Name: 从核衣壳的病毒DNA的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 学习从疱疹病毒核衣壳中分离高纯度病毒DNA的方法，采用双重Freon提取和超速离心技术。该方案可获得低宿主DNA污染的高浓度DNA，适用于高通量测序、PCR和病毒基因组研究。

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作者感谢 Greg Smith、Lisa Pomeranz、Matt Lyman、Marlies Eldridge、Halina Staniszewska Goraczniak 以及 Enquist 实验室成员在优化本实验方案过程中所做出的贡献。

1. 第一天：病毒感染与缓冲液制备
<ol>
	<li>准备5-10个组织培养皿（直径15 cm）用于感染，例如PK-15细胞用于伪狂犬病病毒（PRV）或Vero细胞用于单纯疱疹病毒（HSV）。</li>
	<li>当细胞融合度达到95%-100%时，以5-10的感染复数（MOI）进行感染。每块培养皿使用病毒储备液接种，总体积为4 ml，然后在37°C孵育1小时。每15分钟轻轻摇动培养皿一次，以确保细胞单层始终被病毒接种物完全覆盖。同时，将下一步所需的培养基预热。</li>
	<li>感染1小时后，吸除各培养皿中的病毒接种物，加入15 ml预热的培养基，并在37°C、湿润的培养箱中继续孵育12-20小时。</li>
	<li>配制LCM缓冲液（见表1），并在4°C轻轻摇动过夜以充分混匀。同时配制用于病毒DNA重悬的TNE溶液（见表2）。</li>
</ol>
第2天，第一阶段：细胞裂解与超速离心
<ol>
	<li>在显微镜下确认细胞感染已导致均匀的细胞病变效应（CPE）。继续培养直至所有细胞变圆，但尚未从培养皿上脱落。</li>
	<li>将感染的细胞用刮刀刮入培养基中，并将细胞与培养基合并至50 ml锥形管中。所需锥形管的数量取决于第1.2步中用于感染的培养皿数量，例如，每管最多可收集3个培养皿（每个含15 ml培养基）的样本。 可选步骤： 用10 ml PBS冲洗培养皿，并将冲洗液合并至细胞与培养基中。</li>
	<li>室温下以2000相对离心力（rcf）离心10分钟，去除上清液，将每管沉淀重悬于10 ml PBS中。若第2.2步中一个病毒感染样本分装至多个锥形管，此时可将这些管中的沉淀合并至同一管中。重复离心与吸除上清步骤。 可选步骤： 此沉淀可在-20°C保存，后续再继续实验流程。</li>
</ol>
3. 第二天，第二阶段：超速离心
在后续步骤中，应尽可能将细胞沉淀和LCM缓冲液置于冰上。
<ol>
	<li>向0%甘油-LCM缓冲液中加入β-巯基乙醇。开始将超速离心机冷却（用于下文步骤3.9），将其设定为4°C并开启真空。</li>
	<li>用5 ml 0%甘油-LCM缓冲液重悬细胞沉淀，直至无明显团块。如有必要，可用涡旋振荡器震荡以打散未溶解的细胞沉淀。</li>
	<li>加入1.5 ml 氟利昂（1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷）并剧烈涡旋进行抽提。立即在4°C条件下以2000 rcf离心10分钟。用宽口吸头小心吸取上层液体（避免接触界面），转移至新离心管中。可选：若沉淀呈胶状固体，可迅速将上层液体倒入新离心管中。</li>
	<li>重复一次氟利昂抽提，并再次离心。</li>
	<li>收集上层液体（约5 ml），转移至新的聚碳酸酯超速离心管中。向其余两种含甘油的LCM缓冲液中加入β-巯基乙醇。</li>
	<li>在聚碳酸酯离心管中制备梯度：将氟利昂抽提物（上层）下方小心加入3 ml 5%甘油-LCM缓冲液（中间层），再在其下方加入2.5 ml 45%甘油-LCM缓冲液（底层）。使用细口吸头以避免管内容物溢出。</li>
	<li>如有需要，使用相同比例的LCM缓冲液制备一个配平管。</li>
	<li>将离心管放入超速离心机吊桶中。通过向顶部液体层缓慢添加额外的0%甘油-LCM缓冲液（每次约50–100 μl），将各吊桶之间的质量差平衡至0.1 g以内。</li>
	<li>使用预冷至4°C的超速离心机，配备水平转子或摆桶转子，以77,000 rcf（例如SW41Ti转子为25,000 rpm）离心1小时。</li>
	<li>在超速离心过程中，制备玻璃钩以用于后续乙醇沉淀步骤（下文步骤4.6）中捕获漂浮的DNA。握住玻璃巴斯德吸管的两端，将其中段悬于火焰上方。当玻璃局部接近熔融时，轻轻拉伸使其延展，再轻柔弯曲形成一个锐角钩状（&lt;90度），然后迅速拉断以封住末端。若玻璃钩尖端开口，可将其尖端置于火焰上加热至熔融闭合。</li>
	<li>超速离心结束后，可见底部有一层薄而浑浊的沉淀，中央有深色斑点。小心吸除管内液体（包括沿管壁流下的液滴），避免触碰底部沉淀。</li>
	<li>加入0.5 ml 室温TNE缓冲液。</li>
	<li>让沉淀静置至少10分钟，使其充分水化。可选：若置于4°C环境中，沉淀也可在TNE缓冲液中过夜溶解。</li>
</ol>
第3天："幽灵" DNA 沉淀
<ol>
	<li>用小口径移液器吸头通过移液吹打使沉淀松散例如 一个200 μL移液器吸头）。此步骤无需担心剪切，因为病毒DNA此时仍包含在衣壳内。在室温下，向含有病毒沉淀的离心管中加入以下试剂以破坏衣壳：
	<ul>
		<li>4.25 ml TNE</li>
		<li>0.25 ml 10% SDS</li>
		<li>2 mg 蛋白酶K</li>
	</ul>
	轻轻摇动以混匀这些试剂。黏度应略有增加。</li>
</ol>
从此步骤开始注意避免剪切力，例如使用宽口吸头，且不要涡旋病毒材料
<ol start="2">
	<li>加入 5 ml 苯酚-氯仿以提取病毒蛋白，并立即开始倒置或涡旋，以维持乳化状态。混合 10 秒后，在室温下以 2000 rcf 离心 5 分钟。用宽口移液器吸头收集上层液体，避免接触界面，转移至新离心管中。可选： 此步骤可使用相锁凝胶（PLG）管，以避免界面污染。</li>
	<li>重复苯酚-氯仿抽提，并再次离心。</li>
	<li>第二次苯酚-氯仿抽提后，将上层液体收集至 30 ml 玻璃 Corex 管中，并在 -20°C 冰箱中预冷 10–15 分钟，注意防止冻结。</li>
	<li>加入 10 ml 预冷乙醇，盖紧管口（例如 用 Parafilm M 封口），立即倒置混匀。观察是否有 DNA“絮状物”出现，表现为细长丝状沉淀物。轻柔倒置管体进一步混匀，促使黏性 DNA 沉淀聚集形成团块。</li>
	<li>用玻璃钩捞出 DNA 絮状物。小心吸去多余液体，然后将玻璃钩（尖端朝下）放入 1.5 ml 离心管中，静置干燥。加入 0.25–0.5 ml TE 缓冲液以溶解 DNA 絮状物。让 DNA 至少重悬 1 小时。将 DNA 储存于 4°C。可选： 为最大化 DNA 产量，可将玻璃钩折断留在 1.5 ml 离心管中，使 DNA 能持续从玻璃碎片上溶解下来。</li>
</ol>
5. 典型结果
使用足够高的感染复数（MOI），细胞在感染后约18小时（hpi）应对野生型PRV毒株表现出完全的细胞病变效应（CPE），而对野生型HSV-1毒株则约在24小时（hpi）达到完全CPE（图1）。一旦收获感染后的细胞沉淀，后续实验步骤可在一天内长时间完成，或分两天进行（图2）。
在制备用于捕获DNA幽灵的玻璃钩时，应确保钩子的角度小于90度，以便后续能够插入1.5 ml离心管的底部（图3）。密封该钩子的尖端可防止DNA在移液过程中丢失。
DNA在沉淀过程中会形成“DNA幽灵”，表现为白色、呈丝状的絮状物（图4）。这些絮状物会聚集并相互粘连，或粘附在用于钩取DNA的玻璃钩上。因此，可使用同一根玻璃钩从沉淀液中收集多条DNA絮状物。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>根据所需体积选择列：</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>20 ml</td>
			<td>40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KCL</td>
			<td>1.3 ml</td>
			<td>1.9 ml</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris (pH 7.4)</td>
			<td>300 μl</td>
			<td>450 μl</td>
			<td>600 μl</td>
			<td>1.2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>75 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 EDTA</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>15 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>40 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40/IGEPAL</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>75 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇（使用前立即加入）</td>
			<td>4.3 μl</td>
			<td>6.5 μl</td>
			<td>8.6 μl</td>
			<td>17.2 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5"> </td>
</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">根据所需甘油百分比（0、5 或 45%）使用相应比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0% 甘油</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>8.3 ml</td>
			<td>12.5 ml</td>
			<td>16.7 ml</td>
			<td>33.4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% 甘油</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>1.0 ml</td>
			<td>2.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>7.8 ml</td>
			<td>11.7 ml</td>
			<td>15.7 ml</td>
			<td>31.4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45% 甘油</td>
			<td>4.5 ml</td>
			<td>6.8 ml</td>
			<td>9.0 ml</td>
			<td>18.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>3.8 ml</td>
			<td>5.7 ml</td>
			<td>7.7 ml</td>
			<td>15.4 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. LCM缓冲液的配制配方
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 ml 体积配制</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml 1M Tris, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 0.5 M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41.5 ml H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. TNE的配制 (0.1 M NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5; 10 mM EDTA)
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L 体积所需</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 g KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 g NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.15 g Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O 定容至 1 L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. PBS的配制（2.7 mM KCl；1.5 mM KH2PO4；137 mM NaCl；8.1 mM Na2HPO4；pH 7.0）
<img alt="细胞培养形态学比较，显微镜图像 A、B、C，显示细胞结构的差异。" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. PK15 细胞（A）感染前、（B）感染中期和（C）高感染复数感染后出现细胞病变效应（CPE）时的形态。
<img alt="病毒分离流程图：细胞感染、离心、提取、DNA沉淀。" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 实验方案概览。
<img alt="牙科工具、不锈钢钩、精密仪器、牙科治疗过程、牙科检查。" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 用于收集病毒DNA空壳的三种代表性玻璃钩示例。
<img alt="试管中的化学沉淀，表明反应产物的形成。" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 形成良好且数量丰富的 DNA“幽灵”的代表性示例。

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案的部分内容最初是为在BSL4条件下分离病毒DNA而开发的，但同样适用于非BSL4条件。4 我们通常使用该方案从α-疱疹病毒伪狂犬病毒（PRV）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）中分离DNA，这些病毒的DNA基因组被包裹在蛋白质衣壳内，并由脂质包膜包围。7,8 然而，该方案很可能也可直接适用于其他大型DNA病毒，包括β-和γ-疱疹病毒以及腺病毒。类似的提取方法也常用于RNA病毒。9
这种DNA制备方法的稳健性可能源于其中包含的多种纯化步骤。最初的氟利昂抽提可使脂质膜变性，从而分离细胞组分，并释放出包裹疱疹病毒衣壳的脂质包膜及外层被膜蛋白。随后进行超速离心，较重的病毒核衣壳会穿过两层梯度垫沉淀下来，从而有效地与大多数其他细胞组分分离。将这些衣壳重悬后，通过蛋白酶K和去污剂裂解衣壳，释放出病毒核衣壳DNA。两次苯酚-氯仿抽提可彻底去除核衣壳组分及任何残留的细胞蛋白。最后，通过沉淀溶液中较大的病毒DNA基因组，减少盐类或颗粒污染物的残留。
该分离病毒核衣壳DNA...

<table><tbody><tr><td>氟利昂（1,1,2-三氯-1,2,2-三氟&amp;#8211;乙烷）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>T178-4</td><td>请咨询您所在机构关于含氟利昂废弃物的适当处理指南，或参见 Mendez 等人关于潜在氟利昂替代品的研究。&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>相锁凝胶管，重型，15 ml 容量</td><td>5 PRIME</td><td>2302850</td><td>可选</td></tr><tr><td>聚烯烃超速离心管</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>331372*</td><td>*请选择适用于您所用超速离心机的管子；此处仅作示例</td></tr><tr><td>NP-40 / IGEPAL</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>PK-15 细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CCL-33</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>海克隆公司</td><td>SH30028.03</td><td></td></tr></tbody></table>

从核衣壳中制备病毒dna

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

病毒是专性细胞内寄生生物，因此研究其DNA需要将病毒成分与宿主细胞杂质及DNA分离。多个下游应用需要大量高纯度的病毒DNA，本方案可提供满足此需求的病毒DNA。这些应用包括病毒基因组测序，在该过程中去除宿主DNA对于优化病毒序列的数据产出至关重要；以及新型病毒重组株的构建，其中共转染纯化的质粒与线性病毒DNA有助于实现重组。1,2,3 
该实验流程结合提取和基于密度的离心方法，从感染细胞中分离纯化的线性疱疹病毒核衣壳DNA4,5。初始纯化步骤旨在分离出完整的病毒衣壳，这些衣壳可在去除宿主细胞蛋白和DNA的提取及离心过程中保护病毒DNA。随后裂解核衣壳以释放病毒DNA，并通过两次最终的酚-氯仿抽提步骤去除残留的蛋白质。从溶液中回收的最终DNA具有高浓度和高纯度，平均OD260/280为1.90。根据所用感染细胞的数量不同，病毒DNA的产量可达150–800 μg或更高。该DNA纯度高，可在4°C长期稳定保存。因此，该DNA非常适用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染实验。
在开始实验方案之前，需要了解每皿细胞的平均数量（例如，一个汇合的15 cm培养皿中平均有8 × 106个PK-15细胞），以及所用病毒原液的滴度（例如，每毫升1 × 108个空斑形成单位）。这些参数对于计算实验所需的感染复数（MOI）至关重要6。例如，若要以MOI为5的条件感染一皿上述PK-15细胞，需使用400 μl病毒原液，并用3.6 ml培养基稀释（即每块15 cm培养板的总接种体积为4 ml）。
可同时制备多种病毒DNA。同时进行制备的数量仅受限于超速离心机转子所能容纳的离心管数量（每种病毒一支管；参见下文步骤3.9）。此处我们以一种病毒的制备为例描述该操作流程。

我们描述了从感染细胞中分离高纯度疱疹病毒核衣壳DNA的方法。从溶液中最终捕获的DNA具有高浓度和高纯度，非常适合用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染以产生新的病毒重组体。

从核衣壳中制备病毒DNA

病毒是专性细胞内寄生生物，因此对其DNA的研究需要将病毒成分与宿主细胞的污染物及DNA分离。

本视频演示了一种从感染细胞中分离高纯度病毒核衣壳DNA的方法。首先使用两次冻融提取法使脂质膜变性。然后通过超速离心沉淀病毒核衣壳，从而将其与较轻的细胞和病毒组分分离。加入去垢剂和蛋白酶K，以从沉淀的核衣壳中释放病毒DNA。随后进行两次苯酚-氯仿抽提，以去除所有残留的蛋白质。最后，在溶液中沉淀病毒DNA。最终，实验结果表明，已从这些感染细胞中分离出高度浓缩且纯度很高的病毒DNA。该技术相较于现有方法的主要优势在于，无需进行游离DNA提取或超速离心，所获得的病毒DNA中宿主DNA的污染水平极低，因此非常适用于PCR以及病毒基因组深度测序等后续实验操作。我们最初是在重组DNA研究的早期阶段使用该方法，当时采取额外的预防措施具有重要意义。我们在生物安全四级（BSL-4）条件下于手套箱内操作，开发了该病毒DNA分离流程。本方法的可视化演示至关重要，因为密度梯度的形成以及DNA“鬼影”沉淀步骤较难掌握。其难点在于梯度分层需要极其稳定的手法，而溶液中形成的DNA“鬼影”沉淀若无先前观察经验则难以识别。开始该实验前，准备五到十个直径为15厘米的组织培养细胞培养皿用于感染。此处，当PK 15细胞生长至95%至100%汇合时，用含有伪狂犬病毒的4毫升培养基替换原有培养基。在MOI为5至10的条件下，将培养皿置于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育，每15分钟摇晃一次。轻轻摇动培养板，确保细胞单层始终完全被病毒感染液覆盖。在孵育期间，将下一步所需的培养基预热。感染1小时后，从培养板中吸除病毒接种液。然后加入15毫升预热的培养基，在37摄氏度、湿润的培养箱中孵育12至20小时。最后，为准备第二天的实验，配制新鲜的LCM缓冲液和TNE缓冲液。注意，加入NP-40会导致在acquis溶液中形成丝带状结构。将制备好的溶液置于摇床中，在 4°C 下孵育过夜。次日，溶液应已完全混合。将培养皿置于复式显微镜载物台上，通过目视确认细胞感染已导致均匀的细胞病变效应。所有细胞应变圆，但不应从培养板上脱落。如果细胞尚未变圆，继续孵育直至观察到细胞病变效应。接着，将感染的细胞刮入培养基中，并将含细胞的培养基合并至50毫升锥形管中，以提高收获量。用 10 毫升 PBS 清洗培养板，并将 PBS 与含细胞的培养基混合，然后在室温下以 2000 × g 离心 10 分钟，去除残留的培养基和血清。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于 10 毫升 PBS 中。重复离心和吸除步骤。若实验当天无法继续进行，请将细胞沉淀于 -20 °C 保存，直至用于本节所述步骤。尽可能将细胞沉淀和LCM缓冲液置于冰上。通过向0%甘油LCM缓冲液中加入Beamer capto乙醇，配制终浓度为0.043%的Beamer capto乙醇溶液，以准备超速离心。同时，将超速离心机预冷至4°C，并在降温过程中开启真空。向细胞沉淀中加入5 mL含0.043% Beamer capto乙醇的0%甘油LCM缓冲液，用移液器反复吹打以重悬沉淀。如有必要，务必将所有团块彻底分散。用涡旋振荡器处理管内物质，以打散任何未溶解的细胞沉淀。接下来，为提取细胞和病毒膜，加入 1.5 毫升裂解液。立即剧烈涡旋混匀。在4°C条件下，以2000 RCF离心10分钟。离心后，将出现两层。上层水相含有病毒核酸、衣壳和蛋白质，而下层氟利昂层含有病毒和细胞膜。使用宽口移液器吸头吸取上层水相，避免接触两相界面，并转移至新的50毫升锥形管中。注意避免触碰氟利昂层，防止将该有机溶剂带入新管中的水相层。加入氟利昂并像之前一样涡旋，离心后重复氟利昂萃取步骤。收集上层约五毫升，转移至新的聚丙烯超速离心管中。向剩余的两份甘油LCM缓冲液中加入巯基乙醇，使其终浓度达到0.043%。接下来，为了在聚合物离心管中制备梯度，使用细长的移液管将三毫升5%甘油LCM缓冲液插入氟利昂提取物下方。然后在下方再插入2.5毫升45%甘油LCM缓冲液。如有需要，可使用相同比例的LCM缓冲液制备一支相应的平衡管。将离心管放入超速离心机吊桶中，通过使用移液管逐次向顶层加入50至100微升0%甘油LCM缓冲液，使各管之间的质量差平衡在0.1克以内。在超速离心过程中，于4°C条件下以77,000 RCF离心平衡后的样品一小时。使用玻璃巴斯德移液管弯成钩状，以捕获乙醇沉淀中漂浮的DNA。用手握住移液管的两端，将中间部分悬于火焰上方。当玻璃管某一段受热变软后，轻轻拉伸以延展玻璃。轻轻弯曲形成一个小于90度的锐角钩状，并迅速拉断以封闭末端。若玻璃钩的尖端是开口的，将尖端置于火焰上方，使玻璃熔化至足以封闭尖端。超速离心后，将出现一个薄而不透明的沉淀物，其中心有一个深色斑点，含有病毒核酸。小心吸取管中的液体，包括沿管壁流下的液滴，但避免触碰管底的沉淀物。加入 0.5 毫升室温的 TNE。让沉淀物静置至少 10 分钟，以充分水合。如果次日之前不继续后续操作，需将重悬的沉淀物置于 4 摄氏度保存。使用 P 200 枪头，通过上下吹打使水化的沉淀重悬并分散。此步骤无需担心剪切，因为此时病毒 DNA 仍包含在衣壳内。为打开衣壳，向病毒沉淀中加入以下成分：4.25 毫升 TNE、0.25 毫升 10% SDS 和 2 毫克蛋白酶 EK，于室温下进行。轻轻摇动以混匀这些试剂。由于衣壳已被破坏，此时黏度应略有增加，需注意避免DNA剪切，应使用宽口吸头，且不要涡旋震荡病毒样品，以提取病毒蛋白。将样品转移至相位锁定凝胶管中，并加入5毫升苯酚-氯仿。立即开始倒置混合，以维持乳化状态，持续倒置至少10秒。随后在室温下以2000 ×g离心乳化液5分钟。离心后，取上层液体并转移至新的相锁凝胶管中。重复苯酚-氯仿抽提步骤，并在第二次苯酚-氯仿抽提后再次离心。将上层液体收集到一个30毫升玻璃离心管中，于-20°C冷藏10至15分钟。注意不要使其冻结。加入 10 毫升预冷的乙醇。用封口膜封住管口，倒置混匀。立即观察是否有DNA絮状物出现，该絮状物呈细绳状沉淀。轻轻颠倒离心管以进一步混匀，使黏性DNA沉淀聚集在一起。最后，用玻璃钩小心钩出DNA絮状物，并用无尘纸轻轻蘸吸以去除多余液体。然后将钩尖朝下放入一个1.5毫升离心管中。为最大化DNA得率，将玻璃钩在1.5毫升离心管内折断，使附着在玻璃碎片上的重悬液能够持续释放。待其干燥后，加入0.25至0.5毫升TE缓冲液以溶解DNA残留物。让DNA重悬至少持续一小时，将DNA储存在4°C。病毒DNA从核衣壳中制备，如本视频文章所述。此处展示的是一个形态良好且含量丰富的DNA“幽灵”结构的代表性示例，该结构由线性病毒基因组DNA在溶液中沉淀形成。这些DNA链聚集在一起，一旦置于水溶液中，需要一定时间才能重新水合。来自PRV毒株Becker、Bartha以及另外四种毒株的制备病毒DNA，在0.5%琼脂糖凝胶中电泳运行一小时，并用溴化乙锭染色。每个PRV样品使用一微升病毒DNA核衣壳制备物，总体积为250微升（左侧）。λ噬菌体DNA的分子量标记物。经sty I酶切的λ DNA显示未酶切λ DNA的大小为48.5千碱基对，PRV基因组DNA约为140千碱基对。接下来，通过已知浓度的λDNA梯度稀释系列可知，右侧PRV样品的浓度范围为每微升50至200纳克，每批病毒的总产量为12至50微克。DNA制备过程中，从四种PRV毒株提取的病毒DNA样品分别用BAM H I或KPN I酶切消化过夜。经限制性内切酶消化的DNA样品通过在0.8%琼脂糖凝胶中过夜电泳进行分离，并用溴化乙锭染色。H 1 泳道包含八微克病毒核衣壳 DNA，而 KPN 1 泳道包含四微克病毒 DNA。每种不同的伪狂犬病病毒（PRV）毒株均可通过其相应的限制性片段长度多态性图谱加以区分。在此方法建立之后，可进一步开展其他方法，如深度测序，以获取病毒基因组组成的相关数据。该技术的建立为病毒学领域的研究人员提供了基础，使其能够通过限制性片段长度多态性（RFLPs）、Southern 印迹、克隆重组 DNA、病毒构建以及对疱疹病毒和其他类型病毒的其他操作来表征病毒 DNA。请注意，操作甲醛（fon）可能具有极高危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如在通风橱内操作。离心后，甲醛（fon）层可能迅速从凝胶状半固体转变为液体，因此在决定倾倒或使用移液方式收集上层水相之前，应逐个评估每根离心管的状态。

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