Name: PDMS的设备制造和表面改性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T15:22:25.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学习使用免疫亲和捕获微流控设备分离中性粒细胞并进行基因组分析的方法。该技术已在多家医院应用，可高效分离细胞并提取高质量RNA用于下游研究。

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作者无任何利益冲突需要披露。

pdms 器件制备与表面修饰

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS 器件制备与表面修饰

我叫Ken Kotz。我是隶属于麻省总医院的生物分子资源中心的一名博士后。我的主要研究项目是利用带有微流控结构的免疫亲和捕获装置来分离中性粒细胞。我们在全国五家不同的医院使用该设备来分离RNA，用于下游基因组分析。基本结构是在硅片上有一层SU-8光刻胶作为模具。我们将在该模具上浇注双组分弹性体A-P-D-M-S，该PDMS将形成一个铸模。将母模从其容器中取出，并放入培养皿中。用胶带将母模固定在培养皿底部。在天平上称取一定量的PDMS、固化剂和基础树脂的混合物。比例为一份固化剂配十份树脂。通常情况下，对于已经裁切好的器件，我们称取20至30克树脂以及相应2至3克的固化剂。将固化剂和树脂倒入小的塑料容器后，使用标准的塑料叉子将两者混合均匀。需要确保充分剧烈混合，并将混合物上下翻拌，以保证固化剂在树脂中均匀分布。通常，我们会通过观察气泡的数量来判断两者的混合程度，目标是使微小的气泡在整个弹性体中均匀分布。然后将PDMS倒入培养皿中的SU-8模具上。将带有PDMS的模具放入真空干燥器中，抽真空以去除混合其中的空气。通常，脱气过程需要30分钟至1小时。脱气后，我们将装置从真空室中取出，并置于65至80摄氏度的烘箱中。在此温度范围内的最短固化时间为3至6小时。在我们实验室中，通常会将装置在烘箱中放置过夜。通常，我们使用11号外科级钢刀。从硅胶母版边缘向下约半厘米处开始，进行直线切割，并沿母版边缘切割成一个较大的圆盘。将PDMS模具从母版上剥离，并将带有微结构的一面朝上放置于洁净的培养皿中。将脱模后的模具从培养皿中取出，使用刀片或安装在直线导轨上的刀片将其放置到切割表面。对模具上包含的器件进行切片。每个切片后的器件随后被放回培养皿中，以进行后续处理。通常，为了使我们的装置与液体连接，需要在PDMS装置上打孔。我们用来打孔的装置是一个标准的3毫升注射器。该3毫升注射器的尖端是一根钝头不锈钢针。不锈钢针头内部有一根与针头内径相匹配的金属丝，该金属丝连接在注射器的推杆上。通过向后拉动推杆并回缩针头，即可在PDMS上打孔或插入柱塞。翻转PDMS装置后，通过推动推杆将其推出。打孔装置的关键在于尽可能保持压杆垂直，且完全不要旋转打孔装置。当您在PDMS上打孔时，用一对镊子将整个装置、即整个PDMS装置提起，翻转过来，然后通过下压压杆将孔塞推出。再用一对镊子夹住孔塞并将其丢弃。然后再次回拉活塞，将装置翻转回原位并抽出切割装置。重复此操作，直至完成所有孔的打孔。接下来进行键合过程，我们将PDMS装置键合到玻璃载片上。对于我们的装置，我们将通过不可逆键合或共价连接的方式将聚二甲基硅氧烷（PDMS）固定在玻璃载片上。实现这一过程的方法是将它们放入等离子体灰化仪中，并暴露于活性氧等离子体。具体操作步骤如下：取PDMS装置并将其放置在等离子体灰化仪的托盘上。将设备的特征面朝上放置，您可以使用任何标准的玻璃显微镜载玻片。我们使用略加放大的1.5英寸显微镜载玻片以适配我们的设备。载玻片可直接从包装中取出使用。我们倾向于使用piranha溶液对其进行处理，以清除玻璃载片表面可能存在的任何有机污染物。将器件和玻璃载片放置在等离子体灰化仪的托盘上后，将托盘推入等离子体灰化仪中，并使其暴露于活性氧等离子体中。完成等离子体灰化仪的程序后，我们打开腔室，将载有器件的载板取出并移至实验台面。使用镊子小心地提起PDMS器件，注意避免手指接触键合表面。将键合面翻转至载玻片的玻璃表面，然后确保PDMS与玻璃载玻片之间无任何气泡存在。将已键合到玻璃上的PDMS装置置于热板上，在65至75摄氏度下加热10分钟，以实现更佳的化学键合。在本节中，我们将在洁净室完成键合后，对PDMS和玻璃表面进行化学修饰。此时，PDMS表面含有活性的OL基团。该活性表面具有亲水性，但这些基团最终会扩散至PDMS本体内部。因此，表面化学修饰最好在等离子体处理后立即进行。我们将使用体积分数为5%的巯基丙基三甲氧基硅烷溶液。该溶液为5%的体积比，基本操作是将其注入入口，并确保完全充满整个装置，不得残留任何气泡。如果存在任何气泡，需用镊子将其排出。在注射完slan后，静置15至30分钟。在室温下，通常在反应进行10分钟后，再次注入第二份slan。在硅烷反应约半小时后，我们将使用三到四个设备体积的纯乙醇冲洗所有装置。排出的过量液体只需用化学擦拭纸擦去即可。在冲洗完装置后，我们将装置取出并放置在设定为100°C的加热板上，使其中残留的乙醇基本完全蒸发。这有助于使硅烷化表面更加均匀。设备干燥后，可在干燥条件下保存数月，或者也可立即进行下一步操作。设备固化后，玻璃和PDMS表面均会形成一层硅烷涂层。该硅烷为一种含巯基的硅烷偶联剂，可与异双功能交联剂GMBS发生反应。将其稀释于纯乙醇中。该物质遇水会发生反应，因此需注意避免接触水溶液环境。我们将它注入器件中，并用镊子去除所有气泡（如此处所示），以确保所有表面均与该分子充分接触。将其覆盖后反应半小时。GMBS 反应半小时后，我们将用去离子水冲洗装置，以去除装置中残留的乙醇。然后将链霉亲和素（neu travain，即生物素结合蛋白）流过装置。然后将中性链霉亲和素预稀释至浓度为每毫升10微克。如果意外将空气注入装置中，则需要用乙醇重新冲洗装置，以有效去除所有空气。乙醇对装置表面的润湿性更好，可帮助去除意外引入装置中的任何气泡。在用去离子水冲洗装置后，通常会使用两到四个装置体积的稀释中性链霉亲和素溶液填充装置。螺母装置将与固定在螺母装置表面的GMBS发生反应。该过程可在室温下进行一小时。通常情况下，我会将装置置于4°C的冷藏室中过夜。然而，在添加抗体之前，我们需要冲洗掉溶液中任何未结合的腺苷（Aden）。我们使用 PBS 中稀释的 1% BSA 溶液进行冲洗。由于这些芯片将用于下游的基因组分析，我们所使用的所有溶液均为无 RNA 酶的。通常，我们会用四到五个柱体积的1% BSA溶液冲洗装置，随后加入抗体。本实验所用的抗体为CD66B，可特异性结合全血中的粒细胞。我们使用的浓度范围为每毫升10至25微克，并将注入抗体。每个装置中注入200微升抗体，分两次注射，每次100微升，分别注入装置的两个入口。通常，我们会向一个端口注入100 µL，等待30分钟，然后向对侧端口再注入额外的100 µL。

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