基于细胞的钙流检测法利用FlexStation 3对TRP通道功能进行中高通量筛选
2011年8月17日
本视频提供了使用 FlexStation 3 研究人源 TRPA1 通道药理学特性的详细实验方案。该方案涵盖了细胞制备、染料加载以及微孔板读板仪 FlexStation 3 操作的各个步骤。
本实验的总体目标是演示如何使用Flex Station 3研究瞬时受体电位（trip a one）通道的药理学特性。首先在96孔微孔板中培养表达trip a one通道的细胞，以实现该目标。
在微孔板洗涤仪中洗涤细胞后，将细胞加载钙离子敏感型荧光染料。Flu oh 4:00 AM 的细胞加载过程完成后，再进行数次额外洗涤。下一步是准备化合物板，其中包括三联 a1 激动剂和潜在的三联 a1 拮抗剂。
最后一步是为Flex Station 3系统中的微孔板读数设置软件参数。最终获得的结果可显示三磷酸肌醇A1受体被氟苯甲酸激活的剂量-反应关系，以及拮抗剂化合物A的抑制作用。尽管该方法可通过测量钙离子内流来揭示21号受体的激活机制，但它也可用于研究其他钙通透性离子通道及G蛋白偶联受体的功能，结合使用钙离子敏感型荧光染料或膜电位敏感型染料。
与现有的钙成像和人工膜片钳定位等方法相比，该技术的主要优势在于这一节省时间的方法可对钙信号通路、铁离子通道及其他钙动员型受体的功能与调控进行高通量筛选。在开始本方案之前，按照书面方案所述，将稳定转染了TRPA1的HEK293细胞培养至70%至90%的汇合度。为开始钙流检测的细胞准备，使用移液器向每孔加入50微升多聚-L-鸟氨酸，对96孔板进行包被，并在37摄氏度下孵育至少15分钟。
孵育结束后，用KO的磷酸盐缓冲液冲洗细胞一次。胰酶处理后，将HEC 2 93细胞转移至15毫升无菌圆底离心管中，离心样品。弃去上清液，重悬所得的细胞沉淀。
在添加了10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基中，将100微升细胞悬液分配至96孔板的每个孔中。使用多通道移液器操作后，将培养板置于生物安全柜中静置至少30分钟，然后放入湿润的细胞培养孵育箱中孵育20至44小时。进行钙离子检测前的准备时，首先按照书面实验方案中的说明配制所需溶液。
制备后，取10 µL的1毫摩尔荧光染料Fluoh 4:00 AM与10 µL的Onic F1 27混合，将全部混合物转移至含有0.1%牛血清白蛋白的5 mL Fluoh 4缓冲液中。
接着，使用微型板洗板机，以每孔80微升的HBSS对96孔板中的细胞洗涤两次。洗涤后，使用多通道移液器向每孔加入50微升Fluo-4 AM上样溶液，并将培养板在37摄氏度下孵育1小时。在细胞上样1小时期间，准备一系列3倍浓度的激动剂溶液、一系列3倍浓度的拮抗剂溶液，以及大量含300微摩尔激动剂的Fluo-4检测缓冲液，用移液器分装。
将300微升稀释后的化合物溶液加入96孔化合物板中。尽可能将同一化合物的系列稀释液及其相应的阳性和阴性对照安排在同一列中。由于Flex station 3每次仅读取一列，因此在含有拮抗剂的每个孔旁边加入300微升300微摩尔的激动剂溶液，作为最终的细胞准备步骤。
最后一次洗涤后，使用微孔板洗涤机用氟化酸缓冲液洗涤已加样细胞三次，每次洗涤后每孔留置80微升氟化酸缓冲液。开始读板前，打开Flex Station 3系统并启动Soft Max Pro 5.2软件。
在设置中以新的文件名保存实验。选择Flex模式，并按照书面实验步骤中列出的参数，输入用于测量激动剂和拮抗剂效应的参数。接下来，将新的吸头盒、化合物板和读数板分别放入Flex工作站Three的相应托盘中。
通过点击 Soft Max Pro 软件中的读板按钮开始读板。Flex Station 三会逐列读取，并在预设的时间点自动添加化合物，且不会中断读板过程。运行完成后，可直接使用 Soft Max PRO 软件处理实验数据，或将数据复制粘贴至任意电子表格程序（如 Microsoft Excel）中进行分析。
为分析数据，需根据书面实验方案中所述方法，采用最小二乘法拟合生成TripA1激动剂氟苯甲酸（fluorophenomic acid）以及假定的TripA1拮抗剂化合物A的浓度-反应曲线。TripA1是一种可通透钙离子的阳离子通道，其激活可引发钙内流，该过程可通过钙离子敏感性荧光染料Fluo-4 AM进行检测。图中展示了在一系列不同浓度的氟苯甲酸（FFA）刺激下，荧光信号随时间变化的代表性曲线。在较高浓度下，FFA诱导的荧光增强具有比低浓度下显著更快的动力学特征，尽管其峰值荧光水平相似。
为了区分这些差异，通过测量荧光增加的初始速率来构建浓度-反应关系曲线。在加入不同浓度的游离脂肪酸（FFA）后，测定出FFA的半数最大有效浓度为55.4 µM。同时展示了候选三磷酸腺苷A受体拮抗剂化合物A对FFA诱导的钙反应抑制作用的浓度-反应关系曲线。
剂量依赖性地降低了三重A一细胞对FFA的反应，其半数最大抑制浓度为4.3 µmol。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用Flag Station Three研究三重A一及相关通道的药理学特性。
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概述
本视频演示了使用FlexStation 3研究人源TRPA1通道药理学特性的实验方案。该流程包括细胞准备、染料加载以及微孔板读板仪的操作。
关键研究组成部分
科学领域
- 药理学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- TRPA1 通道在感觉转导中具有重要作用。
- 了解其药理学特性有助于药物开发。
- FlexStation 3 是一种适用于高通量筛选的多功能工具。
- 钙敏感性染料可用于检测通道活性。
研究目的
- 提供研究TRPA1通道的详细实验方案。
- 展示FlexStation 3在药理学研究中的应用。
- 促进对TRPA1通道调控机制的理解。
使用的方法
- 在微孔板中制备表达TRPA1通道的细胞。
- 使用微孔板洗涤仪洗涤细胞。
- 用钙敏感性荧光染料（Fluo-4 AM）负载细胞。
- 制备含有TRPA1激动剂和拮抗剂的化合物板。
主要结果
- 成功使用荧光染料对细胞进行负载。
- 有效利用FlexStation 3检测TRPA1活性。
- 通过药理学分析鉴定TRPA1调节剂。
- 验证该实验方案在科研中的适用性。
结论
- 该方案为研究TRPA1通道提供了一种可靠的方法。
- FlexStation 3 是进行药理学研究的有效工具。
- 理解TRPA1的调节机制可推动治疗手段的进步。
常见问题
执行层面的行业相关性
本方案通过钙流测定实现对瞬时受体电位（TRP）通道的中至高通量药理学分析，有助于早期靶点验证和机制层面的风险评估。该方法以可重复、自动化的方式定量测定激动剂效价和拮抗剂抑制作用，为发现流程中离子通道调节剂的优先排序提供可靠的预测依据。该策略减少了对低通量膜片钳电生理技术的依赖，加快了针对感觉系统及病理生理靶点的苗头化合物向先导化合物的转化进程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过剂量依赖性钙离子内流检测TRPA1通道功能，从而在机制层面确认靶点参与。
- 操作价值：利用表达人源TRPA1的HEK293细胞建立可转化的过表达模型，用于药理学检测。
- 预测价值：生成EC50和IC50值（分别为55.4 µM和4.3 µM），以在先导化合物筛选早期支持构效关系分析。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过 Fluo-4 AM 提供定量、实时的荧光读数，实现 Z' 因子评估及检测稳健性评价。
- 通量兼容性：利用 FlexStation 3 的逐列读数功能与自动化液体转移，适用于 96 孔板格式的筛选。
- 试剂兼容性：展示钙离子敏感染料的使用以及多通道移液技术，确保染料加载和化合物递送的一致性。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：TRPA1 在伤害感受中的作用支持其作为临床前安全性和有效性筛选中疼痛通路调控机制性替代指标的应用。
- 转化连续性：通过采用相同的通量检测原理，可实现从过表达模型到天然组织验证的跨形式一致性。
- 降低风险效用：在投入膜片钳或体内模型研究之前，通过确认钙流作为功能性检测信号，可减少假阳性结果。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物优化的整个发现工作流程，可在过表达确认与次级电生理学验证之间提供一个可扩展的中间步骤。
- 发现生物学：通过将钙流作为通道激活的直接功能输出，支持对TRP通道调节的假设验证。
- 筛选：通过Flex模式下的自动加样和动力学读数，实现检测方法的标准化和可重复性。
- 分析：生成基于初始速率的浓度-反应曲线，从而在峰值幅度之外实现对激动剂效能的动力学区分。
- 转化研究：通过建立适用于多种模型系统的保守检测指标（钙流），与临床前研究相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，利用相同的染料和读板仪配置，用于筛选其他钙离子通透性通道（如TRPV1、TRPM8）和G蛋白偶联受体（GPCRs）。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接且可量化的第二信使（Ca2+）确认靶点调节作用，提供机制层面的风险降低依据。
- 操作价值：通过自动化板式读数和动力学分析，实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：生成具有明确效价阈值的早期药理学特征，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于功能效价和选择性，实现对离子通道调节剂的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、瞬时/稳定转染以及荧光染料操作方面的专业知识。
- 依赖于配备FLEX模式的FlexStation 3、SoftMax Pro软件以及微孔板洗板机，以实现液体处理的自动化。
- 需要跨团队对染料负载方案和化合物板格式进行标准化，以确保结果的一致性。
- 若应用于原代细胞或天然细胞，可能需要优化表达水平和背景荧光。
- 仅限于荧光检测；不适用于易被淬灭的染料，或干扰Fluo-4 AM激发/发射的化合物。
