蛋白质和细胞坐月子创建二维图案衬底
September 6th, 2011
金长链烷烃硫醇形成的自组装单层膜（SAMS）提供了定义良好的蛋白质模式的形成和细胞禁闭基板。使用一个邮票回填与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微接触印刷hexadecanethiol乙二醇终止烷烃硫醇单体生产蛋白质和细胞吸附加盖hexadecanethiol地区唯一的模式。
以下实验的总体目标是开发一种二维图案化底物，用于控制蛋白质吸收和细胞生长。这是通过使用光刻技术制造图案母版来实现的，该母版用于生产用于微接触印刷的 A-P-D-M-S 印章。作为第二步，准备图案化的金基板，这涉及微接触印刷以产生具有吸收和抵抗蛋白质区域的图案。
接下来，将蛋白质和细胞添加到底物中，以便可视化模式和研究。获得的细胞生长和行为结果显示，基于荧光和面部对比显微镜，这些图案底物上具有良好的蛋白质和细胞限制。与其他现有方法（例如蛋白质的 MicroCon 打印）相比，该技术的主要优点是乙二醇末端的单层抵抗非特异性蛋白质和细胞吸收在图案的背景下。
通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为必须针对每个打印的模型优化适当的冲压技术。要开始准备图案化的主中心，即旋转编码器上的硅晶片，并在两个周期旋转程序的初始步骤中，用丙酮冲洗晶片。在旋转程序的第二步中，丙酮将蒸发，在旋转开始时留下干净、干燥的晶圆，将光刻胶涂在晶圆上，然后使用前面描述的条件进行旋转涂层。
使用高均匀度的热板在 110 摄氏度下软烘烤涂有光刻胶的晶圆两分钟。下一张照片图案。使用掩模对准系统和适当的掩模涂覆光刻胶的晶圆。
首先，将基板放在掩模对准器的真空车上。然后将掩模插入支架托盘并打开真空以将掩模固定到位，以确认掩模与基材之间接触良好。抬起基材，直到它与蒙版相遇。
使用对准器的光学元件确认已进行良好的接触。最后，打开灯，通过光刻掩模将基板暴露在紫外线下。在显影液中轻轻搅拌，将图案化的晶圆显影 1 分 45 秒。
用半导体级去离子水彻底冲洗，并使用带有紫外线滤光片的显微镜用氮气检查图案显影流干燥。通过准备 10 比 1 重量的树脂固化剂来开始此过程。雪茄 180 2 完全混合。
在真空干燥德加中，用一次性培养皿中的混合物覆盖照片图案化的晶圆，PDMS 覆盖母版，直到看不到气泡。确保母版在盘子的底部后，让印章在 65 摄氏度的烤箱中固化 1.5 小时。当 PDMS 印章固化后，将印章从母版上切下并将其修剪成合适的尺寸。
将邮票存放在有盖的容器中，特征面朝上，以防止其免受灰尘和碎屑的影响。为了准备用于金属沉积的基材，首先用氧气等离子体处理圆形玻璃盖玻片 10 分钟。然后用去离子水冲洗盖玻片两次，用水冲洗后用两次冲洗之间的氮气流干燥，再次用乙醇冲洗两次，在两次冲洗之间用氮气流干燥。
使用多口袋电子束沉积系统，沉积 50 埃钛，然后沉积 150 埃金。不要在钛层和金层的沉积之间夹住蒸发器。用乙醇冲洗 PDMS 印章并彻底干燥。
用氮气，将冲压液滴加在印章上，直到完全涂覆。用氮气彻底擦干印章。HEXA Decane 文件的微接触打印取决于 PDMS 印章的特性，是该程序中最困难的方面之一。
成功的冲压需要开发一种施加均匀压力的良好技术。在冲压过程中。对于在空气中进行的传统微接触印刷，将印章轻轻压在金基材上，并让单层形成 15 秒。
或者，对于由非常小的特征和高纵横比组成的图案，将金基底放入装有 18.2 兆奥姆去离子水的培养皿中，确保基底被浸没。然后轻轻地将印章压在金基材上，让单色形成一层 15 秒。接下来，用乙醇冲洗冲压基材两次，用氮气干燥。
每次冲洗后，将底物放入培养皿中，并用回填溶液覆盖底物。用 param 密封培养皿以防止蒸发。让背景单层在黑暗中形成 12 到 14 小时。
最后，从背填充溶液中取出带图案的盖玻片，每次冲洗后用乙醇用氮气干燥冲洗两次。要将蛋白质涂在有图案的盖玻片上，请将盖玻片放入小培养皿或细胞培养室中，用 500 微升至 1 毫升的 delcos 磷酸盐缓冲盐水覆盖。在蛋白质孵育过程中，DPBS 必须完全覆盖底物。
为确保蛋白质覆盖均匀，向 DPBS 中加入浓缩的蛋白质溶液，并通过移液数次混合溶液。将蛋白质混合物与底物在 37 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，用 DPBS 彻底冲洗底物以去除未结合的蛋白质，注意不要干燥底物或使其通过空气水界面。
冲洗 3 次后，吸出 DPBS。然后加入大约 500 μL 的完整细胞生长培养基，以保持湿润的底物。更换用于冲洗基质的生长培养基。
使用新鲜培养基，底物现在可以用细胞进行电镀。通常每平方毫米 30 到 200 个细胞接种到基材上。这张图片显示了在显微镜下将邮票特征面朝下放在玻璃盖玻片上，比例尺为 100 微米，从而在显微镜下观察 A-P-D-M-S 邮票。
适当的冲压会产生清晰、清晰的蛋白质模式，这可以通过应用荧光标记的蛋白质（如 LOR 6 47 标记的纤连蛋白）来可视化。此处显示了 chk one 细胞对蛋白质模式的限制。在这些图像中，比例尺为 100 微米。
或者，免疫组化可用于可视化 SU 固定后的蛋白质模式。在这里，LOR 三 50 偶联的抗层压板抗体用于可视化体外四天显示的 E 18 小鼠海马神经元播种的图案化层压板 用 MIT 追踪器红色五 80 染色的 E 18 小鼠海马神经元表明细胞生长很好地局限于蛋白质模式。虽然这项技术很容易掌握，但可能会出现一些常见问题，如 LOR 6 47 偶联纤连蛋白吸收所显示的这些模式底物制备所说明的那样。
在 DPBS 中未充分混合浓缩蛋白质溶液而施用蛋白质会导致蛋白质模式不均匀。不正确的冲压会导致部分图案转移或冲压塌陷。此外，将含有吸收蛋白质的图案底物暴露在空气中会破坏单层，导致电阻降低。
在背景中，浸没式图案可以产生具有小特征的图案，而这些图案是传统微接触印刷和空气难以打印的。这两个图像显示了在空气中使用同一 PDMS 印章打印的同一图案的不同区域，或者左图中显示了去离子水支撑线，以表明只有图案的小特征未能成功打印。比例尺为 20 微米一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 18 到 24 小时内完成。
看完这个视频，你应该对如何制作图案基材有一个很好的了解。制作 A-P-D-M-S 邮票。利用微接触打印制备图案金基材，并使用蛋白质和细胞可视化该图案。
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概述
本研究专注于开发一种二维图案化基底以控制蛋白质吸附和细胞生长。该技术利用微接触印刷技术创建蛋白质和细胞限制的明确区域。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物材料
背景
- 自组装单分子层（SAMs）被用于创建基底。
- 十六烷基硫醇被印刷到金基底上。
- 该技术允许选择性蛋白质和细胞吸附。
- 乙二醇端基单分子层能抵抗非特异性吸附。
研究目的
- 开发能够控制蛋白质吸附的基底。
- 以图案化的方式促进细胞生长。
- 在这些基底上可视化和研究细胞行为。
使用的方法
- 光刻技术用于制作图案化的母模板。
- 使用PDMS印章进行微接触印刷。
- 准备图案化的金基底。
- 使用荧光和相差显微镜进行可视化。
主要结果
- 成功将蛋白质和细胞限制在特定区域。
- 使用显微镜技术可视化图案。
- 相比传统蛋白质印刷方法表现出优势。
- 在背景区域有效抵抗非特异性吸附。
结论
- 图案化基底为研究细胞行为提供了可靠的方法。
- 该技术增强了对蛋白质和细胞相互作用的控制。
- 在组织工程和再生医学中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Two-dimensional patterned substrates created via microcontact printing enable precise spatial control of protein adsorption and cell confinement, directly supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. This platform enhances predictive confidence in cell-based assays by standardizing microenvironments and reducing variability in cellular responses. The method's reproducibility and scalability position it as a reusable capability for portfolio-wide assay development and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell behavior and protein interactions in defined microenvironments.
- Supports functional target validation by confining cells to reproducible patterns.
- Facilitates mechanistic de-risking by minimizing non-specific adsorption and background noise.
- Improves predictive confidence for downstream biological readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated patterned substrates for robust, quantitative cell-based assays.
- Standardizes assay conditions by controlling adhesive and non-adhesive regions.
- Enhances reproducibility and scalability for high-content screening workflows.
- Enables reliable evaluation of compound effects on spatially confined cells.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell behavior studies with disease-relevant microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling controlled cell patterning.
- Reduces translational risk by providing consistent, quantifiable outputs for biomarker studies.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on standardized cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
This patterned substrate method integrates from early discovery through assay development and preclinical research, supporting hypothesis testing and quantitative analytics across the pipeline.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven studies of protein and cell interactions in controlled patterns.
- Screening: Delivers assay-ready substrates with reproducible, quantitative outputs for compound screening.
- Analytics: Enables precise measurement of cell confinement and protein adsorption for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking tissue-relevant spatial organization.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable substrate preparation workflow for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Standardizes substrate preparation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing assay variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, microcontact printing, and surface chemistry.
- Needs access to cleanroom facilities, mask aligners, and analytical microscopy.
- Demands cross-team standardization of stamping and substrate preparation protocols.
- Adaptable to various cell types and protein systems with optimization.
- Pattern fidelity and reproducibility depend on operator skill and environmental control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Preparation of the Patterned Master
2:30
Preparation of PDMS Stamp
3:11
Preparation of the Patterned Gold Substrate
5:08
Applying Protein and Cells to the Patterned Substrate
6:12
Results of Creating Two-Dimentional Patterned Substrates
8:06
Conclusion
