Name: 畸胎瘤代睾丸胶囊 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学习畸胎瘤检测方法，通过将人诱导多能干细胞注射到免疫缺陷小鼠睾丸被膜中，评估其多能性。该方法可验证细胞分化为三个胚层的能力，是干细胞生物学和再生医学领域的金标准技术。

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本工作由 CIRM 基金（编号：TR-1250、RT1-01108 和 CL1-00502）资助。

注意：所有动物实验操作必须经过 IACUC 或同等机构批准。
所有外科手术器械必须在手术前进行灭菌。须使用无菌手套、手术单和纱布。
1. 手术前准备
<ol>
	<li>获取6周龄的Mus Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID/J雄性小鼠，或其他免疫缺陷型小鼠品系。</li>
	<li>对所有手术器械、手套和纱布进行灭菌处理。</li>
	<li>使用accutase将待注射的人多能干细胞（hPSCs）解离。</li>
	<li>计数细胞，并将1,000,000个细胞重悬于20–30 μL Matrigel与DMEM/F-12以1:1比例稀释的混合液中。细胞处理完成后置于冰上保存。</li>
	<li>注意：在正式实验前，建议先进行一次预实验，注射台盼蓝（Trypan Blue），以帮助识别潜在问题，避免浪费细胞。</li>
	<li>在动物实验室内，根据所在机构认可的操作规程对小鼠进行麻醉。在我们的实验中，使用异氟烷麻醉机。小鼠首先置于诱导室中，氧气流速为1 L/min，异氟烷浓度为3–4%。麻醉后，改用鼻罩维持麻醉，氧气流速为1 L/min，异氟烷浓度为2–3%。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除腹部毛发，并从腹壁中心开始顺时针向外清洁腹前壁。先使用聚维酮碘溶液擦拭，再用70%乙醇冲洗。重复此过程3次，每次更换新的棉签。将动物转移至加热垫上，在组织培养罩或解剖罩内保持体温。</li>
	<li>使用无菌手术剪在髋关节稍下方沿纵轴方向切开皮肤和腹膜，切口长约1 cm。</li>
	<li>用镊子夹住腹膜，另一把无菌镊子伸向右侧髋部，将白色脂肪组织连同附着的睾丸轻轻拉出。</li>
	<li>将睾丸置于无菌纱布上。</li>
	<li>用结核菌素注射器或Hamilton（1 mL）注射器吸取待注射的hPSC悬液。建议同时设置一个已知具有多能性的对照hPSC细胞系（如WA09，也称为H9），以便作为阳性对照，用于判断注射或手术操作是否存在缺陷。</li>
	<li>缓慢将hPSC悬液（20–30 μL）注射至睾丸被膜中心部位，避开主要血管，若观察到睾丸被膜开始肿胀，应立即停止注射。</li>
	<li>缓慢拔出针头，以避免细胞回流。</li>
	<li>使用镊子将睾丸及脂肪组织复位至腹腔内的原始位置。</li>
	<li>使用2–3针可吸收缝线缝合腹膜，皮肤切口使用自动夹具（autoclips）闭合。</li>
	<li>术后应将小鼠保持温暖直至苏醒，并在术后1–2天内每天给予两次镇痛药物（请参照所在动物实验设施认可的药物）。 
	注意：所使用的麻醉剂和镇痛剂不会干扰肿瘤的形成。</li>
	<li>术后监测动物6–12周以观察肿瘤生长情况。极少数情况下，注射后6周内肿瘤可能已长至5 mm，因此密切监测动物状态至关重要。若出现此情况，应立即实施安乐死，并按常规流程对肿瘤进行处理和分析。</li>
	<li>当肿瘤可触及且大小达到约5 mm时，根据机构认可的动物实验操作规程对小鼠实施麻醉并处死。</li>
	<li>取出肿瘤并进行相应记录——拍照、测量尺寸、称重。</li>
	<li>将肿瘤切成小块，置于4%多聚甲醛溶液中固定。固定后样品保存于4%多聚甲醛中，直至送至病理科进行切片、染色和分析。</li>
</ol>
2. 代表性结果：
若按照所述方案操作，且所注射的细胞系具有多能性，则最迟在12周内应形成可触及且肉眼明显的肿瘤。对于WA09等已建立的hPSC细胞系，我们通常在6周内即可观察到肿瘤。对于iPSC细胞系，通常在8至10周内出现肿瘤也属正常现象。为确保操作步骤正确无误，必须同时注射已知具有多能性的细胞系作为阳性对照。肿瘤通常外观高度异质，并带有多个附着的囊肿（图1）。经病理学家对肿瘤样本进行分析后，应可见来自三个胚层的分化组织（图2）。
<img alt="小鼠肿瘤活检；肿瘤生长分析；科学实验结果。" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在睾丸白膜中由人多能干细胞（hPSC）形成的典型畸胎瘤。
按照所述方案，将一百万个WA09细胞注射到免疫缺陷小鼠的睾丸被膜内。六周后观察到畸胎瘤的形成。A）从小鼠体内取出的畸胎瘤。B）畸胎瘤的近距离图像。注意其异质性及囊性结构。
<img alt="胚胎胚层示意图：外胚层、中胚层、内胚层组织结构比较。" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 畸胎瘤的苏木精和伊红染色切片显示来自各胚层的组织。 
固定后，对畸胎瘤进行切片并用苏木精和伊红染色。病理学家分析结果显示存在来自三个胚层的细胞。

<ol><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154(1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li>
<li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li>
<li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li>
<li>Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).</li>
<li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li>
<li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells%3A+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li>
<li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cells.+Dev%22%5BJournal%5D)">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li>
<li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的方法提供了一种在睾丸被膜中由人多能干细胞（hPSCs）高效、可靠且直接地生成畸胎瘤的手段。该技术包含若干关键参数。尤其重要的是，应注射已知具有多能性的hPSC细胞系作为对照。其他重要参数包括注射后至肿瘤出现的观察时间间隔。对于WA09这类细胞系，通常在6至8周内可观察到畸胎瘤；而对于新建立的诱导多能干细胞（iPSC）系，我们发现通常需要10周时间。另一个需关注的因素是注射的细胞数量。我们注射一百万个细胞，但该检测也可使用更少数量的细胞轻松完成。此外，注射所用的介质也至关重要。我们发现，将细胞悬浮于Matrigel与DMEM/F-12以1:1比例混合的溶液中进行注射，效果最佳，优于使用PBS或单独的DMEM/F-12。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>113300-032</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

睾丸被膜内畸胎瘤生成

Teratoma Generation in the Testis Capsule

多能干细胞（PSCs）具有独特的特性，即能够分化为三个胚层来源的所有细胞类型。这使得它们成为治疗多种疾病的一种潜在重要工具。随着诱导性多能干细胞（iPSCs）的出现以及人类胚胎干细胞（hESCs）研究的持续进展，迫切需要建立能够证明特定细胞系具有多能性的检测方法。生殖系传递（germline transmission）一直是验证小鼠胚胎干细胞（mESC）系多能性的金标准1,2,3。通过该检测，研究人员可证明某一mESC系能够生成胚胎中的所有细胞类型，包括生殖细胞4。随着人类胚胎干细胞系的建立5,6，如何恰当验证这些细胞的多能性尚不明确，因为人类胚胎干细胞无法进行生殖系传递检测。因此，目前采用畸胎瘤检测作为替代方法，用于证明人类多能干细胞（hPSCs）的多能性7,8,9。尽管该检测方法近年来受到一定质疑，且新的技术正在积极探索中，但畸胎瘤检测仍是当前公认的金标准7。在该检测中，将待测细胞注射到免疫缺陷小鼠体内。若细胞具有多能性，则最终会形成畸胎瘤，且肿瘤切片中可观察到来源于三个胚层的组织10。在畸胎瘤检测中，hPSCs可注射至小鼠体内的不同部位，最常见的注射部位包括睾丸包膜、肾包膜、肝脏，或腿部的皮下及肌肉内11。本文中，我们描述了一种利用睾丸包膜作为肿瘤生长部位，由hPSCs生成畸胎瘤的可靠实验方案。

人类多能干细胞（hPSCs）具有治疗多种不同疾病的可能性。这些细胞的应用价值在于它们能够分化为体内任何类型的细胞。本文中，我们介绍用于证明hPSCs多能性的畸胎瘤实验方法。

多能干细胞（PSCs）具有独特的特性，能够分化为源自全部三个胚层的细胞。这使得它们成为……

本实验的总体目标是通过将人多能干细胞（H PSCs）注射到免疫缺陷小鼠的睾丸被膜下以形成畸胎瘤，从而检测细胞的多能性。首先，收集待检测多能性的疑似 H PSCs 细胞培养物。随后进行手术暴露小鼠睾丸，并将细胞注射至睾丸被膜内。将睾丸放回其原始位置，并在六到十二周后手术缝合小鼠背部，通过组织学检查所形成的肿瘤，观察是否存在来自三个胚层的细胞。最终，通过证明该 HPSC 细胞系能够在免疫缺陷小鼠体内分化为来自全部三个胚层的细胞，即可证实其具有真正的多能性。尽管近期已有新方法被报道用于验证人类干细胞的多能性，畸胎瘤实验仍是该领域的金标准。本实验操作由本实验室高级技术员 Tron 演示。将人多能干细胞培养至汇合，然后使用Accutase消化H PSEs，计数细胞并重悬，每注射含有100万个HPC。首先，使用剃毛器剃除6周龄雄性免疫缺陷小鼠腹部的毛发。用聚维酮碘溶液清洁小鼠腹部前壁，从腹部中心开始，顺时针方向向外擦拭。然后用70%乙醇擦拭剃毛区域。重复此过程三次，每次更换棉签。进行手术操作时，将动物转移至无菌操作台内的加热垫上，并使用无菌手术剪。用镊子夹住腹膜，在髋关节下方水平处的皮肤和腹膜上做一个一厘米长的纵向切口。用另一把无菌镊子伸向右侧髋部，将白色脂肪组织连同附着的睾丸一起拉出。现在用一支1毫升结核菌素注射器吸取待注射的hPSCs，缓慢地将20至30微升的hPSCs注入睾丸白膜的中心部位，避开任何主要血管。使用镊子缓慢拔出针头，以避免细胞回流。将睾丸和脂肪组织移回腹腔内的原始位置。用两到三根可吸收缝线缝合腹膜，并用自动夹闭器关闭皮肤。术后根据需要每天给予两次镇痛处理。在6至12周内监测动物是否有可触及的肿瘤生长。当肿瘤直径达到约5毫米时，处死小鼠并取出肿瘤进行记录。拍摄肿瘤照片并测量其大小和重量。然后将肿瘤切成小块，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理学分析。通常在6至12周后可观察到畸胎瘤。在此示例中，将一百万个WA oh九人源多能干细胞注射到免疫缺陷小鼠的睾丸被膜内。对畸胎瘤进行仔细观察，可见其具有异质性，并存在多个附着的囊肿。结果符合预期。组织病理学分析表明存在来自三个胚层的细胞。在进行该实验操作时，重要的是要包含一个已知具有较强分化潜能的阳性对照细胞系，以确保实验操作正确无误。观看本视频后，您应能够清楚地了解如何判断一个人类干细胞系是否具有多能性。

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