Name: 高效的基因传递到多个中枢神经系统使用新界在子宫内电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 了解子宫内电穿孔技术，实现胚胎中枢神经系统的高效基因传递。该方法通过DNA注射与电流应用，精准调控基因表达，用于研究神经前体细胞的增殖、迁移与分化，为神经发育研究提供可靠工具。

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作者谨此感谢 Eva Hadzimova、Pierre Mattar 和 Christopher Kovach 在 CS 实验室初步建立子宫内电穿孔技术过程中所做的工作。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP 44094）和 CIHR/防盲基金会（FFB）新兴团队基金（00933-000）资助 CS，DMK 获阿尔伯塔儿童医院研究基金会基金资助。RD 获加拿大卫生研究院加拿大希望奖学金支持，RC 获防盲基金会研究生奖学金支持，LML 获加拿大卫生研究院儿童遗传学与发育研究培训基金支持。

1. 设置
<ol>
	<li>按照图1A、A'所示设置手术区域。关键组件包括Eppendorf Femtojet显微注射仪、Narishige带持针器的显微操作器、Leica体视显微镜、光纤照明系统、ECM 830方波电穿孔系统及电极、加热垫以及异氟烷麻醉剂挥发器。</li> 
	<li>使用Metriclean2低泡沫溶液在Bransonic超声波清洗器中清洗所有手术器械，并通过高压灭菌法对器械进行灭菌。灭菌后的器械保存于Germex中。</li>
	<li>准备含有温热无菌生理盐水和无菌乳酸林格液的注射器。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>将动物放入一个小型（12 cm × 20 cm）麻醉室中。使用蒸发器以1 L/min的流速输送5%异氟烷麻醉剂和氧气（图1A，A'）。值得注意的是，必须使用废气清除系统收集异氟烷废气。</li>
	<li>当动物呼吸变得深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眨眼反射测试确认是否达到完全麻醉状态。</li>
	<li>将怀孕小鼠仰卧于加热垫（37°C）上。先用70%乙醇擦拭加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌无绒纱布垫。手术期间使用呼吸管和面罩装置输送异氟烷（2.25%）。</li>
	<li>在颈背部皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重）。</li>
	<li>整个手术过程中持续监测动物的呼吸，应保持深而规律。动物不应出现喘息、浅呼吸或快速呼吸。浅而快的呼吸可能提示麻醉过浅，应增加异氟烷流量；若动物开始喘息，则应减少异氟烷流量。如发生呼吸暂停，应立即关闭异氟烷，增加氧气流量直至动物恢复，随后以较低浓度重新开始异氟烷麻醉。</li>
</ol>
3. 手术动物准备
<ol>
	<li>将动物的前肢用胶带固定在加热垫上，并用钝头镊子夹捏后肢足部，再次检查回缩反应。</li>
	<li>使用无菌棉签，在腹部均匀涂抹一层较厚的脱毛膏（例如 Nair），用力涂抹以确保底层绒毛完全被覆盖。保持约三分钟，并间歇使用无菌清洁棉签检查脱毛效果。用无菌纱布蘸取无菌水擦拭腹部，直至完全清除残留物。随后使用氯己定（例如 Stanhexidine）皮肤清洁剂及更多无菌水重复清洁。最后用干净的无菌纱布将腹部擦干。</li>
	<li>先用氯己定（例如 Stanhexidine）对切口部位进行消毒，再用更多无菌水冲洗。用干净的无菌纱布将腹部擦干。随后使用70%乙醇和一支新的无菌棉签重复消毒步骤。</li>
	<li>将一块中央有切口的无菌纱布覆盖在腹部，手术过程中子宫角将由此切口拉出。</li>
</ol>
4. 切开并暴露子宫角
<ol>
	<li>为暴露子宫角，首先在皮肤中线处找到腹白线，即位于中线皮肤下的浅色线条。用镊子将皮肤从腹壁拉开，使用眼科剪沿腹部中线向下做一小段直线切口（长约1厘米）。</li>
	<li>使用弯头镊子和剪刀，对腹膜重复上述操作。</li>
	<li>将带有小垂直切口的无菌纱布覆盖于切口上，并用预热的无菌生理盐水润湿。</li>
	<li>将镊子滑入切口，找到子宫。用镊子撑开切口，同时将子宫角取出。</li>
	<li>在第一和第二个可见胚胎之间小心夹住子宫，将胚胎拉至纱布上。取出双侧子宫角，置于无菌纱布上，计数胚胎数量，并记录任何吸收中的胚胎或“不健康”胚胎（如体型较小者）。用生理盐水润湿子宫角，然后小心地将一半子宫还纳回腹腔内。</li>
</ol>
5. 向脑室注射 DNA
<ol>
	<li>使用 Sutter Flaming 微电极拉制仪和带有毛细管的硼硅酸盐玻璃微电极制备手术针（程序： 热=750，拉力=30，速度=90，时间=150）。使用无菌手术刀片，以45度角轻轻削去针尖。 </li>
	<li>为装填针头，将巴斯德吸管在火焰下拉制成细小直径。将吹管接至装填用吸管，以吸取约10 μl 将3 mg/ml无内毒素DNA与0.01%孔雀绿混合（注：孔雀绿染料可使DNA注射过程可视化）。将混合液吸入注射针后，将针固定在显微操作仪支架上，并连接至Femtojet显微注射仪。</li> 
	<li>从靠近卵巢的胚胎开始，使用环形镊子在蜕膜内轻轻转动胚胎，使其呈“面部朝前”位置，以便进行从头端到尾端方向的注射。使用光纤光源照明，以帮助观察胚胎脑的中线结构，该区域在头端部位两侧为较大的侧脑室所包围（图1B，B'）。</li> 
	<li>使用环形镊子固定胚胎。将注射针置于子宫上方，使其进入大脑的角度约为45度。通过显微操作器，以快速而稳定的动作将针尖穿过子宫壁并插入胚胎的侧脑室。注射方向分别指向侧脑室、第三脑室或视网膜下腔，以分别靶向端脑、间脑和视网膜。需要注意的是，在胚胎发育早期阶段，脑泡仍处于开放状态，因此注入侧脑室的DNA可流入第三脑室rd 心室</li>
	<li>踩下脚踏板，注射无内毒素的 DNA（1-3 μL使用 Eppendorf Femtojet 显微注射仪进行注射。成功的注射可通过甲基绿染料在胚胎脑室系统中的扩散而清晰观察到。随后缓慢撤出注射针，以避免针头断裂。</li>
</ol>
6. 电穿孔
<ol>
	<li>将已注射的胚胎（仍位于子宫内）放置于覆盖在母体腹部的无菌纱布上，并用预热的生理盐水充分润湿。请注意**：在膜表面添加生理盐水对于有效传导电流至关重要。</li>
	<li>在注射DNA后，使用GenePaddle电极夹住子宫。使用ECM8300 BTX电穿孔系统，以每秒一个脉冲的频率施加5次40–50 V、50 ms的方波电脉冲（图1C，C'）。</li>
	<li>用保护性湿纱布覆盖已注射/电穿孔的胚胎，然后继续处理下一个胚胎。</li>
	<li>完成所有目标胚胎的注射/电穿孔后，小心地将子宫角推回腹腔内（图1D）。</li>
	<li>小心取出另一侧子宫角，并从靠近卵巢的胚胎开始重复操作。</li>
</ol>
7. 缝合与钉合
<ol>
	<li>当所有胚胎均已放回子宫内后，在腹腔中加入约 2–3 ml 温热的生理盐水。</li>
	<li>关闭切口时，首先移除腹部的纱布，确认腹膜两侧边缘。使用黑色编织丝线缝合腹膜。不建议在此操作中使用可吸收缝线，因其通常强度较低，可能导致术后出血或感染。将缝线固定在靠近胸骨的腹膜处，并从此锚定点开始向远端连续缝合。确保所有缝线均紧密贴合，且未将深层器官或皮肤意外缝入腹膜中。剪除多余缝线并丢弃。</li>
	<li>用镊子将皮肤拉拢覆盖于缝合线处。使用 9 mm Reflex™ 皮肤闭合钉，将皮肤切口处钉合，注意避免将下方的缝合线一并钉入，或过度牵拉皮肤。推荐操作方法为：用镊子将皮肤轻轻提起并远离体壁，以 90 度角使用钉合器进行钉合。持续操作直至切口完全闭合（约三枚钉合钉）。完成后，用缝合器轻轻按压确保钉合钉牢固（图 1D'）。</li>
</ol>
8. 术后护理
<ol>
	<li>为监测麻醉恢复情况，将雌性动物俯卧位放置并关闭异氟烷。保持动物面部处于呼吸装置内，将氧气流量调至3%以促进麻醉恢复。应将动物置于加热垫上方的清洁干燥纱布垫上，以防低体温。</li>
	<li>在动物仍处于昏沉状态时，于其颈部皮肤下皮下注射2 mL林格氏液。</li> 
	<li>继续在氧气流下保持动物温暖数分钟，并加热纱布垫以促使其苏醒。随着动物恢复正常的呼吸模式，应可观察到短暂的活动。观察数分钟，直至动物表现出清醒和警觉状态。</li> 
	<li>用庆大霉素喷雾剂喷洒雌性动物腹部，并用无菌纱布包裹动物。</li>
	<li>将动物转移至含有高压灭菌垫料和纸板栖息盒的无菌笼具中。</li>
	<li>饮水瓶应彻底清洗、灭菌，并装入无菌水。在500 mL水中加入2 mL磺胺二甲嘧啶抗生素（25%储备液）。</li> 
	<li>术后次日早晨，按0.05 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺。</li>
	<li>术后前24小时内应密切监测雌性动物。若饲养时间超过24小时，则于第2天将雌性动物转移至新的无菌笼具中。</li> 
</ol>
9. 代表性结果
新皮质 
新皮层是中枢神经系统中负责视觉、感觉运动处理以及高级认知功能的区域。它由谷氨酸能投射神经元和GABA能中间神经元组成，分别起源于端脑的背侧和腹侧区域。为了研究不同基因在新皮层发育中的作用，我们采用 在子宫内 电穿孔法用于在端脑背侧或腹侧过表达或阻断不同基因的表达（例如，使用shRNA载体）1,3,4为了在胚胎端脑中实现基因的异位表达，我们采用了一种双顺反子表达载体（pCIG2），该载体包含CMV-βactin启动子-增强子以及内部核糖体进入位点（IRES）驱动的增强型绿色荧光蛋白（EGFP；位于pCIG2中）表达盒，使得转染细胞可通过落射荧光进行检测（图2A-C）。我们利用该技术在E11.5至E15.5期间将表达构建体导入端脑（图中数据为E12.5；图2）。通过在电穿孔后让胚胎继续发育数天，我们能够追踪GFP标记的前体细胞的分化与迁移过程。随着分化进程的推进，在电穿孔后3天，GFP+ 细胞从脑室区（vz）、脑室下区（svz）和中间区（iz）分化并迁移至皮层板（cp；图2C）。若在E12.5电转后24小时分析脑组织，可通过共标记顶端前体细胞标志物（如Pax6；图2A）、基底前体细胞标志物（如Tbr2；图2B）以及终末分裂的新皮层神经元标志物（如Tbr1；图2C），监测前体细胞成熟和神经元迁移的早期事件。
间脑
下丘脑位于中枢神经系统的腹侧基底部，作为内分泌系统与自主神经系统之间的门户发挥作用。在发育过程中，构成成熟下丘脑的多个核团均分化自一个共同的前体细胞区域，该区域位于胚胎间脑最腹侧的部分。目前，调控前体细胞增殖、神经元分化以及下丘脑核团形成的分子通路尚不明确。我们使用了 在子宫内 通过将DNA注入第3脑室，利用电穿孔技术将报告基因表达靶向至胚胎间脑rd E12胚胎的脑室。随后，我们在E14期追踪了GFP在分化神经元中的分布。通过该方法，我们成功将GFP表达靶向至丘脑、前丘脑和下丘脑（图3A）。冠状切片分析显示，我们已成功将GFP表达靶向至排列在第三脑室室管膜区的前体细胞rd 脑室以及迁移到套层区形成神经核团的神经元（图3B）
视网膜
视网膜是眼睛的神经层，负责将光子转化为电信号并传递至大脑。它起源于胚胎间脑的外突，因此源自神经管。神经视网膜由一个位于视网膜下腔（subretinal space）附近的顶端祖细胞区发育而来，该腔隙将眼球与头部间充质分隔开。因此，将DNA构建体靶向视网膜祖细胞时，需将注射精确注入一个很小的靶区域。借助显微操作仪，我们已成功在胚胎发育第13.5至15.5天（E13.5–E15.5）的胚胎中靶向该区域（图4显示的是E15.5胚胎中转入含mCherry报告基因的pCIC质粒后的电穿孔结果）。若在转染后24小时观察电穿孔的视网膜，可发现大多数mCherry+细胞位于外层神经母细胞层（onbl），即正在分裂的祖细胞所在的位置，而非位于视网膜神经节细胞层（gcl；插图），后者是终末分裂后细胞的分布区域。
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="通过显微注射和电穿孔在胚胎实验中进行基因编辑的显微手术装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 简介 在子宫内 电穿孔装置与方法 (A) 手术装置的关键组件包括 Eppendorf Femtojet 显微注射仪（1）、配有持针器的 Narishige 显微操作仪（2）、Leica 体视显微镜（3）、光纤照明系统（4）、ECM 830 方波电穿孔系统及电极（5）和加热垫（6）。(A') 使用异氟烷麻醉蒸发器对动物进行麻醉。(B,B') 简言之，麻醉后暴露子宫角，将混合了快绿染料的 DNA 注射至胚胎脑泡中。通过追踪快绿染料的扩散可判断注射是否成功（B'）。(C,C') DNA 成功注射后，将板状电极置于子宫两侧，调整胚胎位置，使 DNA 在电场作用下向正极方向迁移至目标脑区。(D,D') 完成所有目标胚胎的注射后，将子宫推回腹腔（D），缝合腹膜，并用钉皮器闭合皮肤（D'）。随后让怀孕母鼠恢复，于预定时间点收集电穿孔后的仔鼠。
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="带有Pax6/GFP、Tbr2/GFP、Tbr1/GFP标记物的背侧端脑室电转示意图，用于标记顶区、基底区祖细胞及神经元。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 背侧端脑电穿孔的代表性示例。 （A-C）在E12.5时进行电穿孔、E13.5时背侧端脑的冠状切面显微照片，所用质粒为pCIG2。对电穿孔后表达GFP+的细胞进行分析，检测其是否表达顶区祖细胞标志物（Pax6+，红色，A）、基底祖细胞标志物（Tbr2+，红色，B）以及终末分裂后神经元标志物（Tbr1+，红色，C）。cp，皮层板；svz，脑室下区；vz，脑室区。
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="显示胚胎脑切片 E12-E14 中 pCIG2 表达的神经科学示意图；荧光分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 间脑电穿孔的代表性示例。 (A) E12 时使用 pCIG2 进行电穿孔的 E14 胚胎脑腹侧观。GFP 表达荧光可见于丘脑、前丘脑和下丘脑，表明显微注射的 pCIG2 质粒在整个3个区域中的扩散情况rd 脑室。(B) 电穿孔脑组织冠状切面的显微照片，显示GFP标记细胞的迁移+ 细胞从室管膜区迁移至基底层区，下丘脑核团将在该区域形成。3V，第三脑室；T，丘脑；Hy，下丘脑；mz，基底层区；Tel，端脑；PreT，前丘脑；vz，室管膜区。
<img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="显示mCherry/Brn3b表达的视网膜发育荧光显微镜图像；E15.5至E16.5。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 视网膜电穿孔的代表性示例。 对E15.5时电穿孔pCIC质粒的E16.5胚胎眼球进行冠状切片，显示mCherry+细胞在外部神经母细胞层中聚集，而在节细胞层的Brn3b+视网膜节细胞中未见分布。插图为方框区域的高倍放大图像。gcl，视网膜节细胞层；le，晶状体；onbl，外部神经母细胞层；re，视网膜。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

在子宫内 电穿孔可用于分析多种发育过程。例如，转染报告基因（如GFP、mCherry或碱性磷酸酶）可用于谱系示踪和神经元迁移实验。 Alternatively，可瞬时表达Cre重组酶，以在空间和/或时间上可控的方式选择性消除floxed等位基因。此外，可通过电穿孔导入shRNA或显性负性构建体以敲低目标基因功能。最后，可在野生型和/或遗传突变小鼠品系中靶向过表达或异位表达关键基因，以研究细胞命运决定。该检测方法的高通量特性至关重要，因其可在极短时间内测试多种因子组合。需注意的是，该操作会导致针头穿刺部位周围细胞的基因表达发生变化（即损伤反应基因在伤口处上调；此现象已被我们及其他研究者观察到）。13因此，建议重点关注伤口部位以外的电穿孔细胞。此外，初学该技术时胚胎存活率较低，但随着操作熟练度提高，存活率会迅速上升 &gt;通过练习，成功率可达95%。迄今为止，我们已成功运用子宫内电穿孔技术鉴定了端脑中受神经前体bHLH转录因子调控的基因4我们还验证了该技术用于端脑顺式调控元件分析的可行性。3.

<table><tbody><tr><td>精细剪刀</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪，弯型</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 超细针持</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>环形镊，9毫米</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>眼科敷料镊</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 DMX 镊子</td><td>&lt;em&gt;手术工具&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 DMX 镊子</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>精细科学工具</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>组织镊-阿德森</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>反射式夹钳施加器</td><td>&lt;em&gt;手术器械&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500343</td><td></td></tr><tr><td>直径15 mm穿孔勺</td><td>&lt;em&gt;手术工具&lt;/em&gt;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>自动夹移除器</td><td>&lt;em&gt;手术工具&lt;/em&gt;</td><td>Mikron</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>丝线黑色编织缝合线</td><td>&lt;em&gt;手术工具&lt;/em&gt;</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871</td><td></td></tr><tr><td>反射式皮肤闭合不锈钢伤口钉</td><td>&lt;em&gt;手术工具&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500346</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 方波电穿孔系统</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>VWR 国际公司</td><td>58018-004</td><td></td></tr><tr><td>带可变间隙的镊子，2个圆形5毫米铂电极板</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>带可变间隙的镊子式电极 2个圆形7毫米铂电极板</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtojet 显微注射仪</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>VWR 国际</td><td>CA62111-488</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtojet 显微注射仪的脚踏控制</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>VWR国际</td><td>CAACCESS（其他）</td><td></td></tr><tr><td>Bransonic 超声波清洗机型号 1510R-DTH</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>VWR 国际公司</td><td>CA33995-534CPN-952-118</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P97 微电极拉制仪 </td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 -&amp;#8211; 外径：1 mm、内径：0.78 mm、长度 10 cm 的带丝硼硅酸盐玻璃管</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>三轴粗调操纵器</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>用于显微操作仪的磁力固定装置</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪用钢制底板</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器架 </td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器手柄</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5444</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>&lt;em&gt;仪器&lt;/em&gt;</td><td>徕卡显微系统</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂蒸发器</td><td>仪器</td><td>波特仪器公司</td><td>MODEL 100-F</td><td></td></tr><tr><td>Metriclean2 低泡沫超声清洗液，用于外科手术器械的超声清洗</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>Metrex Research Corporation</td><td>10-8100</td><td></td></tr><tr><td>缝合后使用含0.2 g亚甲蓝的庆大霉素40 mg/ml抗生素喷雾</td><td>&lt;em&gt;外科手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>用于手术器械灭菌的Germex</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>V&amp;eacute;辅酶Q10氢醌形式</td><td>DIN# 00141569</td><td></td></tr><tr><td>BNP 眼膏</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>V&amp;eacute;辅酶Q10氢醌形式</td><td>DIN# 00516414</td><td></td></tr><tr><td>Nair&amp;#174;</td><td>&lt;em&gt;外科手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>教会 &amp;amp; Dwight Co.</td><td>市售的</td><td></td></tr><tr><td>4% w/v 斯坦己定皮肤清洁剂</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>Omega Laboratories Inc.</td><td>01938983</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（Temgesic）镇痛剂</td><td>&lt;em&gt;外科手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>默克 &amp;amp; 公司</td><td>531-535</td><td></td></tr><tr><td>磺胺类药物 &quot;25&quot; 磺胺二甲嘧啶口服抗生素</td><td>&lt;em&gt;外科手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>专业兽医实验室</td><td>DIN# 00308218</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN# 0061085</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水 -&amp;#8211; 0.9% 氯化钠</td><td>&lt;em&gt;外科手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>B. Braun Medical</td><td>DIN# 01924303</td><td></td></tr><tr><td>吸入麻醉药&amp;#8211; Isoflurane USP</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>加拿大制药合作伙伴</td><td>DIN# 02237518</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>&lt;em&gt;手术试剂&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr></tbody></table>

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

操控基因表达的能力是现代实验胚胎学的基石，已促成多条发育通路的阐明。目前已有多种强大且成熟的技术可用于小鼠中基因表达水平的调控，从而构建基因功能缺失和功能获得的模型。然而，小鼠转基因模型的构建既昂贵又耗时。因此，人们广泛寻求其他替代性的基因操控方法。在体电穿孔是一种将基因导入活体小鼠胚胎的方法1,2，我们已成功对此进行了优化应用3,4。该方法主要借鉴了常用于鸡胚的在卵电穿孔技术的成功经验5。简而言之，将DNA注入发育中脑室的开放脑室腔内，通过施加电流在细胞膜上形成瞬时孔道，从而使DNA进入细胞。在我们的操作条件下，胚胎最早可在胚胎发育第11.5天（E11.5）高效地进行电穿孔；而对于更早期胚胎的靶向操作，则需要采用超声引导下的显微注射方案，如先前所述6。相反，由于顶骨和额骨开始分化，阻碍了对脑部的显微注射，因此E15.5是我们能够较容易实施电穿孔的最晚阶段。相比之下，视网膜在整个胚胎发育末期仍可接近并操作。胚胎可在胚胎期或出生后早期的任意时间点收集。注射报告基因载体有助于识别转染的细胞。
迄今为止，子宫内电穿孔技术已最广泛地用于新皮质发育的研究1,2,3,4近期的研究已将目标聚焦于胚胎视网膜7,8,9 和丘脑10,11,12. 这里我们介绍一种改良的 在子宫内 一种可轻松调整以靶向胚胎中枢神经系统不同区域的电穿孔方案。我们提供的证据表明，利用该技术可靶向胚胎端脑、间脑和视网膜。文中展示了代表性结果：首先显示了该技术用于将DNA表达载体导入侧脑室，使我们能够监测胚胎端脑中神经前体细胞的成熟、分化和迁移过程；我们还展示了该技术可用于将DNA靶向至围绕第三脑室的间脑区域rd 脑室，从而能够监测分化中的神经元向间脑核团迁移的路径。最后，我们展示了利用显微操作仪可将DNA构建体精确导入较小的靶区域，包括视网膜下腔，从而能够分析调控基因表达对视网膜发育的影响。

在子宫内 电穿孔技术可实现发育中中枢神经系统（CNS）基因递送的空间和时间精确控制。本文介绍一种高度可调的胚胎内电穿孔实验方案，可用于将表达载体递送至多个胚胎期CNS区域，包括端脑、间脑和视网膜。

操控基因表达的能力是现代实验胚胎学的基石，推动了多个发育过程的阐明……

本实验的总体目标是改变神经元胚胎中枢神经系统中的基因表达。首先获取特定孕龄的雌性小鼠并为其进行手术准备，随后通过腹部切口暴露子宫角。暴露胚胎后，将DNA注射至侧脑室、第三脑室或视网膜下腔。该操作的最后一步是通过子宫壁对胚胎施加电流传导，调整电极板的方向，使正极位于转染优先部位的上方。最终，可通过免疫荧光显微镜观察到神经前体细胞在端脑和视网膜中的增殖、迁移与分化结果。与现有的方法（如转基因小鼠的退化模型）相比，该技术的主要优势在于其速度快、通量更高且成本更低。该方法有助于回答神经发育领域中的一些关键问题，例如哪些基因调控神经前体细胞的增殖、细胞命运决定、神经元分化以及细胞迁移。该技术的意义不仅在于推动对中枢神经系统发育的理解，还可能进一步揭示导致中枢神经系统发育缺陷的遗传通路，其中许多缺陷会导致人类的认知障碍和行为异常。该技术还可应用于其他器官系统，例如发育中的周围神经系统、心脏和胎盘。它也可用于研究小鼠以及其他模式生物（如鸡和剑尾鱼）的疾病模型。通常，初学者在使用该技术时面临的主要障碍是胚胎存活问题；在操作、注射和浇注胚胎时必须格外小心。我们最初需要一种快速调控胚胎端脑和视网膜中基因表达的方法，由此产生了本方法的构想。我们在实验室中通过改进Sal于2001年在《发育生物学》（Developmental Biology）期刊上首次描述的技术，建立了这一实验技术。此外，我们还与一个合作实验室合作，将该方案成功应用于发育中的dilon。该方法的可视化演示至关重要，因为注射和电穿孔步骤较难掌握，需要对胚胎进行极为精细的操作，且有时注射部位非常微小，例如视网膜下腔。今天将由来自谢尔曼实验室的博士后研究员 Rajiv 演示该操作流程。首先，清洁并灭菌所有手术器械。接着，用生理盐水和乳酸林格液填充注射器，并将其放置在手术区域的加热垫上预热。用70%乙醇对加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌的柔软纱布垫。将加热垫温度设置为37摄氏度。将动物放入小型麻醉室中，通过蒸发器以每分钟1升的流速输送5%异氟烷与氧气混合气体，进行麻醉。务必使用捕获系统收集异氟烷氟气的废气。当动物呼吸深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眼睑反射进行检测。为确保完全麻醉，将麻醉后的动物俯卧放置，并使用呼吸机管在手术期间输送2.25%的氟烷。在颈部背侧皮下注射浓度为每公斤体重0.1毫克的丁丙诺啡。继续监测动物的呼吸，并在必要时调整异氟烷的流量。然后用胶带穿过麻醉动物的胸部，并用钝头镊子夹捏后肢足部，再次检查是否存在回缩反应。使用无菌棉签，在腹部涂抹一层厚厚的脱毛膏，确保将底层毛发完全覆盖。将脱毛膏保留约三分钟，并间歇检查脱毛效果。使用无菌棉签，以无菌水浸湿无菌纱布块，擦拭腹部毛发。随后，用氯己定和更多的水对切口部位进行消毒。用干净的无菌纱布擦干腹部。使用新的无菌棉纱布，以70%乙醇重复此步骤。穿戴手术

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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高效基因递送至中枢神经系统多个区域在子宫内电穿孔

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