Name: 成年鼠脑铸造三维成像和形态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习成年小鼠脑血管铸型技术，通过灌注、固定、脱水和透明化处理，实现脑血管树的三维可视化。该方法适用于明场显微镜、解剖显微镜和微型CT等多种成像分析。

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作者感谢 Voltaire Gungab 在手稿准备过程中提供的帮助。本工作部分由以下机构资助：美国国立卫生研究院（T32 GM008440 资助 E.J. Walker，R01 NS27713 资助 W.L. Young，P01 NS44155 资助 W.L. Young 和 H. Su，以及 R21 NS070153 资助 H. Su）；美国心脏协会（AHA 10GRNT3130004 资助 H. Su）。

1. 清除血管中的血液
<ol>
	<li>通过腹腔注射将100 mg/kg氯胺酮与10 mg/kg赛拉嗪溶于0.25 ml生理盐水中以麻醉小鼠。</li>
	<li>确认小鼠对足垫夹捏无反应后，使用剪刀在剑突下方沿胸部横向剪开，切开膈肌，并沿肋骨背侧与腹侧之间向上剪开，以暴露胸腔。将胸骨及邻近胸壁向上翻折，用止血钳固定，暴露心脏。用镊子打开心包膜，暴露心脏。</li>
	<li>启动连接于37°C水浴中预热的含肝素（5单位/ml）PBS溶液的灌注泵（压力100 mmHg），灌注管末端连接带有钝头22号针头的管路。</li>
	<li>将针头插入左心室心尖附近，立即剪开右心房以使全身血液流出，持续灌注冲洗直至血液完全从循环中清除。</li>
</ol>
2. 将铸型剂灌注至血管系统
<ol>
	<li>按照制造商的方案制备Microfil（Flow Tech, Inc. Carver, MA）灌注液：将5 ml MV稀释剂与4 ml过滤后的MV化合物混合。加入450μl（5%）催化剂（MV固化剂）。溶液的工作时间为20分钟，但应在使用前立即混合，以确保适当的黏度。</li>
	<li>用10 ml注射器抽取灌注液，将一根钝头20号针头连接到注射器上，并用溶液填充针头。</li>
	<li>通过先前用于冲洗血液的同一穿刺孔将针头插入左心室，并用止血钳夹住心脏固定针头位置。</li>
	<li>以约3 ml/min的速度缓慢将灌注液注入左心室。过高的压力可能导致灌注剂流动异常或血管破裂。</li>
	<li>观察灌注成功的迹象，包括：在肠和肝脏血管中可见灌注剂、远端肢体变色，以及鼻部和舌头变色。如有必要，调整针头位置以实现充分灌注。</li>
</ol>
3. 组织的采集与处理
<ol>
	<li>取出大脑并置于4°C条件下，用4%多聚甲醛固定过夜。</li>
	<li>将大脑从多聚甲醛中直接转移至室温下浓度逐渐增加的乙醇中进行脱水：25%乙醇，1天；50%乙醇，1天；75%乙醇，1天；95%乙醇，2天；100%乙醇，2天。</li>
	<li>将灌注后的大脑浸入水杨酸甲酯中，在室温下处理2天，以清除血管周围脑组织的浑浊。</li>
	<li>对未经切片且已澄清的完整大脑，可在水杨酸甲酯中将其置于解剖显微镜（图1）（Leica MZFL III显微镜，Leica Microsystems，Bannockburn，IL）或明场显微镜（图2）（Leica DM/LS，Leica Microsystems）下成像。</li>
	<li>若组织未完全透明，可进行再次澄清处理：将大脑从水杨酸甲酯转移至95%乙醇中2天，再转移至100%乙醇中2天，最后再次转移至水杨酸甲酯中2天。</li>
</ol>
4. 微型CT成像或组织学应用——组织制备
<ol>
	<li>可在透明化处理后或再水化后直接使用显微CT对脑组织进行成像（图4）。</li>
	<li>为进行组织学分析，需将脑组织通过梯度稀释的乙醇逐步再水化：100% 乙醇，1天；95% 乙醇，1天；75% 乙醇，1天；50% 乙醇，2天；25% 乙醇，2天；最后保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后可按照标准流程将脑组织包埋于石蜡中。</li>
</ol>
5. 代表性结果
血管铸型后，可在脑表面宏观观察到脑血管系统（图1A）。通过组织透明化处理，可观察到脑实质内部的血管树结构（图1B）。详细的血管结构可在明场显微镜下（图2）、解剖显微镜下（图3）以及微计算机断层扫描（micro-CT）中成像并分析（图4）。利用明场显微镜，无需切片即可在不同焦平面上观察血管系统（图2A），也可在更高放大倍数下观察单个微血管（图2B）。在解剖显微镜下，可在同一焦平面上观察完整的血管结构，从而更清晰地呈现脑血管系统的三维形态（图3）。解剖显微镜下拍摄的图像可展示大血管形态及全脑血管分布，但其细节分辨率不及明场显微镜成像（图2B）。该技术使我们能够在实验性脑动静脉畸形（BAVM）成年小鼠模型中检测到异常血管2。图5展示了通过微CT扫描（图5A）和明场显微镜（图5B）检测到相同异常血管的示例。综上，这些数据表明，在血管铸型后，可利用多种成像工具对同一样本进行分析。
<img alt="脑显微镜比较；图像A为正常脑，图像B为荧光染色显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 血管铸型后的小鼠全脑。甲基水杨酸酯溶剂透明化处理前（A）和处理后（B）。血管可在脑表面（A）以及透明化处理后的脑实质内（B）清晰可见。
<img alt="脑血管示意图、显微镜图像、血管网络观察、脑部研究。" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 透明化处理后脑组织血管铸型的明场显微镜图像。脑组织可在不同层面和放大倍数下成像。比例尺：200μm（A）和50μm（B）。
<img alt="小鼠脑血管示意图，用于解剖学研究的脑血管分布图。" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. 1倍放大下解剖显微镜图像，显示成年小鼠全脑脑血管系统的背侧观。
<img alt="脑血管，三维脑血管造影，医学影像，血管结构分析。" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 从背侧视角观察图3所示同一只成年小鼠全脑的显微CT扫描图像。
<img alt="淀粉样纤维的高分辨率显微镜图像；A 显示荧光图像，B 显示电子显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 5"> 
图 5. 应用血管铸型法检测脑动静脉畸形。A）脑血管铸型的显微CT扫描图像，从腹侧视角显示右半球存在扩张、不规则的类似动静脉畸形（AVM）的血管区域。右侧为该区域（白色框内）的放大图像。B）在明场显微镜下以50倍放大倍数观察到的相同不规则血管。比例尺为50 μm。

<ol><li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li>
<li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li>
<li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li>
<li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li>
<li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
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<li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li>
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<li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

实验中使用实验动物的程序已获得加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会的批准。

本文报道了一种可用于多种成像方式的成年小鼠脑血管灌注铸型方法。将该方法应用于脑动静脉畸形（BAVM）疾病模型，可实现对异常血管的三维分析。未来潜在的研究方向包括微计算机断层扫描（micro-CT）图像的定量分析、组织学分析以及血管疾病进展的诊断。
常见问题及建议
脑血管系统的完全灌注并不总能实现。在不破裂左心房或主动脉的前提下，提供足够压力以到达远端血管是一大挑战。为克服这一问题，应施加约100 mmHg的稳定压力。同时，调整针头位置，确保灌注剂能适当地流入主动脉。必须保证颈动脉未受压迫，以便灌注剂能够到达脑部血管。与改善小血管灌注效果密切相关的关键步骤包括：（1）彻底清除血管系统中的血液；（2）对灌注剂进行过滤；（3）灌注剂注射过程中的针头定位。操作时应特别注意避免将灌注剂注入左心房和肺组织。其他研究者已成功在无需额外操作的情况下完成小鼠3和大鼠4脑血管系统的灌注。对经Microfil灌注并用苏木精复染的血管进行人工分析显示，血管腔灌注率达93%5。任何接触过灌注剂的器械都必须丢弃或彻底清洗，因为该试剂会迅速聚合，且器械不可用于多个样本。小鼠脑组织周围结构的透明化处理可能具有挑战性。即使浸入水杨酸甲酯后，组织仍可能呈现不透明状态，导致血管成像困难。确保充分脱水和透明化处理可解决此问题。在酒精和水杨酸甲酯处理过程中将脑组织置于摇床上，有助于提高组织透明化效果。
该技术的缺点
该技术的局限性包括：（1）混合后必须立即注射铸型剂溶液，因为加入催化剂后溶液会迅速变稠；（2）铸型剂易于填充大口径血管，但无法稳定填充较小的血管，例如小动脉（阻力血管）和毛细血管（营养血管）；（3）它并非微计算机断层扫描（micro-CT）成像中最理想的放射性造影剂，尽管某些研究团队更倾向于使用Microfil进行micro-CT成像1,6。然而，若遵循上述建议，包括正确的针头位置、血管定位和灌注压力，便可实现小血管的完整铸型。该铸型剂适用于多种分析工具，因而成为从多个角度分析脑血管结构（包括动脉和静脉循环）的有力工具。
该技术的应用
该方法的优势在于其广泛的应用潜力。铸型可填充体内所有组织中的全部血管，包括动脉、静脉和毛细血管，因此可分析多种物种多个器官的血管结构。此前，其他研究团队已在人类、猴9、绵羊10、大鼠4,11,12和小鼠3,13的较大7和较小8血管中应用过此类灌注技术。我们目前展示了该技术用于分析小鼠脑内微血管结构的证据，涵盖健康状态和疾病状态2。此外，现有多种不同黏度的Microfil溶液，可用于灌注不同尺寸的血管，同时提供不同颜色以增强各器官内血管的可视化效果。例如，红色在颜色较浅的脑实质中易于观察，而黄色与深红色的心肌组织形成良好对比。更重要的是，由于该材料具有放射不透性，可利用显微CT扫描对血管系统成像，获得可三维旋转的图像。成像后的组织还可用于石蜡切片及组织学分析。
结论
本文展示了一种制备成年小鼠脑血管血管铸型的实验方案，该方案可结合多种分析技术，用于研究脑血管系统的形态结构。我们还提供了证据，表明该方法可用于脑动静脉畸形（BAVM）疾病模型的研究，该模型表现为形态不规则且扩大的血管，导致血液从动脉循环直接分流至静脉循环。目前已有多种血管铸型方法可供选择。本文提供的这一简单方案可作为一种工具，用于通过多种成像方式对成年小鼠脑血管系统进行观察与分析。

<table><tbody><tr><td>Microfil</td><td>FlowTech</td><td>MV130</td><td>保质期4个月</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>菲舍尔科技</td><td>O3695-500</td><td>用于组织透明化</td></tr></tbody></table>

成年小鼠脑血管铸型用于三维成像与形态学分析

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

血管成像在脑血管疾病（如脑动静脉畸形，BAVMs）的临床诊断与治疗中至关重要。研究脑血管疾病的病因病理及潜在疗法需要借助动物模型。在大型动物中进行血管成像相对容易。然而，由于基因修饰小鼠品系在成本和可获得性方面的优势，建立适用于小鼠脑疾病模型的血管成像方法具有重要意义。对小鼠脑部血管系统的成像仍是一项挑战。在人类和较大动物中，评估大血管（传导性血管）水平血管结构的金标准是基于X射线导管对比剂的血管造影术，但该方法并不适用于小型啮齿类动物。
本文介绍一种脑血管铸型方法，可制备出包含动脉、静脉和毛细血管在内的完整血管床的耐用骨架，该骨架可通过多种不同方式进行分析。小鼠脑血管系统微血管的完全铸型可能较为困难；然而，本逐步操作方案中已针对这些挑战提出了解决方法。通过血管铸型材料的心内灌注，可实现全身所有血管的铸型。随后可取出脑组织，并使用有机溶剂水杨酸甲酯进行透明化处理。利用任何常规明场显微镜或解剖显微镜，均可简单且低成本地实现脑血管三维成像。铸型后的脑血管系统还可通过显微计算机断层扫描（micro-CT）1进行成像与定量分析。此外，在完成成像后，铸型的脑组织可包埋于石蜡中，用于组织学分析。
与其它技术相比，这种血管铸型方法的优势在于其可广泛适用于多种分析工具，包括明场显微镜分析、由于材料具有放射不透性而可进行CT扫描，以及组织学和免疫组织化学分析。这种对组织的高效利用可减少动物使用量并降低成本。我们近期已证明该方法可用于在显微水平下可视化成年小鼠脑动静脉畸形（BAVM）模型中的异常血管结构2，并提供了通过显微CT扫描成像的畸形血管的额外图像。尽管该方法存在一些局限性，可能并不适用于所有类型的分析，但它是一种简单且实用的技术，易于掌握，并可广泛应用于全身各部位血管系统的铸型研究。

本文介绍一种简单且实用的脑血管铸型技术，操作简便，可用于成年小鼠脑部血管树的成像。

血管成像在脑血管疾病（如脑动静脉畸形，BAVMs）的临床诊断与治疗管理中至关重要。

本实验的总体目标是实现成年小鼠脑血管系统的三维可视化。首先打开胸腔，通过经口腔灌注含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS），清除血管系统中的全部血液。灌注完成后，将造影剂注入左心室，以灌注整个循环系统。随后取出灌注后的脑组织，并用多聚甲醛固定。该实验步骤的最后阶段是使用乙醇和水杨酸甲酯对脑组织进行脱水和透明化处理。最终可获得透明的小鼠脑组织，其血管系统可在明场或解剖显微镜下成像，并可通过显微CT扫描进行观察。大家好，我是来自加利福尼亚大学旧金山分校的Spen Walker。今天我们将制作成年小鼠脑部的血管铸型。与现有方法（如血管造影术）相比，该技术的主要优势在于可应用于小鼠等小型动物。该方法无需使用放射性物质，且操作相对简单。由于该材料具有放射不透性，已使其适用于多种分析工具，包括明场、显微分析、CT扫描，以及组织学和免疫组织化学分析。好了，我们开始吧。通过腹腔注射用生理盐水稀释的氯胺酮和赛拉嗪使小鼠麻醉，并通过足垫夹捏法确认麻醉完全。确认麻醉成功后，使用剪刀在剑突下方横向剪开胸部。接着剪开膈肌，然后沿胸廓背侧与腹侧之间的肋骨间隙向上剪开。为暴露胸腔，将胸骨及相邻的胸壁向上翻折，并用止血钳固定，以暴露心包膜。必要时用镊子打开心包膜以暴露心脏。将灌注泵设置为100毫米汞柱，开始灌注预热至37摄氏度的含5单位/毫升肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）。将连接至泵出液端的钝头22号针头插入心脏心尖附近的左心室。立即剪开。切开右心房以允许体循环血液流出，并持续灌注直至血液从循环系统中完全清除。首先，将5毫升稀释剂与4毫升过滤后的化合物混合，配制铸型剂溶液。然后，加入450微升固化剂，并确保在20分钟内使用该铸型剂溶液。使用前直接混合制胶剂溶液。为确保适当的黏度，将制胶剂溶液吸入一支10毫升注射器中。在注射器上安装一根钝头的20号针头，并用溶液充满针头。通过用于冲洗血液的同一孔洞将针头插入左心室，然后用止血钳固定针头，以每分钟约三毫升的速度手动缓慢将造影剂溶液注入左心室，因为过高的压力可能导致灌注流路异常或在注射过程中引发血管破裂。观察灌注成功的迹象，包括在肠和肝脏血管中可见造影剂、远端肢体变色，以及鼻部和舌头变色。如有必要，调整针头位置以实现充分的灌注。取出脑组织并置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定过夜。随后，在室温下将脑组织直接浸入浓度逐步升高的乙醇中，持续七天以完成脱水过程，第一天使用25%乙醇。脑组织脱水完成后，将灌注过的脑组织浸入水杨酸甲酯中，在室温下处理两天，以清除血管周围组织。两天后，整个透明化的脑组织无需切片，即可通过浸入水杨酸甲酯并在明场显微镜、解剖显微镜或微计算机断层扫描（micro-CT）下观察其血管结构。利用明场显微镜，可在不同焦平面上观察脑内未切片状态下的血管网络，以及在高倍镜下观察单个微血管。如下面板所示。在解剖显微镜下，可在同一焦平面上观察到完整的脑血管结构，从而更清晰地呈现其三维结构。该图像展示了大血管的形态及全脑血管系统，但缺乏明场显微镜所拍摄图像中的细节。微型CT扫描可实现对血管系统的三维可视化，并可构建可旋转的三维模型。为了展示血管结构，此处显示的是通过微型CT检测到的异常脑血管结构，并与同一血管畸形的明场显微镜图像相对应。这些数据共同表明，在进行血管铸型后，同一样本可利用多种成像工具进行分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用Microfil灌注液对成年小鼠脑部血管进行铸型。该操作步骤包括：清除血管系统中的血液、心室注射Microfil溶液、成年小鼠脑组织的采集与处理，以及利用明场显微镜对脑血管系统进行成像。本实验的总体目标是对成年小鼠脑内血管系统进行三维可视化观察。

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