒制造商提供的说明书，利用cript试剂盒将双链DNA转化为RNA文库，在转录反应体系中用两种氟代嘧啶核苷酸（2'-F-CTP和2'-F-UTP）分别替代CTP和UTP，从而生成对核糖核酸酶具有抗性的RNA。

转录反应完成后，使用DS一消化反应体系以去除模板DNA，并通过8%聚丙烯酰胺、7摩尔尿素凝胶进行纯化。最后，通过紫外光谱法对纯化的RNA文库进行定量。在进行最优序列筛选之前，配制所需的缓冲液并将其储存于适当的温度条件下。

将缓冲液在室温下保存，并将用于RNA复性及RNA结合的缓冲液置于负20摄氏度保存。在开始第一轮筛选前，将随机RNA文库在室温下预孵育于经预润湿的硝酸纤维素滤膜上30分钟，以最大限度减少与滤膜的非特异性结合。30分钟后，移除硝酸纤维素滤膜。

将预清除的随机RNA文库与HIV one bowel GP one 20蛋白在低盐RNA结合缓冲液中混合，于室温下在旋转平台上孵育30分钟。接着，将反应液通过预先润湿的硝酸纤维素滤膜，并用1毫升低盐RNA结合缓冲液洗涤，以洗脱滤膜上结合的RNA。从滤器支架中取出硝酸纤维素膜。

向膜中加入 200 µL 洗脱缓冲液，在 95 °C 下加热 5 分钟。RNA 从滤膜洗脱后，短暂离心，将 RNA 溶液转移至新管中，并对洗脱液进行苯酚-氯仿抽提。使用 MicroCon YM 30 柱浓缩 RNA，并用 20 µL 无 RNase 水洗脱回收的 RNA。

回收的RNA文库随后进行逆转录，并进行15个循环的PCR扩增。将扩增后的双链文库纯化后，按照之前所述方法转录成新的RNA文库，以用于下一轮筛选。在1倍HBS缓冲液中将RNA文库重新折叠，95摄氏度加热3分钟，然后缓慢冷却至37摄氏度。

在37摄氏度下继续孵育10分钟。吸附复性的RNA，并在下一轮筛选前将其抽滤至硝酸纤维素膜上，持续30分钟，随后与靶标HIV肠GP120蛋白进行孵育。为了成功获得具有更高结合亲和力的适体，必须通过调整筛选条件来严格控制筛选的严谨性。

筛选条件如本表所示。在cellex第一至第四轮中，将预清除的RNA文库与靶蛋白在低盐RNA结合缓冲液中孵育30分钟。在第四轮cellex之后，随着cellex的进行，使用高盐RNA结合缓冲液。

通过减少GP120蛋白的用量并增加竞争性酵母tRNA的浓度，以提高每轮适配体筛选的筛选严格性。HIV-1 GP120适配体筛选的进展通过滤膜结合实验进行监测。在本视频中，将对经过全部筛选循环后收集的12个RNA文库进行检测。

首先，通过在37摄氏度下用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理每种RNA样本一小时，去除起始的5'三磷酸基团。为准备用T4多聚核苷酸激酶和P32进行标记，将CIP处理后的RNA在95摄氏度下加热5分钟，随后置于冰上冷却。RNA标记步骤在专用于放射性实验的热室中进行，反应体系包含PNK缓冲液、T4多聚核苷酸激酶、1微升γ-P32标记的ATP以及加水至20微升的总体积。在37摄氏度下孵育30分钟。

30分钟后，向每个反应体系中加入20微升水，并通过G-50柱进行纯化。最后获得40微升标记的RNA，其终浓度为250纳摩尔。将每份标记的RNA样品在1倍HBS缓冲液中于95摄氏度加热3分钟使其变性。随后缓慢冷却至37摄氏度，此过程需要30至40分钟。

在 37 摄氏度继续孵育 10 分钟。当 RNA 群体完成重折叠后，进行 100 微升结合反应。将末端标记的 RNA 群体与 GP one 20 蛋白以及十倍摩尔过量的非特异性竞争性 tRNA 在高盐 RNA 结合缓冲液中混合，于室温孵育 30 分钟。

30 分钟结束后，用预先润湿的硝酸纤维素滤膜分离 50 微升结合反应液。随后用 2 毫升结合缓冲液洗涤滤膜，并使用多功能闪烁计数器对滤膜上保留的放射活性进行计数，作为输入对照计数。同时，对剩余的 50 微升结合反应液，在每轮筛选后的 RNA 文库结合实验中，采用含竞争性 tRNA 的滤膜结合实验分析，以监测 HIV-1 GP120 的筛选进展。

Optima的选择性结合活性计算为蛋白-RNA复合物中保留在滤膜上的输入RNA百分比，如图所示。起始RNA文库仅有0.1%的输入RNA保留在膜上。然而，经过九轮筛选后，第九轮RNA文库中有9.72%的输入RNA被结合。

尽管进行了额外的筛选轮次，但未观察到进一步的富集，表明RNA文库与目标蛋白的结合已达到饱和。通过凝胶迁移实验进一步验证了这些RNA文库的结合活性。结果表明，在这些RNA文库中，针对目标蛋白具有高结合特异性的部分配体已被成功富集。

在此示例中，第12轮RNA文库显示出最高的结合活性，因为经过第12轮筛选后，RNA文库的结合能力已达到最大值。该RNA文库被逆转录为cDNA，随后通过PCR进行扩增。PCR产物经纯化后克隆至TA克隆载体中，并在比对140个克隆后进行测序。共鉴定出六组抗GP120适配体。

本表中仅列出了Aptima核心区域的随机序列。约40%的克隆含有保守序列。从每组中选择一条代表性序列进行进一步表征，选择依据为其在组内的相对丰度，通过天然凝胶迁移率偏移实验测定这些代表性适体的解离常数KD，例如A one。

这些抗体中最佳者的表观KD值为52纳摩尔。如图所示，所筛选出的抗体可选择性地结合靶标HIV-1包膜GP120，但不结合H-I-V-GP120 CM蛋白。CHO-G160细胞为稳定表达HIV包膜糖蛋白GP160的细胞系，用于检测所选抗GP120抗体的结合与内化能力。

这些细胞由于缺乏编码衣壳蛋白酶（gag encoded proteases），无法将GP160加工为GP120和G41。流式细胞术分析显示，S3标记的适配体（abers）特异性结合CHO GP160细胞，而不结合不表达GP160的CHO EE对照细胞。此外，实时活细胞Z轴共聚焦显微镜观察表明，在孵育两小时后，S3标记的适配体（aptima）被CHO GP160细胞选择性内化，而CHO EE对照细胞则无此现象。此外还观察到，该适配体在细胞质内发生聚集，提示GP120适配体可能通过受体介导的胞吞作用进入细胞。

最后，在观看本视频后，您应充分了解如何使用基于现场的方法来分离RNA病毒颗粒。