实时成像背根轴突后根切断术

该程序的总体目标是研究背根再生，以发现一种在脊髓根损伤后诱导显着再生的方法。这是通过首先创建脊髓半椎板切除术来实现的，该切除术暴露了正确的 L 5 背根，并允许在脊髓和背根中可视化 YFP 标记的阳性轴突。接下来，小心压碎 L 5 背根以确保出血量最小。

然后在压碎后对挤压部位进行成像，以验证受伤的背根在病变中的位置。在几个时间点的过程中，对损伤部位和背根进入区进行成像，以确定受损轴突再生到脊髓的能力。最终，可以获得结果表明，再生轴突在进入背根入口区或 DREZ 时被迅速固定并保持静止。

与现有技术（例如在死去的动物中成像）相比，该技术的主要优势在于，我们可以在数周甚至数月的时间内在活体动物中重复对该系统进行成像。首先在荧光立体显微镜下放置恒温控制的加热垫，并在加热垫上将输出调节至 32.5 摄氏度，调节至 32.5 摄氏度预热无菌林格溶液至 32.5 摄氏度，用于脊髓冲洗在手术过程中，通过腹膜内注射甲苯噻嗪和氯胺酮混合物麻醉动物。镇痛药丁丙诺啡的初始剂量也通过皮下给药。

当没有可触及的反射并且动物对脚趾捏没有反应时，可以达到适当的麻醉水平。确认麻醉后，用小动物剪剃掉上背部，并用棉签将一小滴脱毛化妆水涂抹在剃须区域。几分钟后，用肥皂水去除涂抹的化妆水和任何残留的皮毛。

最后，使用 70% 乙醇浸泡的纱布海绵彻底清洁手术区域。将动物放在加热垫上，用 70% 乙醇浸泡的棉签对皮肤进行消毒。不过，应使用无菌手术单进行演示。

本视频中未显示。在立体显微镜的明场照明下，在背部皮肤上做一个 2 到 3 厘米的中线切口。如有必要，使用棉签止血。

用细镊子和骨颌反映脊髓肌肉组织。暴露底层腰椎。使用小 r 陪审员通过右侧半椎板切除术暴露 L 三到 S 一脊柱段，然后用温热的无菌林格溶液灌注腔。

将动物放在由卷起的棉纱布制成的支撑垫上。使脊柱变平。使用回缩钩扩大暴露区域。

此时，在第一次注射麻醉剂后大约 30 分钟，应注射补充剂以保持动物完全麻醉。切换到荧光激发以可视化 FP 标记轴突的原因。使用 27 号半号针头的尖端，在 L 五背根上方的硬脑膜上做一个小切口，反复灌注林格溶液，然后用棉签轻轻清洁。

确定要被压碎的部位，并拍摄整个裸露的未受损区域的图像。这将有助于在随后的成像过程中识别受伤部位。然后插入一对细镊子的一侧。

适当地关闭镊子，轻轻但牢牢地握住 L 五根的内侧部分 10 秒钟，然后轻轻松开镊子。用生理溶液反复洗涤，并用棉签轻轻清洁。以低倍率和高倍率获得整个曝光区域的多个图像，包括压碎部位和压碎前后的 DREZ。

紧密成像后，在暴露的脊髓顶部应用一块薄的合成基质膜，然后在暴露的脊髓顶部涂上人工硬脑膜，使它们精确地贴合暴露的脊髓窗口。用无菌的 five oh 缝合线闭合肌肉组织，并用伤口夹闭合中线切口。皮下注射林格溶液，并通过肌内注射每 12 小时给予丁丙诺啡作为术后镇痛，持续两天。

如前所述，用甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉动物，并取下伤口夹和缝合线。取出人工硬脑膜和合成基质薄膜贴剂，并将它们保存在含有林格溶液的无菌管中，以备后用。接下来，用 26 号针头的弯曲尖端轻轻去除任何积聚的结缔疤痕组织，并用细镊子经常用温热的振铃液灌注。

重新暴露手术区域，包括挤压部位和背根入口区，并重新定位在先前会话中成像的 YFP 标记的轴突，以便在再生过程中继续成像。这里，由彩色箭头指示的四个浅表 YFP 标记的轴突在挤压后立即显示。挤压后 3 天，所有四个轴突都延伸出一个神经突，该神经突在挤压部位生长，如挤压后 2 天 5 天所示。

神经突保持稳定，这些或其他近端轴突没有额外的生长。在第 4 天，再生神经突比幸存的轴突更薄、更暗。每两到三天对它们的尖端的这些轴突进行重复成像，持续两周，发现它们没有向前生长或缩回，而是保持不动，一些轴突的尖端和轴干肿胀。

看完这个视频，你应该对如何暴露、粉碎和观察 L 5 do 根有一个很好的了解，以便更好地理解阻止或促进轴突再生的机制。