Name: 心脏功能免疫细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习从心脏心包腔分离功能性免疫细胞的方法，使用大鼠模型和HBSS灌洗技术。该方法避免胶原酶消化导致的细胞激活，保留免疫细胞活性，适用于流式细胞术、免疫荧光分析及药物处理等后续实验。

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本工作得到了联合黑人学院基金会-默克研究生科学研究论文奖学金（J.L.M.）、美国国家心肺血液研究所资助项目RO1-HL-62228（J.S.J.）和RO1-HL-073990（J.S.J.）的支持。

1. 配制汉克斯平衡盐溶液（HBSS）
<ol>
 <li>将1 L玻璃烧杯、1000 mL量筒和搅拌子进行高压灭菌。</li>
 <li>在已灭菌的1 L玻璃烧杯中，用双蒸水将HBSS粉末溶液定容至900 mL刻度线。</li>
 <li>向HBSS溶液中加入3.4 g Hepes钠盐，并使用浓HCl或NaOH将pH值调节至7.35–7.41之间。</li>
 <li>当达到目标pH值并保持稳定后，在室温下向溶液中加入5 g牛血清白蛋白，持续搅拌直至白蛋白完全溶解。</li>
 <li>向溶液中加入10 mL抗生素-抗真菌剂，并用双蒸水定容至1000 mL刻度线。</li>
 <li>充分搅拌溶液。</li>
 <li>将HBSS溶液过滤后分装至50 mL Falcon离心管中以备后续使用。多余的分装管可冷冻保存，供日后使用。</li>
</ol>
2. 动物准备——气管插管
<ol>
 <li>准备一个托盘，放置插入气管插管所需的器械和材料（例如：镊子、剪刀、气管插管、3-0黑色编织缝线、小型动物呼吸机等）。</li>
 <li>当大鼠通过按2:1比例配制的氯胺酮/赛拉嗪混合物完全麻醉后，剃除其腹部、胸部和喉部的毛发。为确认已达到深度麻醉状态，可夹捏大鼠脚趾并观察肢体是否出现屈曲回缩反应。在进行任何切口前，务必确保大鼠处于深度麻醉状态。</li>
 <li>将大鼠置于一块切割板上，头部抬高，切割板倾斜30°角。</li>
 <li>从腹部中线开始向下颌下方做一皮肤切口。分离颈部前三角区的肌肉组织，暴露气管。</li>
 <li>将一根3-0黑色编织缝线穿过气管下方。</li>
 <li>在气管软骨环之间做一切口，插入气管插管，并将缝线扎紧，以固定气管插管与气管的连接。</li>
 <li>将气管插管连接至小型动物呼吸机。</li>
</ol>
3. 免疫细胞分离的仪器准备
<ol>
 <li>准备一个托盘，放置用于免疫细胞分离操作的器械（例如镊子、剪刀、HBSS、修剪过的柔软特氟龙材质24号Baxter套管针快速导管）。</li>
 <li>准备两个10 mL注射器，其中一个装入HBSS，用于将缓冲液注入心包腔；另一个留作抽吸含有细胞的HBSS之用。 3.2.1. 为进行分离操作，将24号Baxter套管针快速导管的特氟龙尖端（原长1.6 cm）剪短至原长度的1/2至3/4。</li>
 <li>将所有注射器、缓冲液以及一个空的15 mL Falcon离心管（用于在操作结束后盛装提取的液体）置于冰上。</li>
</ol>
4. 免疫细胞分离
<ol>
 <li>沿腹白线在腹壁做正中切口，直至剑突。</li>
 <li>从剑突稍外侧开始，沿斜向腋窝的方向在两侧肋骨上做切口。注意避免穿破肺、心脏或心包膜。</li>
 <li>当胸骨两侧的切口完成后，从下位肋骨处向内侧解剖分离膈肌。 注意：始终注意心包膜与膈肌和胸骨的连接位置，避免造成损伤。可利用镰状韧带作为解剖标志，判断心包膜在膈肌对侧的附着位置。此外，若心包膜被切破，则将无法有效分离细胞。</li>
 <li>轻柔抬起一侧肋骨，以暴露胸腔及心脏（心脏仍被心包膜包裹）。</li>
 <li>取装有HBSS的注射器，在心包腔内选择一个位置，大致位于胸骨与心脏之间的中点处（优先选择偏头侧而非尾侧的位置），将截短的快速导管（quick-cath）的聚四氟乙烯（Teflon）头穿过心包膜双层插入。</li>
 <li>导管就位后，缓慢注入2至3 ml HBSS缓冲液至心包腔。若导管位置正确，可立即观察到心包腔扩张。若未见充盈，应撤出并重新调整快速导管的位置。</li>
 <li>当心包腔充满液体后，取另一支10 ml注射器，将针头重新插入心包腔，开始抽吸缓冲液。可使用同一穿刺孔，也可另开新孔。抽吸过程中，确保针头不要过于靠近心包腔壁，尤其是心脏下方区域，以免刺破心包腔，导致含细胞液体流失。</li>
 <li>在抽吸缓冲液的同时，可轻微移动导管头在心包腔内的位置，以尽可能收集更多的液体。</li>
</ol>
注意：如果在此过程中轻微撕裂心包膜，导致心脏顶部的孔洞比原始孔洞稍大，无需惊慌。只要心包膜仍包裹住足够多的心脏组织，仍可进行额外的心脏冲洗，尽管缓冲液体积需相应减少。为收集到最佳数量的细胞，还需进行三到四次额外冲洗。
<ol start="9">
 <li>将提取的缓冲液放入预先置于冰上的 Falcon 管中。</li>
 <li>根据后续实验需要，移除心脏、肺脏和/或任何其他组织。在收集免疫细胞和其他组织后，必须迅速且人道地处死大鼠。</li>
 <li>将收集的免疫细胞样品在 4°C 下以 200g 离心 10 分钟。不使用时，始终将管子置于冰上。</li>
 <li>弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL Hyclone 缓冲液或 HBSS 中。</li>
</ol>
注意：在免疫细胞分离程序后，对从每颗心脏获得的免疫细胞数量进行计数非常重要。
5. 代表性结果：
利用该技术获得并经甲苯胺蓝以及番红O/阿尔新蓝染色的分离心脏肥大细胞示例分别如图2A和2B所示。如图3所示，心脏肥大细胞在经已知激活剂（如化合物48/80和P物质）处理后，仍保持释放组胺的能力，相关方法见Morgan等9的描述。CD4+细胞和CD8+细胞的代表性流式细胞术散点图分别如图4和图5所示。T淋巴细胞可进一步通过该技术被鉴定并表型分类为特定的细胞群体。
<img alt="从大鼠心脏细胞分离的流程图；包括麻醉、HBSS、离心步骤。" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 心脏免疫细胞分离流程图。
<img alt="组织学染色比较：甲苯胺蓝与阿利新蓝-藏红O显微镜下图像。" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 心脏肥大细胞的组织学代表性图像染色如下：(A) 甲苯胺蓝染色，(B) 阿利新蓝-藏红O染色。
<img alt="组胺释放百分比柱状图；对照组、48/80、P 物质比较；数据分析结果" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. 从心外膜心肌区域分离的心脏肥大细胞在化合物 48/80（10μg/mL）和P物质（10μM）刺激下的功能研究。
<img alt="流式细胞术散点图；CD4细胞门控；淋巴细胞分析；免疫应答可视化。" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 经P物质（1:100稀释）标记的分离CD4+细胞的代表性流式细胞术散点图。
<img alt="显示用于CD8+ T细胞分析的细胞门控的流式细胞术散点图，突出显示红色细胞群。" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 5"> 
图 5. 经P物质（1:100稀释）标记的分离CD8+细胞的代表性流式细胞术分析结果。

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

这种分离心脏免疫细胞的方法能够在不引起传统酶消化分离技术中常见非预期激活的情况下，分析这些细胞的功能、表型和成熟度。采用该技术每只大鼠心脏平均可获得约400,000个细胞，对这些细胞进行差异染色和流式细胞术分析表明，细胞群体主要包括T淋巴细胞（约70%）、巨噬细胞（约12%）和肥大细胞（约12%）13, 14。因此，需要进一步的纯化方法以实现心脏免疫细胞亚群的分离。分离得到的免疫细胞可用于多种实验应用，包括功能研究、流式细胞术、免疫荧光以及共培养实验。通过进一步纯化和实验，这些分离的细胞为研究免疫系统在心脏重塑过程中的作用提供了有力工具。
动物安全：
大鼠在标准环境条件下饲养，并可自由摄取商品化大鼠饲料和自来水。ad libitum。所有研究均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的原则，并经南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准。实验终点时，采用氯胺酮与赛拉嗪按2:1比例配制的混合物进行麻醉。该操作为非存活性手术，允许使用未经灭菌的器械。在分离免疫细胞及其他所需组织后，根据...

<table><tbody><tr><td>亨克斯&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td>一瓶配制1升Hanks液&amp;rsquo; 平衡盐&lt;br/&gt;溶液。用Hanks重新溶解&amp;rsquo; 平衡盐&lt;br/&gt;作为实验步骤的一部分的溶液。</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Nalogene 滤瓶</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>157-0020</td><td></td></tr><tr><td>12 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 7647-01-0</td><td>对于6 N，将等体积的HCl加入去离子水中。</td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC267</td><td>对于5 N，将等体积的NaOH加入去离子水中。</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">特定设备清单：</td></tr><tr><td>3-O 缝合丝线编织</td><td>Ethicon Inc.</td><td>SA64H</td><td></td></tr><tr><td>小型动物呼吸机</td><td>CWE, Inc.</td><td>SAR-830</td><td>将呼吸频率设置为 40.5 次/分钟。</td></tr><tr><td>18号斜面针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305199</td><td>将针头修剪至原长度的1/2至3/4，用作气管插管。</td></tr><tr><td>24 号 Baxter Quick-Cath 导管（移除针头）的聚四氟乙烯尖端</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2N111</td><td>将特氟龙尖端长度缩短至1/2到3/4。</td></tr><tr><td>10 cc 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon管</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RT6000B 冷冻离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>请记住预先冷却并保持在4℃&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>S300030.02</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>豪瑟科学</td><td>HS-LB-1483</td><td></td></tr></tbody></table>

功能性心脏免疫细胞的分离

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

心脏免疫细胞因其在多种心脏疾病病理重塑过程中所起的作用而日益受到关注1-5。这些免疫细胞包括肥大细胞、T细胞和巨噬细胞，能够储存并释放多种生物活性介质，如细胞因子以及类胰蛋白酶等蛋白酶6-8。研究表明，这些介质可通过激活基质金属蛋白酶或通过调节心肌成纤维细胞功能导致胶原蛋白积聚，在细胞外基质代谢中发挥关键作用9-11。然而，目前用于分离心脏免疫细胞的技术存在局限性，因其通常使用细菌胶原酶消化心肌组织，该过程可导致免疫细胞被激活，从而丧失其正常功能。例如，心脏肥大细胞对诱导脱颗粒化合物的反应性显著降低12。因此，我们建立了一种可分离功能性心脏免疫细胞的技术，有助于更深入地理解这些细胞在心脏疾病中的作用13, 14
该方法要求熟悉大鼠剑突、腋窝、镰状韧带以及心脏心包膜的解剖位置。这些解剖标志对于提高操作成功率和获得更高产量的心脏免疫细胞至关重要。分离得到的心脏免疫细胞可用于功能、表型、成熟度的表征，以及与其他心脏细胞的共培养实验，从而更深入地理解它们之间的相互作用。

这种从心脏中分离功能性免疫细胞的方法为传统的胶原酶消化法提供了一种替代方案，后者会引起非预期的免疫细胞活化，导致这些细胞的反应性降低。我们的分离方法避免了酶消化相关的问题，从而获得具有功能的心脏免疫细胞。

心脏免疫细胞因其在多种心脏疾病病理重塑过程中所起的作用而日益受到关注。1-5 这些免疫细胞……

本实验的总体目标是分离出具有功能活性的心脏免疫细胞。首先对大鼠进行通气并暴露包裹心脏的心包膜，随后将Hank's平衡盐溶液（HBSS）注入心包腔内。然后吸除含有心包腔免疫细胞的HBSS。最后，对分离步骤获得的免疫细胞数量进行计数。最终，可对细胞进行化学脱颗粒或共培养实验、流式细胞术、免疫荧光分析或药物处理，以评估心脏免疫细胞的功能性和生物学活性。将有三位来自我实验室的人员演示该操作流程：研究生 Jennifer McLarty、博士后研究员 Giselle Melendez，以及我的首席技术员 Spencer。该技术相较于现有的免疫细胞分离方法（例如胶原酶消化法）的主要优势在于，它能够防止免疫细胞发生非预期的激活和损伤，并保持免疫细胞对实验处理的应答能力。在开始操作前，将切板倾斜至30度角。然后使用Dremel电动工具剪去18号斜角针头末端的一半至四分之三，制成较短的针尖，用于动物监测后插入气管插管。为确保麻醉充分，剃除动物腹部、胸部和 throat 部位的毛发，然后从腹部中线切开皮肤，延伸至下颌下方。接下来，解剖分离颈部前三角区的肌肉，暴露气管。气管暴露后，将其下方穿过一根3-0黑色编织缝线。在气管软骨环之间做一切口，插入气管插管。用3-0缝线将气管牢固结扎，以固定气管插管。接下来，将气管插管连接至小型动物呼吸机并启动呼吸。为确保心脏和肺部充分氧合，需确认大鼠在呼吸机吸气和呼气时胸廓起伏对称。在开始免疫细胞分离之前，用10 cc注射器抽取HBSS。然后剪去24号Baxter血管套管针软质特氟龙针头末端的二分之一至四分之三，快速制备成较短的针头，用于分离操作。将24号Baxter血管套管针放置一旁备用。快速将含有HBSS的注射器针头插入止血阀。然后将装有HBSS的注射器、所有缓冲液以及一个空的50毫升锥形管置于冰上。现在从白线处开始沿腹壁正中线切开，一直延伸至剑突。然后从剑突外侧开始，沿双侧肋骨进行切口。继续以一定角度向腋窝方向切开，同时注意避免损伤肺、心脏或心包。随后，将膈肌从下位肋骨处游离，由外向内进行剪切。接下来，利用镰状韧带作为解剖标志，确定心包在膈肌对侧的附着位置。轻轻抬起肋骨的一侧，以暴露胸腔和心脏。进行心包穿刺，抽吸HBSS和细胞，然后重新插入。注射器是该操作中最难处理的部分。如果心包膜出现轻微撕裂，不必惊慌。只要心包膜仍能包裹住足够多的心脏部分，形成一个围绕心脏的碗状结构，就仍然可以对心脏进行冲洗。选择心包膜上一个大约位于胸骨与心脏中间的位置，最好比房室交界处更靠头侧，将快速导管的聚四氟乙烯尖端穿过心包膜的两层。一旦尖端到位，轻柔地向心包腔内注入 2 至 3 毫升 HBSS。当心包囊充盈后，将导管尖端切换至空的 10 cc 注射器，并将尖端重新置入心包腔内。使用相同的穿刺孔，尽可能吸出缓冲液，注意在抽吸过程中吸头不要过于靠近心包膜壁，尤其是在心脏的下方。然后将吸出的液体转移至15毫升离心管中。保持离心管在4摄氏度条件下，用2至3毫升HBSS再次灌注并排空心包腔1至2次。将回收的HBSS再转移至15毫升离心管中约三到四次。每次洗涤后，取出心脏、肺或其他研究所需的组织，并将离心管保持在冰上。当不使用时，将收集的免疫细胞样品在200 × g条件下离心10分钟。在4 °C下，弃去上清液，然后用1 mL HBSS重悬沉淀。以下是心脏免疫细胞分离后用于确定细胞形态和成熟度的组织学研究示例。左侧和右侧分别展示了用甲苯胺蓝和AUM蓝以及藏红O染色的心脏肥大细胞。此处显示的是功能研究结果，其中从心脏心外膜区域分离的心脏肥大细胞经已知激活剂刺激后的反应。分离的心脏肥大细胞在使用 10 微克/毫升的化合物 48/80 或 10 微摩尔的 P 物质处理后，仍具有释放组胺的能力。在接下来的两个图中，展示了通过流式细胞术分析分离的心脏免疫细胞的代表性散点图。在第一个散点图中，已鉴定出心包液分离物中 CD4 阳性的 T 细胞。在第二个散点图中，检测到了 CD8 阳性的 T 细胞。在尝试该操作时，重要的是要记住，在注射缓冲液以及吸出含有免疫细胞的缓冲液时，应保护心包膜的完整性，这将提高所获得细胞的产量。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

心脏功能免疫细胞的分离

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。...

心脏血管外免疫细胞的分离与鉴定

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。...

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

我们已优化了一种用于分离和纯化小鼠心脏周细胞的实验方案，以开展基础研究并探索其生物学特性及治疗潜力。...

小鼠心脏周细胞的分离与纯化

本文介绍了一种通过酶消化制备单细胞悬液，从人和小鼠心肌组织中分离巨噬细胞及其他非免疫细胞不同亚群的实验方案。同时提供了基于流式细胞术对分离得到的巨噬细胞进行鉴定与表征的设门策略。...

从人和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞亚群和基质细胞

本研究的目的是建立一种可重复地从成年心脏中分离心肌细胞并测量其DNA含量和核化程度的方法。...

从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

本文提供的方案详细阐述了从小鼠心脏的窦房结（SAN）和房室结（AVN）区域分离心脏常驻巨噬细胞的逐步操作方法。...

从小鼠窦房结和房室结中分离与培养驻留型心脏巨噬细胞

本文报道了一种基于心肌B淋巴细胞在血管内或内皮空间位置，利用流式细胞术对其进行定量和区分的实验方案。...

基于流式细胞术的心肌B细胞定量与分析

学习从心脏心包腔分离功能性免疫细胞的方法，使用大鼠模型和HBSS灌洗技术。该方法避免胶原酶消化导致的细胞激活，保留免疫细胞活性，适用于流式细胞术、免疫荧光分析及药物处理等后续实验。

功能性心脏免疫细胞的分离

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