高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本实验的总体目标是改变神经元胚胎中枢神经系统中的基因表达。首先获取特定妊娠阶段的雌性动物并为其进行手术准备。随后通过腹部切口暴露子宫角。

暴露胚胎后，将DNA注射至侧脑室、第三脑室或视网膜下腔。该操作的最后一步是通过子宫壁对胚胎施加电流传导，调整电极板的方向，使正极位于转染目标区域的上方。最终，可通过免疫荧光显微镜观察到神经前体细胞在端脑和视网膜中的增殖、迁移与分化结果。

与现有的方法（如转基因小鼠的退化模型）相比，该技术的主要优势在于其快速、能够实现高通量研究，并且成本较低。该方法有助于回答神经发育领域中的一些关键问题，例如哪些基因调控神经前体细胞的增殖、细胞命运决定、神经元分化以及细胞迁移。该技术的意义不仅在于增进对中枢神经系统发育的理解，还可能进一步揭示导致中枢神经系统发育缺陷的遗传通路，其中许多缺陷会导致人类的认知障碍和行为异常。

该技术还可应用于其他器官系统，例如发育中的周围神经系统、心脏和胎盘。它也可用于研究小鼠以及其他模式生物（如鸡和非洲爪蟾）的疾病模型。通常，初次使用该技术的研究人员面临的主要障碍是胚胎存活问题；在操作、注射和浇注胚胎时必须格外小心。

我们最初需要一种快速调控胚胎端脑和视网膜中基因表达的方法，由此提出了本方法的设想。我们在实验室中通过改进Sal于2001年在《发育生物学》（Developmental Biology）期刊上首次描述的技术，建立了这一实验技术。此外，我们还与一个合作实验室合作，将该方案成功应用于发育中的dilon。

该方法的可视化演示至关重要，因为注射和电穿孔步骤较难掌握，需要对胚胎进行极为精细的操作，且有时注射部位非常微小，例如视网膜下腔。今天将由谢尔曼实验室的博士后研究员 Rajiv 演示该操作流程。首先，清洁并灭菌所有手术器械。接着，用生理盐水和乳酸林格液填充注射器，并将其放置在手术区域的加热垫上预热。

用70%乙醇对加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌的柔软纱布垫。将加热垫温度设置为37摄氏度。将动物放入小型麻醉室中，通过蒸发器以每分钟1升的流速输送5%异氟烷与氧气的混合气体，进行麻醉。

务必使用捕获系统收集异氟烷氟气的废气。当动物呼吸深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眼睑反射进行检测。

为确保完全麻醉，将麻醉后的动物俯卧放置，并使用呼吸机管在手术期间输送2.25%的氟烷。在颈部背侧皮下注射浓度为每公斤体重0.1毫克的丁丙诺啡。

继续监测动物的呼吸，并根据需要调整异氟烷的流量。然后用胶带固定麻醉动物的胸部，并用钝头镊子夹捏后肢足部，再次检查是否存在缩足反应。使用无菌棉签，在腹部涂抹一层厚厚的脱毛膏，确保将底层的毛发完全覆盖。

将脱毛膏保留约三分钟，并间歇检查脱毛效果。使用无菌棉签，以无菌水浸湿无菌纱布块，擦拭腹部毛发。随后，用氯己定和更多的水对切口部位进行消毒。

用干净的无菌纱布擦干腹部。使用新的无菌棉纱，以70%乙醇重复此步骤。穿戴手术服，准备手术，以暴露子宫角。

首先，通过皮肤中线处皮下的浅色线条确定白线的位置。用镊子将皮肤从腹壁拉开，使用弯头镊子和剪刀，从腹部中段向下作一个小的直线切口。对腹膜重复此操作。用镊子夹住腹膜。

拉开后，再切开一个刚好足够将子宫拉出的切口。在切口上放置带有小垂直切口的无菌纱布，并用温热的无菌生理盐水浸湿。接着，将镊子滑入切口，用镊子固定切口并找到子宫。

在第二和第三可见胚胎之间夹住子宫，并将两侧的子宫角拉至纱布上。计数胚胎数量，记录任何吸收现象或体型较小的胚胎。为准备正确数量的DNA注射，用生理盐水润湿子宫角，并小心地将一侧子宫角放回腹腔内。

为了避免手术针头产生厌恶感，使用一支带有吹嘴的拉细毛细管，吸取10微升浓度为3毫克/毫升、含有甲基绿染料且无内毒素的DNA溶液，并将DNA溶液排入手术针头中。将第一支装填好的针头安装到显微操作器上。

从靠近卵巢的胚胎开始，将显微注射装置固定后依次操作。使用环形镊子轻轻转动胚体，使其面部朝前，以便沿ROS（视网膜-耳泡）至脊索方向进行注射。利用光纤光源识别胚胎脑部的中线位置。

注意前部区域两侧扩大的侧脑室。使用弯头镊子固定胚胎，并将装有液体的手术针置于子宫上方，使针头进入大脑的角度约为45度。以快速而稳定的动作转动显微操作仪上的旋钮，将针尖穿过子宫壁并插入胚胎脑的侧脑室。

接下来，踩下微量注射器的脚踏板。在注射DNA溶液时，可通过观察亚甲基绿染料扩散至胚胎脑室来轻松判断注射是否成功。完成DNA注射后，缓慢向上抽出针头，以避免造成组织损伤。

将注射后的胚胎置于无菌纱布上，并用温热的生理盐水充分润湿。用板状电极的正极夹住子宫，使其位于转染目标部位的上方。随后以每秒1次的频率，施加5次40至50伏、50毫秒的方波电脉冲。

用保护性湿纱布覆盖已注射并完成电穿孔的胚胎，然后继续注射下一个胚胎。当子宫角内所有目标胚胎均完成注射和电穿孔后，小心地将其推回体腔。取出第二个子宫角，开始对剩余胚胎进行注射和电穿孔。

当所有胚胎均已放回子宫后，向腹腔内加入2至3毫升温盐水，然后移除腹部的纱布，暴露出腹膜两侧。使用黑色编织丝线缝合腹膜，将缝线固定在靠近胸骨的腹膜处作为锚点，随后从锚点开始向外缝合。确保所有缝线均扎紧，且不要将任何深层器官或皮肤缝入腹膜中。

剪断并丢弃剩余缝线。使用皮肤缝合钉和镊子将皮肤拉拢覆盖于缝线处。钉合皮肤时需小心，避免将下方的缝线一并钉住，或过度牵拉皮肤。

完成操作后，使用缝合工具在此处轻轻按压，确保钉合紧密。在胚胎第12天（E12），已将一个表达GFP的双表达载体通过电穿孔技术导入发育中的新皮质。随着新皮质的发育，顶端前体细胞会分化为次级基底前体细胞或终末有丝分裂后的神经元，并持续表达GFP。随后可对这些神经细胞进行分析，检测其是否表达红色所示的特定神经亚型的典型标志物。

在此图中，于E12期进行电穿孔并在E14期解剖的胚胎前脑的腹侧观显示，至E14期时电穿孔部位可通过绿色表层荧光进行识别。在丘脑、前丘脑和下丘脑中均可见GFP表达，表明这些正在发育的脑区已成功转染。虚线框标示了穿过一个脑室区的切片位置。

对室管膜区的进一步观察显示，GFP标记的细胞从室管膜区迁移至套层区。在下丘脑核团将要形成的位置，胚胎视网膜也易于进行电转染，如E16.5冠状切面所示，该样本在E15.5时使用PCIC质粒进行了电穿孔。在此图中，mCherry阳性细胞的聚集特异性地位于外层神经母细胞层，而在节细胞层中Brn3b阳性的视网膜节细胞中则未见此现象。一旦掌握该技术，若无意外并发症，可在30分钟内完成操作。

在进行该操作时，重要的是要采用正确的无菌技术，在操作胚胎时保持手部稳定，并在将怀孕雌鼠置于麻醉状态之前准备好所有必要的材料。完成该操作后，电穿孔转染的胚胎可继续培育至成年，随后可通过行为学实验和功能检测等其他方法，进一步探究胚胎时期特定基因的操控对成年个体神经元功能的影响。自该技术建立以来，已为中枢神经系统发育领域的研究人员提供了在小鼠体内探索基因功能的重要途径。

观看本视频后，您应能充分理解如何将外源 DNA 导入胚胎神经管。具体而言，我们将向您展示如何准备妊娠雌性动物以进行手术，暴露子宫，向胚胎注射 DNA 并进行电穿孔。

请注意，操作异氟烷可能存在危险，因此在进行该操作时应采取预防措施，例如使用废气清除系统。