动态活细胞成像的宿主 - 病原体相互作用的研究使用的光学陷阱
July 28th, 2011
一种方法是描述单独选择，操作和使用光学陷阱，再加上一个旋转的磁盘显微镜图像活病原体。光陷阱提供了空间和时间的控制生物体和地方他们相邻的宿主细胞。荧光显微镜捕捉动态，以最小的扰动细胞间的相互作用。
以下实验的总体目标是使用光学捕获结合转盘共聚焦显微镜来实时观察宿主病原体的相互作用。这是通过首先将目标病原体添加到腔室盖玻片中来实现的。接下来，选择一个粒子并使用光阱捕获。
最后，颗粒被引导至目标细胞。如图所示。光捕获可以成为控制两个粒子以观察动态细胞内相互作用的有效方法。
该方法可以回答传染病和免疫学领域中宿主病原体相互作用中的重要问题，包括当完全控制宿主细胞和病原体之间的空间关系时，对吞噬作用有什么影响，以及吞噬细胞吸收病原体的顺序是否影响噬体成熟。通常，刚接触这种方法的人会很困难，因为必须针对不同的细胞和微珠类型优化捕获条件。这种方法的视觉演示对于设置和集成旋转盘的过程至关重要。
由于所有光学元件都需要精确对准，因此很难概念化与光阱的共聚焦。收获感兴趣的病原体。例如，在这里，从培养物中去除 300 微升在肉汤中过夜生长的加拿大白色念珠菌，并将病原体转移到 1.5 毫升反应管中。
然后在室温下以大约 1300 G 的浓度洗涤病原体 3 次，每次 5 分钟，吸出上清液，每次重悬 PBS 并超声处理时，沉淀物不受干扰。第三次洗涤后，复苏将沉淀悬浮在 500 微升 PBS 中。接下来，将 1 毫克 entrust 染料溶解在 100 微升二甲基甲酰胺中，最终浓度为 10 毫克/毫升。
然后将 3 微升染料混合物添加到含有洗涤过的病原体的反应管中。由于染料对光敏感，因此在试管周围放置箔纸，并在 37 摄氏度下摇动样品 1 小时，然后像以前一样在 PB S3 中沉淀和洗涤样品。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 300 微升 PBS 中。
将培养基试穿和 PVS 加热至 37 摄氏度，在水浴中洗涤。一个 10 厘米的组织培养板，涂有生的 2 6 4 0.7 巨噬细胞两次，PBS 在每次洗涤之间吸出 PBS。接下来，用 5 毫升胰蛋白酶覆盖板表面，并在 37 摄氏度下孵育板 5 分钟。
然后轻轻敲击板的侧面，使细胞从板表面分离。小心不要将胰蛋白酶溅到板外。现在向板中加入 5 毫升培养基，并将混合物转移到反应管中。
沉淀后，细胞吸出培养基，小心不要干扰沉淀，并将沉淀重悬于 10 mL 培养基中。向腔室载玻片的每个腔室中加入 400 微升培养基，然后向每个腔室中加入 5 微升细胞悬液。让细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中生长过夜。
从培养箱中取出腔室载玻片，移液管将 5 至 10 微升先前制备的荧光标记的目标病原体放入巨噬细胞的每个腔室中。通过上下移液彻底混合巨噬细胞和病原体，注意不要接触腔室底部并干扰粘附的巨噬细胞。打开转盘共聚焦显微镜的所有组件。
通过向油浸物镜中加油来准备显微镜。将腔室载玻片插入专用载物台，然后取下腔室载玻片对齐显微镜的顶部以进行 DIC 成像。打开光阱和红外激光的快门。
然后打开激光上的快门以对准光阱。使用红外卡检查，确认红外激光前面的快门已关闭。现在专注于粘附载玻片上的巨噬细胞。
然后发现病原体自由漂浮在巨噬细胞附近的溶液中。由于样品室中物体与盖玻片之间的粘附力，此过程最困难的部分是在样品室中找到要跟踪的正确物体。为了移动该物体，您必须在物体被交通激光器固定时移动载物台，并且同样重要的是要注意，您必须以足够慢的速度移动载物台，以便载物台的阻力不超过载物台的最大诱捕力陷阱。
移动载物台，使病原体位于陷阱附近。然后打开百叶窗并接合陷阱。移动样品以使巨噬细胞与固定的捕获病原体图像接触。
使用转盘共聚焦显微镜的 DIC 荧光或两个单独的加拿大白色念珠菌种群的组合（通常大小约为 5 微米）的病原体被标记为绿色、蓝色和红色。为了说明成像，单个白色念珠菌被捕获并以方形模式穿过一簇其他酵母，如灰色箭头所示，展示了即使在拥挤的环境中也能捕获和纵作员选择的单个病原体的特定位置的能力。为了进一步说明该系统在图中捕获病原生物所表现出的不同形状形态的灵活性，使用光镊用假 hyphy 固定和定位白色念珠菌颗粒。
白色念珠菌用红色染料标记，并沿白色箭头所示的轨迹移动，并放置在荧光 GFPL C3 原始细胞旁边。绿色。白色念珠菌的酵母部分被困在假 hyphy 的拖曳过程中。
Aspergillus fum goddess 也被放置在原始小鼠巨噬细胞旁边，以分析这种特定细胞系和病原体吞噬作用的绝对时间范围。在此图中，明场图像显示了被捕获的曲霉菌（如白色箭头所示）如何沿红色箭头所示的路径移动和定位。由于陷阱将生物体推至焦平面略上方，因此被捕获的病原体略微偏离焦点。
移动曲霉菌，直到它被放置在所需的原始细胞附近。一旦病原体与细胞接触，陷阱就关闭。吞噬过程被激活，并采用延时成像来观察随后的细胞事件。
30 秒时，原始细胞的膜开始发生变化，并在颗粒周围形成一个杯子。60 秒时，杯子完全成型。从 90 秒到 150 秒，Afu Gotti 正在形成并被吞没，到 180 秒时，粒子完全内化。
看完这个视频，你应该对如何制作一个旋转盘式光阱装置，以及这样的仪器如何使人们在开发后能够无创地控制病原体进行活细胞成像有了很好的了解。这项技术为宿主病原体相互作用领域的研究人员研究宿主细胞和病原体之间空间关系的作用及其对随后的免疫反应的作用铺平了道路。
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概述
本文描述了一种使用光学捕获和旋转孔镜共聚焦显微镜观察病原体与宿主细胞的实时相互作用的方法。该技术允许精确操控和实时成像病原体，从而能够研究动态的细胞间相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 理解宿主-病原体的相互作用对于开发治疗策略至关重要。
- 传统的成像方法可能会破坏细胞过程。
- 光学捕获提供了一种非侵入性的活细胞操控方法。
- 旋转孔镜共聚焦显微镜提供高速成像能力。
研究目的
- 开发一种实时观察病原体与宿主细胞相互作用的方法。
- 利用光学捕获精确控制病原体的定位。
- 在成像过程中尽量减少对细胞的扰动。
使用的方法
- 病原体被引入到带有室的盖玻片中。
- 光学捕获被用来选择和捕获单个病原体。
- 被捕获的病原体被引导到特定的宿主细胞。
- 荧光显微镜以最小的干扰捕获相互作用。
主要结果
- 成功展示了对邻近宿主细胞的病原体的操控。
- 可视化了病原体和宿主细胞之间的动态相互作用。
- 该方法允许对细胞内过程进行详细观察。
- 在成像过程中对宿主细胞的扰动最小化。
结论
- 光学捕获和旋转孔镜显微镜的组合对于研究活细胞相互作用是有效的。
- 这种方法可以增强我们对病原体实时行为的理解。
- 未来的应用可能包括治疗开发和细胞反应研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise manipulation of host-pathogen interactions using optical trapping and live cell imaging addresses a critical bottleneck in immunology and infectious disease research. This capability enables direct observation of early immune responses, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in target validation. Integration of spatial and temporal control over cell contact events enhances the translational value of discovery-stage findings for biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell-pathogen interactions under controlled conditions for mechanistic clarity.
- Supports functional target validation by visualizing phagocytosis and synapse formation in real time.
- Improves predictive confidence by reducing stochastic variability in cell contact events.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated live cell systems for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, quantitative imaging of cellular responses to pathogen exposure.
- Supports assay standardization by minimizing perturbation and maximizing control over experimental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro immune cell behavior with disease-relevant pathogen challenges.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by capturing early immune events.
- De-risks translational advancement by enabling detailed analysis of innate and adaptive immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven interrogation of host-pathogen dynamics with high spatial and temporal resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell engagement and phagocytosis mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of cellular events for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant immune responses in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for repeated, standardized interrogation of diverse host-pathogen systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune response studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in infectious disease programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune targets and therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, live cell imaging, and confocal microscopy alignment.
- Demands specialized instrumentation and environmental control for physiological relevance.
- Necessitates cross-team standardization of trapping and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types, pathogens, and bead morphologies.
- Optimization of trapping conditions is essential for reproducibility across experimental systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Labeling of Pathogens with Fluorescent Dye
2:52
Preparation of RAW 264.7 Macrophages for Chamber Slides
4:04
Selection and Manipulation of a Pathogen with the Optical Trap
6:18
Representative Images of Pathogen and Immune Cell Interactions After Trapping-Initiated Pathogen:Cell Contact
8:35
Conclusion
