使用光镊技术进行活细胞动态成像研究宿主-病原体相互作用

以下实验的总体目标是利用光镊结合转盘共聚焦显微镜，实时观察宿主与病原体之间的相互作用。首先将感兴趣的病原体加入带腔室的盖玻片中，随后用光镊选取并捕获一个微粒。

最后，将微粒引导至目标细胞。如图所示，光镊捕获可有效控制两个微粒，以观察细胞内动态相互作用。

该方法可解答感染性疾病和免疫学领域中宿主-病原体相互作用的重要问题，包括在实现宿主细胞与病原体之间空间关系完全可控的情况下，对吞噬作用的影响如何，以及吞噬细胞摄取病原体的顺序是否会影响吞噬体的成熟过程。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为针对不同类型的细胞和微珠，捕获条件需要进行优化。该方法的可视化演示至关重要，特别是建立和整合旋转圆盘系统的过程。

将共聚焦显微镜与光镊结合较难理解，因为所有光学元件需要精确对准。收集目标病原体。例如，此处将300 µL在液体培养基中过夜培养的白色念珠菌从培养物中取出，并将病原体转移至1.5 mL离心管中。

然后在室温下以约1300 ×g离心5分钟，洗涤病原体三次，每次离心后吸除上清液，保留沉淀，并用PBS重新悬浮沉淀，随后进行超声处理。第三次洗涤后，将沉淀重悬于500微升PBS中。接下来，将1毫克染料溶于100微升二甲基甲酰胺中，配制成终浓度为10毫克/毫升的溶液。

然后将3微升染料混合物加入含有已洗涤病原体的反应管中。由于染料对光敏感，需用铝箔包裹试管，并在37摄氏度下振荡孵育1小时，随后像之前一样以PBS离心收集并洗涤样本3次。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于300微升PBS中。

将培养基和PVS在水浴中预热至37摄氏度。使用PBS洗涤经raw 264.7巨噬细胞包被的10厘米组织培养皿，共洗两次，每次洗涤之间需吸除PBS。接着，向培养板表面加入5毫升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟。

然后轻轻敲击培养板的侧面，使细胞从培养板表面脱落，注意避免胰蛋白酶溅出培养板外。现在向培养板中加入5 mL培养基，并将混合液转移至反应管中。

离心后，吸除上清液，注意不要扰动沉淀，将沉淀重悬于10毫升培养基中。向细胞计数板的每个腔室中加入400微升培养基，然后向每个腔室中加入5微升细胞悬液。将细胞置于37°C、含5%CO2的培养箱中过夜培养。

从培养箱中取出腔室载玻片，用移液器将5至10微升先前制备的荧光标记的目标病原体加入每孔的巨噬细胞中。通过上下吹打充分混匀巨噬细胞和病原体，注意不要触碰腔室底部，以免扰动贴壁的巨噬细胞。开启旋转盘共聚焦显微镜的所有组件。

通过向油浸物镜添加镜油来准备显微镜。将腔室载玻片插入专用载物台，然后取下腔室载玻片的顶部，调整显微镜以进行微分干涉差（DIC）成像。打开光镊的快门和红外（IR）激光器。

然后打开激光通往光镊的快门。使用红外卡检查并确认红外激光前方的快门已关闭。现在将焦点对准贴附载玻片上的巨噬细胞。

然后寻找在巨噬细胞附近溶液中自由漂浮的病原体。该操作过程中最困难的部分是在样品室中找到合适的追踪目标，这是由于目标物与样品室盖玻片之间存在粘附力。为了移动该目标物，必须在光镊激光固定住目标物的同时移动载物台；同时需要注意，移动载物台的速度必须足够慢，以确保载物台产生的拖拽力不超过光镊所能提供的最大捕获力。

移动载物台，使病原体位于光镊捕获区域附近。随后打开快门，启动光镊捕获。移动样品，使巨噬细胞与静止的被捕获病原体接触。

使用旋转盘共聚焦显微镜，通过微分干涉相差（DIC）荧光或两者结合的方式对病原体进行成像，其中通常约为五微米大小的白色念珠菌（Candida albicans）不同种群分别被标记为绿色、蓝色和红色。为展示成像效果，一个单独的白色念珠菌（C. albicans）被成功捕获，并按照灰色箭头所示路径在其他酵母细胞簇中沿方形轨迹移动，证明了该系统能够在拥挤环境中精确捕获并操控由操作者选定的单个病原体的特定位置。为进一步说明该系统在捕获病原体所呈现的不同形态结构方面的灵活性，本图中还利用光镊技术对一个具有假菌丝形态的白色念珠菌（C. albicans）颗粒进行固定和定位。

将标记为红色染料的白色念珠菌沿白色箭头所示轨迹移动，并将其放置在绿色荧光的GFPL C3原始细胞旁。白色念珠菌的酵母部分被固定，而假菌丝则随之延伸。

为了分析该特定细胞系与病原体吞噬作用的绝对时间框架，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）也被置于一个未经处理的小鼠巨噬细胞旁。在本图中，明场图像显示了被白箭头指示的被捕获的曲霉沿红箭头所示路径移动和定位的过程。由于光镊将生物体轻微推离焦平面，被捕获的病原体略显失焦。

将曲霉移动至目标原始细胞附近。一旦病原体与细胞接触，即关闭捕获装置。吞噬过程被激活，并采用延时成像技术观察后续的细胞事件。

30 秒时，未处理细胞的细胞膜开始发生变化，并在颗粒周围形成杯状结构。60 秒时，杯状结构完全形成。从 90 秒到 150 秒，Afu Gotti 逐渐被吞噬，至 180 秒时，颗粒已完全被内化。

观看本视频后，您应能充分了解如何构建旋转圆盘光镊装置，以及该仪器在开发完成后如何实现对病原体的无创操控，从而进行活细胞成像。该技术为宿主-病原体相互作用领域的研究人员探索宿主细胞与病原体之间的空间关系及其对后续免疫反应的影响提供了重要途径。