Name: 自体内皮祖细胞播种技术和生物相容性在大动物模型的心血管设备的测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 了解自体血管内皮祖细胞播种技术，用于测试心血管设备的生物相容性并预防血栓形成。该方法通过将患者来源的EPCs种植于钛管植入猪下腔静脉，为血管植入物提供抗血栓保护。

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作者谨此感谢徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）在钛切片成像方面的宝贵建议，以及吉米尼生物制品公司（Gemini Bio-Products）为本研究提供猪血清。我们还感谢美国国立卫生研究院（NIH）通过资助项目“自体EPC衬层以提高循环辅助装置的生物相容性”（项目编号：RC1HL099863-01）提供的支持。此外，我们感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金对Alexandra Jantzen的资助。我们还要感谢George Quick、Mike Lowe和Ianthia Parker在手术操作及实验动物管理的多个环节中提供的协助。Steven Owen在加工细胞接种装置的多个部件以及切割钛管方面提供了不可或缺的技术支持。

1. 内皮祖细胞的分离
<ol>
	<li>在EPC接种管植入前30天，准备一支60 ml注射器，加入15 ml抗凝剂枸橼酸葡萄糖溶液A，并连接三通阀，用于从猪外周血中分离EPC。在采血前24小时，用I型大鼠胶原蛋白预包被两块12孔板。50 μg/ ml，溶于0.02 N乙酸溶液中）4.</li>
	<li>所有动物饲养和实验操作均须遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定，并在获得机构动物护理与使用委员会批准后方可进行。</li>
	<li>使用乙酰丙嗪（1.1 mg/kg）和氯胺酮（22 mg/kg）通过19 G蝶形针经肌肉注射，对一头雌性约克夏猪（45 kg）进行镇静。</li>
	<li>使用气管插管（长度30 cm，内径8 mm）对猪进行插管，并通过面罩以4.5 %潮气量的异氟烷进行麻醉。</li>
	<li>在操作过程中通过监测血氧饱和度、心率和体温来监控猪的状态。使用自动加热手术台和加热毯，并对输注的液体进行加温，以维持体温调节。</li>
	<li>将猪仰卧位固定于手术台上，向后外侧固定其后肢，用氯己定清洁后，再用 DuraPrep 进行消毒。随后对手术区域进行铺巾。</li>
	<li>从5 F微导管引入套件中取出一支21 G × 7 cm的针头，于可触及的股动脉搏动点内侧（位于股内侧肌内侧、股薄肌外侧）穿刺股静脉，采用Seldinger技术行静脉插管。将准备好的60 ml注射器连接至血管内导管，抽取45 ml血液。</li>
	<li>对血管穿刺部位施加压力以止血（5 分钟），停止麻醉并使猪苏醒。动物需监护至完全恢复后送回笼中。</li>
	<li>用不含 CaCl₂ 的 Hank's 平衡盐溶液将血液样本按 1:1 比例稀释2，MgCl2，MgSO₄4) 并加入等体积的 Histopaque 以形成清晰的分层。离心（30 分钟，740 g，低刹车设定），收集单个核细胞（MNC）层。将 MNC 重悬并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 3 次（每次 10 分钟，515 g），随后接种至两块 12 孔板中，每孔加入完全生长培养基（EBM-2 培养基含 2% 猪血清（PS）和 EGM-2 SingleQuots） 37°C，5 % CO2.</li>
	<li>在最初7天内每24小时缓慢更换培养基，之后每隔一天更换一次。在平均培养时间后鉴定EPC集落 
	7天图2).</li>
	<li>当内皮祖细胞（EPCs）在12孔板中覆盖约1/4孔底表面积时，进行传代培养。通过流式细胞术检测表面标志物CD31的表达以及CD14和CD45的缺失，以确认EPC的身份。其他可选检测项目包括细胞形态学观察以及在流体剪切应力刺激后检测一氧化氮III活性。4.</li>
</ol>
2. 钛管组件
<ol>
	<li>在立式铣床上，使用安装在锯轴上的72齿HHS纵切锯，将一根Ti管沿纵向切成3个相等的120度部分（每段长4.5 cm），切割时转速保持在300 RPM，并在整个切割过程中始终用Tap Magic切削液充分润湿切割区域（图3）。</li>
	<li>使用台式砂轮机和Scotch-Brite金属研磨轮对Ti管内表面进行抛光，然后用手持方式使用3M砂布进一步打磨，以使表面更加平滑均匀，去除所有可见的凹坑。</li>
	<li>先用Alconox洗涤剂溶液清洗Ti部件，随后将其浸入王水（浓硝酸与浓盐酸按1:3体积比配制）中5分钟，再用数升去离子水冲洗10。务必极度小心，王水具有强腐蚀性，且可能引发爆炸！</li>
	<li>将Ti段在Alconox洗涤剂溶液中超声处理16分钟，然后在去离子水中漂洗30次，并再次在去离子水中超声处理16分钟。之后置于层流罩中自然干燥。</li>
	<li>将PVC热缩管裁剪为4.5 cm长度，并按照2.4节方法进行彻底清洗。</li>
	<li>用镊子将3个已清洗的Ti段放置在支撑芯轴（由铝加工而成，外径8.5 mm）上，再将一段PVC热缩管套在Ti段外部（图4）。使用热风枪加热热缩管，同时旋转芯轴，使热缩管均匀收缩，紧密包裹住Ti段并将其牢固固定在一起。</li>
</ol>
3. 接种装置及组件组装
<ol>
	<li>将硅胶管分别切割为2.5 cm和3.5 cm的长度。</li>
	<li>在5 cc塑料注射器的0.8 ml刻度处截断，保留带有鲁尔接头的一端，即“头部部件”。</li>
	<li>按照2.4节所述方法，通过超声清洗彻底清洁两段硅胶管、注射器“头部部件”以及一个鲁尔帽。</li>
	<li>将2.5节组装好的钛管两端各连接一段硅胶管，使硅胶管在聚氯乙烯（PVC）管外延伸5 mm。</li>
	<li>将注射器“头部部件”的切割端插入较短的硅胶管中，使其与钛管紧密接触（图5）。</li>
	<li>用特卫强袋将组装完成的钛管组件与一个鲁尔帽一同封装，并采用环氧乙烷气体灭菌（55°C下18小时）。</li>
	<li>将一个同步定时电机（10 RPH）安装在有机玻璃平台上，并将其轴连接至注射器固定架（由铝材加工而成，适配5 cc注射器）（图6）。</li>
</ol>
4. 内皮祖细胞接种于钛管内表面
<ol>
	<li>将第 1. 步中分离的内皮祖细胞（EPCs）扩增至3个融合的T-75培养瓶（或至少9 × 106 个细胞）。</li>
	<li>手术当天，使用长效荧光染料（PKH26）11 对细胞进行标记。首先用无血清培养基冲洗培养的EPCs两次。标记过程中及之后需注意避光，以保护细胞。</li>
	<li>在室温下，用4 μM PKH26溶于稀释液C（染料溶液）中覆盖细胞，孵育4分钟。</li>
	<li>加入与染料溶液体积相等的猪血清以终止标记反应。1分钟后，再用完全生长培养基将混合液按1:1比例稀释。</li>
	<li>吸除液体，并用完全生长培养基清洗细胞3次。</li>
	<li>用不含CaCl2和MgCl2的DPBS洗涤EPCs两次。</li>
	<li>加入胰蛋白酶覆盖细胞，在37°C孵育3分钟，并在光学显微镜下确认细胞脱落。加入双倍体积的胰蛋白酶中和液终止消化。</li>
	<li>将细胞悬液合并至同一离心管中，通过移液混匀。取10 μl细胞悬液加入血细胞计数板两侧进行细胞计数。</li>
	<li>离心细胞悬液（1500 RPH，5分钟）。计数后，将细胞沉淀重悬于无血清培养基中，浓度为2–2.5 × 106 EPCs/mL。注意填充管组件所需的最小体积为4.5 mL。</li>
	<li>在生物安全柜内铺设无菌巾以建立无菌区域。将经气体灭菌的钛管组件及额外的5 mL注射器打开并置于无菌区域内。</li>
	<li>戴无菌手套，将5 mL注射器的活塞取出并保留在无菌区内以备后续使用。将鲁尔帽安装至该注射器上。</li>
	<li>将第 4.9 步中制备的4.5–5 mL EPC悬液用移液器加入打开的注射器筒内。将活塞牢固地重新插入注射器开口端。</li>
	<li>手持注射器使帽端朝上，取下鲁尔帽。将注射器以鲁尔接头端先进的方式插入钛管组件的开放式硅胶管中直至紧密贴合；注意不要深入钛管内部。</li>
	<li>缓慢推动注射器活塞，使细胞悬液上升至截断的注射器“头部”顶端，以排除系统中的气泡。用鲁尔帽封闭，然后将整个组件插入无菌护套中，并用胶带密封开口端。</li>
	<li>将整个组件插入第 3.7 步中的机械注射器支架中。置于37°C培养箱内，并调节平台，使接种室的钛管部分保持水平（使用水平仪，图6）。</li>
	<li>植入前让钛管组件旋转30分钟。</li>
</ol>
5. 将钛管植入猪下腔静脉
<ol>
	<li>手术前24小时，对用于分离EPCs的猪使用芬太尼透皮贴剂进行术前给药（100 μg/小时 经皮给药；贴剂保留 72 小时</li>
	<li>术前一晚禁食，并在手术当天及术后连续7天，每天给予拜菌灵（Enrofloxacin）5 mg/kg（肌内注射），作为抗生素预防用药。</li>
	<li>按照前述方法对猪进行镇静、插管和麻醉 1.3 （潮气量为10–15 ml/kg）并将猪仰卧位固定于手术台。术中通过监测血氧饱和度、心率和体温来监控猪的生理状态。使用自动加热手术台和加热毯，并加温输注液体，以维持体温调节。</li>
	<li>将18 G静脉导管插入猪的耳静脉，并使用Vetropolycin眼药水保护猪的眼睛。</li>
	<li>清洁、准备并铺巾猪的腹部，操作方法同 1.6用15号手术刀片从第二对乳腺向前至倒数第二对乳腺处沿中线切开。</li>
	<li>使用电凝设备将解剖分离至腹膜筋膜层。</li>
	<li>用蚊式钳提起腹膜，然后用梅茨鲍姆剪刀小心地进入腹膜。</li>
	<li>将膀胱外翻，于膀胱壁上缝置3-0 Vicryl荷包缝线。在其中央做一戳孔切口，插入16 F Foley导尿管。给予静脉输液（乳酸林格液），以调节尿量至 &gt;/= 1 ml/kg/hr 手术期间</li>
	<li>随后，将小肠和大肠外置，放置两把巴尔弗外科拉钩以暴露腹膜腔后部，并辨认下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>使用锐性与钝性分离技术，仔细将下腔静脉从周围组织中游离出来，并从右侧肾动脉近端至下腔静脉远端分叉处进行血管去鞘处理。在下腔静脉分离过程中须格外小心，因为即使下腔静脉出现微小破损，也可能导致动物迅速出血并发生失血性死亡。</li>
	<li>结扎下腔静脉节段的所有侧支分支，以确保植入钛管周围无出血。需注意通常存在的两条较大的腰静脉，其解剖和结扎需格外仔细。此外，应注意在下腔静脉分叉处近端紧邻位置，常可见一条较大的腰静脉位于后内侧，须将其充分游离，并用血管套圈控制，为后续钳夹做好准备。</li>
	<li>同时按照下述步骤进行Ti管的接种 4.</li>
	<li>在夹闭下腔静脉（IVC）前立即给予 100 USP/kg 肝素。将 45 度角的外科止血钳远端置于下腔静脉和腰静脉，然后近端夹闭。</li>
	<li>在近端和远端血管夹之间使用11号手术刀片做一纵向静脉切口（4 cm），随后用Potts剪刀扩大切口。</li>
	<li>抽空下腔静脉中的血液，并用无菌 DPBS 冲洗其内腔。</li>
	<li>现在将接种了EPC的Ti管（或裸金属对照）插入IVC中，并用DPBS（含CaCl2，MgCl2以防止细胞干燥并排出空气。</li>
	<li>用4-0 Prolene缝线连续缝合静脉切口，并松开近端一个血管夹，通过少量回血排出下腔静脉内的空气。将一根“固定缝线”穿过静脉壁并缝合至PVC导管上，以防止植入物随时间发生移位。</li>
	<li>使用带 CT 针的 0 号 PDS 缝线缝合筋膜，用 2-0 号 Vicryl 缝线（连续缝合）缝合皮下组织，皮肤用缝合钉闭合。</li>
	<li>沿切口部位皮下注射最多20 ml的0.25%马卡因（Marcaine，Bupivacaine），并用纱布和Tegaderm覆盖伤口。根据需要，皮下给予氟尼辛（Flunixin，2.2 mg/kg，每24小时一次）和氧吗啡酮（Oxymorphone，0.15 mg/kg，每3–4小时一次）以缓解疼痛。</li>
	<li>停止麻醉，监测猪直至苏醒并送回笼中。每日两次监测猪是否有痛苦或不适迹象，观察其站立与行走能力、粪便和尿液排出情况，以及提示正常灌注的皮肤颜色。</li>
</ol>
6. 钛管的取出
<ol>
	<li>3 周后，按照 1.3 - 1.4 所述方法对猪进行镇静、插管和麻醉。</li>
	<li>按照 5.5 - 5.8 所述方法进行剖腹手术。</li>
	<li>注意瘢痕将遮盖植入部位，但可触诊到原位的刚性钛管 in situ。</li>
	<li>按照 5.9 - 5.11 所述方法游离下腔静脉，并用组织剪将钛管连同周围下腔静脉组织整块取出。</li>
	<li>使用 Euthasol 安乐死溶液（390 mg/mL 戊巴比妥钠和 50 mg/mL 苯妥英钠，剂量为 1 mL/10 磅）处死动物。</li>
</ol>
7. 钛内表面的固定与成像
<ol>
	<li>用Ti管在DPBS溶液中冲洗切除的静脉段，并用高分辨率数码相机拍摄其管腔（通畅或闭塞）照片（图7）。</li>
	<li>随后将样本浸入3.7%多聚甲醛中固定，时间不少于15分钟。再用DPBS溶液冲洗样本。</li>
	<li>极为小心地切开静脉周围组织及PVC管，打开Ti管。将3个部分置于荧光显微镜下，使内表面朝向物镜/光源，在550 nm激发波长下成像，以观察呈红色/橙色的PKH26标记的EPCs（图8A）。如需要，可对细胞进行进一步染色（例如，血小板内皮细胞黏附分子（PECAM）染色以显示细胞边界（图8B），DAPI染色以显示细胞核等）。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
在执行本方案后，医生和科研人员能够在大动物模型中利用自体血液来源的内皮祖细胞对实心管状结构进行内皮化。图2显示，采用本方法分离的内皮祖细胞在培养约7天后呈现为具有铺路石样形态的细胞集落。如图5和图6所示，我们设计的接种装置可使装有内皮祖细胞悬液的钛管缓慢旋转，从而在无菌条件下实现细胞对管腔内表面的均匀覆盖9。
我们的植入手术能够在大型动物模型中检测生物材料（如钛）发生血栓的倾向。我们发现，猪对该手术耐受良好，且该植入过程仅造成极少的血液流失，同时不会破坏内皮祖细胞层。
图7显示，裸露的钛管完全闭塞，而我们的EPC衬管即使在下腔静脉的促血栓形成低剪切环境中仍保持通畅。此外，荧光标记细胞融合层的存在证实了该方法的成功，如图8所示。
<img alt="自体EPC接种过程示意图；外周血采集，钛植入物植入顺序。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 自体内皮祖细胞（EPC）接种实验示意图。首先，从一头猪采集外周血。随后，从血液中分离EPC并在体外进行扩增培养。然后将EPC用于包被钛（Ti）管装置，再将该装置外科植入提供细胞的同一头猪的下腔静脉中。
<img alt="显微镜下的细胞形态；成纤维细胞，显微镜图像，200 µm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 体外培养的内皮祖细胞（EPCs）代表性克隆，约在分离操作后 7 天（使用倒置 Leica DMIL 显微镜、成像相机和 QCapture 软件拍摄）。
<img alt="制备过程；培养皿中的金属样品；材料科学实验装置。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 组装前的钛管段。将钛管沿纵向切割成三个相等的部分，然后截成4.5 cm长。使用台式砂轮机和砂布对钛管段的内表面进行抛光，以去除可见的凹坑。
<img alt="热处理方法，使用热风枪对准金属样品进行材料测试的实验装置。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 钛管段与聚氯乙烯热缩管（蓝色）的组装及热风枪的使用。钛管段被支撑在一个精密加工的铝制芯轴上，该芯轴贯穿钛管段，且尺寸与钛管内径相匹配。
<img alt="注射器装置，含钛管和硅胶管，实验组装示意图。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 钛管组装示意图，显示所有组件：鲁尔帽、注射器“头部部件”、硅胶管以及带聚氯乙烯包裹（蓝色）的钛管。该装置在用于手术前需预先组装并灭菌。
<img alt="用于力学分析的平台上的电机、铝制支架和注射器组成的静态平衡装置示意图。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 培养箱内钛管接种装置，显示电机、平台、加工铝制注射器支架、钛管组件和5 cc注射器。注意：为便于观察，图中组件未显示保护性无菌护套。
<img alt="血管支架解剖的生物医学实验；工具、支架切开、血栓观察。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. 植入手术的代表性大体结果。(A) 猪下腔静脉（IVC）植入后的对照组裸金属钛管末端观。管腔被实性血栓完全阻塞。(B) 内皮祖细胞（EPC）接种钛管植入后的末端观。管腔完全通畅且清晰。(C) 植入3天后对照组（裸）钛管的解剖视图，显示血栓形成范围（实验最长持续3周，结果一致）。
<img alt="荧光显微镜图像；细胞结构分析，红色和绿色荧光，200 μm，100 μm。" src="/files/ftp_upload/3197/3197fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8. 内皮祖细胞（EPCs）在钛管表面植入3天后的观察结果（使用Leica DMRB直立显微镜、QImaging QICAM黑白数字相机及Image Pro Plus软件成像）。(A) 表面融合生长的细胞，显示术前PKH26标记。 (B) EPCs形成的融合层。红色：术前PKH26标记；绿色：EPCs的PECAM染色。

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</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的细胞接种钛管方法可使医生和科研人员快速且均匀地实现可植入器械血液接触表面的内皮化。由于我们从外周血样本中分离并扩增内皮祖细胞（EPCs），因此无需通过重大侵入性操作来获取这些细胞。此外，EPCs为自体来源，从而消除了对细胞接种植入物产生任何免疫反应的风险。本方案中展示的原理不仅可用于钛管，还可应用于心血管医学中使用的多种其他生物材料。
本方案中的关键步骤包括对钛管进行细致的清洗，因为我们发现任何残留的污染物薄膜都会影响细胞的贴附。此外，在接种过程中，缓慢的旋转速度（与管径成反比）至关重要，以确保内皮祖细胞能够随着钛管的移动缓慢沉降并贴附于表面。
我们采用在植入前立即接种的方法，避免了不切实际的操作 离体 培养时间；细胞单独贴壁，随后形成融合的单层细胞层 体内，避免在血流恢复后立即发生栓塞。我们先前的研究表明，一旦内皮祖细胞（EPCs）生长形成融合单层，便会分泌细胞外基质并牢固黏附其上，从而进一步最大限度地减少内皮细胞片脱落的可能性。尽管仍不能完全排除栓塞性脱落的风险，但其风险似乎远低于该疗法旨在预防的整个装置表面血栓形成的问题。 
将植入物置入低剪切力、促血栓形成的下腔静脉环境，是研究器械血液相容性和血栓形成最为可靠的大型动物模型之一5,6。请注意，所有动物护理和实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并在获得杜克大学机构动物护理与使用委员会批准后实施。
为了成功利用该植入方法测试生物材料和器械，必须耐心地剥离下腔静脉（IVC）节段并结扎所有静脉分支血管，为器械植入做好准备，以确保器械周围无“假腔”来源的出血。另一步骤至关重要，即向器械管腔内加入DPBS，以保证在关闭静脉切口及开始再灌注之前，管腔内表面的细胞保持湿润。如果在原植入位置未能找到该器械，则可能已沿下腔静脉“上游”迁移。可通过将缝线（4-O Prolene）穿过静脉壁及PVC管的一段2–3 mm区域，将管体牢固锚定于当前位置，从而防止此情况发生。若研究人员在取出后于原本通畅的管腔中难以发现图8所示的荧光预标记细胞，则可能是细胞以完整片层形式脱落所致。为避免此现象，可在将静脉与管体一同固定后，轻柔解剖周围静脉组织，并小心拆解3个钛管部分。
我们的技术通过内皮祖细胞接种为预防心血管器械血栓形成提供了概念验证。该技术可用于开发内衬患者自体内皮祖细胞的“生物源性”植入物。我们在猪动物模型中开展的可行性研究为将这种“个性化医疗”转化为临床实践迈出了第一步。

<table><tbody><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>BIC670025</td><td>NAC# 10280002</td></tr><tr><td>Alconox 粉末精密清洁剂</td><td>Alconox, Inc.</td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>Balfour 外科牵开器</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>拜耳灵</td><td>Bayer AG</td><td>APVMA 46028/0705</td><td></td></tr><tr><td>蝶形针（19G）</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SV19CLK</td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td>3M</td><td>9200</td><td></td></tr><tr><td>钳子（45度）</td><td>Aesculap</td><td>FC339T</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DuraPrep</td><td>3M</td><td>8635</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>无血清和完全生长培养基的基础成分</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3162</td><td>与 EBM-2 联用，用于无血清和完全生长培养基</td></tr><tr><td>电灼器</td><td>Valleylab</td><td>SurgII-20</td><td></td></tr><tr><td>砂布</td><td>3M</td><td>60-0700-0425-8</td><td>240 目</td></tr><tr><td>Euthasol 安乐死溶液</td><td>Virbac Animal Health</td><td></td><td>ANADA #: 200-071</td></tr><tr><td>芬太尼贴剂</td><td>Actavis</td><td></td><td>NDC # 67767-120-18</td></tr><tr><td>氟尼辛</td><td>Merck &amp;amp; Co.</td><td></td><td>NAC #: 10470183</td></tr><tr><td>导尿管（16F）</td><td>Bard</td><td>730116</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>热风枪</td><td>Milwaukee</td><td>8988-20</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td></td><td></td><td>NDC #: 25021</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8889-500ML</td><td></td></tr><tr><td>插管导管</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>86113</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td></td><td>NDC #13985-030</td></tr><tr><td>静脉导管（18G）</td><td>BD Biosciences</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td>NDC #0856-2013</td></tr><tr><td>水平仪</td><td>Swanson</td><td>LLA001</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁头盖</td><td>CML Supply</td><td>909-001</td><td></td></tr><tr><td>盐酸布比卡因</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td>NDC #: 0409-1560-10</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微型导入器（5F）</td><td>Galt</td><td>KIT 002-01</td><td></td></tr><tr><td>蚊式止血钳</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>电机</td><td>Herbach and Rademan</td><td>H1-08</td><td></td></tr><tr><td>氧吗啡酮</td><td>Endo Labs</td><td></td><td>NDC: 63481-624-10</td></tr><tr><td>PKH26 荧光染料试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>猪血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-115</td><td>在完全生长培养基中浓度为 2%</td></tr><tr><td>Potts 剪刀</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precise Vista 皮肤缝合器</td><td>3M</td><td>3998</td><td></td></tr><tr><td>PVC 管</td><td>McMaster-Carr</td><td>7132K117</td><td>扩张后内径 15.88 mm，&lt;br/&gt;恢复后内径 7.95 mm</td></tr><tr><td>直角中号钳</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片（#10-15）</td><td>Bard</td><td>373910</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>McMaster-Carr</td><td>51735K26</td><td>外径 16.64 mm，内径 9.52 mm</td></tr><tr><td>注射器（5 cc）</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>透皮膜</td><td>3M</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>Kendall</td><td>170060</td><td></td></tr><tr><td>钛管</td><td>Tico Titanium</td><td>N/A</td><td>规格为 &amp;#189;&quot; 外径，.065&quot; 壁厚，.370&quot; 内径，.1737 磅/英尺</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液（TNS）</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5002</td><td>0.03%</td></tr><tr><td>维特波尔林</td><td>Pharmaderm Animal Health</td><td></td><td>NAC #: 12920110</td></tr><tr><td>薇乔缝线（3-0）</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J808T</td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Branson</td><td>B200</td><td></td></tr></tbody></table>

自体血管内皮祖细胞接种技术及心血管器械在大型动物模型中的生物相容性测试

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

植入式心血管器械由人工材料（如钛（Ti）、膨体聚四氟乙烯）制造，存在形成血栓栓塞的风险1,2,3我们开发了一种利用自体血液来源的人或猪内皮祖细胞（EPCs）衬覆钛管内表面的方法4通过将含有融合猪内皮祖细胞（EPCs）层的钛管植入猪的下腔静脉（IVC），我们在大型动物模型的促血栓环境中测试了细胞接种表面的改善生物相容性，并将其与未经修饰的裸金属表面进行比较5,6,7 (图1该方法可用于在植入后数分钟内实现装置的内皮化，并检测其抗血栓功能 体内. 
从50公斤重的约克夏猪获取外周血，并培养其单个核细胞组分以分离内皮祖细胞4,8。将钛管（内径9.4 mm）预先切割成三段长4.5 cm的纵向切片，并用热缩管重新组装。构建了一种接种装置，可实现钛管的缓慢旋转。
我们对猪进行了剖腹手术，并将肠管和膀胱外置。采用锐性与钝性分离技术，从下腔静脉（IVC）分叉处远端至右肾动脉近端进行游离。随后将钛管（Ti管）填充含荧光标记的自体EPC悬液，并以10转/小时旋转30分钟，以实现细胞均匀包被9。在给予100 USP/kg肝素后，夹闭下腔静脉两端及一条腰静脉。行4 cm静脉切开术，插入装置并用磷酸盐缓冲液充满。在用4-0 Prolene连续缝合关闭静脉切口的同时，松开一侧夹钳以排出下腔静脉内的空气。手术结束时，用0号PDS（聚对二氧环己酮缝线）缝合筋膜，2-0 Vicryl缝合皮下组织，皮肤则用缝钉闭合。 
3至21天后，处死猪，整体取出装置并进行固定。拆卸钛管后，用荧光显微镜观察其内表面。
我们发现，未处理的金属钛管完全闭塞，而接种了内皮祖细胞（EPC）的管腔则保持通畅。此外，我们能够证实EPC在管腔内侧的血液接触表面形成了融合的单层细胞层。
总之，我们的技术可在植入后几分钟内利用自体EPC使钛管内皮化，从而防止装置发生血栓。我们的手术方法能够以最少的血液流失和EPC接种表面的损伤，来检测此类修饰装置的生物相容性改善效果。

介绍了一种在钛基血液接触性生物材料上接种自体细胞并检测其生物相容性的方法。该方法利用内皮祖细胞和钛管，在将钛管植入猪腔静脉后的数分钟内完成细胞接种。该技术可适用于多种其他可植入式 biomedical 设备。

植入式心血管器械由人工材料（例如钛（Ti）、膨体聚四氟乙烯）制造，这些材料存在……的风险

本实验的总体目标是利用自体血液来源的内皮祖细胞接种血管植入物，然后观察该治疗在大型动物模型中对血栓形成的影响。该目标通过采集猪的外周血样本来分离晚期生长型猪内皮祖细胞来实现。接下来，植入装置。在我们的原理验证研究中，将自体PCs植入钛管内，然后将该装置植入猪的下腔静脉。结果显示，与对照组和发生闭塞的裸金属管相比，EPC植入的钛管保持通畅，显示出抗血栓形成的保护作用。杜克大学外科致力于推动具有开创性和创新性的研究。以下展示是我们跨科室、跨学科推进医学发展的一个范例。EK博士一直带领团队致力于开发一种细胞接种技术，该技术可通过在血管器械的血液接触表面覆盖患者自身的前体细胞，从而预防血栓形成。由于这些细胞来源于将接受植入物的同一患者，因此可避免免疫系统的排斥反应。我们的成功以及本文所述方法是大型团队共同努力的成果。血管外科的 Sean Gage、杜克大学医学院学生 Whitney Lane 以及我本人将演示手术植入过程。接下来，我将介绍来自生物医学工程系的博士研究生 Alexander Janssen，他将详细为我们演示细胞接种的过程。我将展示如何在将钛管植入猪模型之前，用血液来源的内皮祖细胞进行接种。该方法作为概念验证，其相同的基本原理可应用于许多其他可植入装置，例如镍钛合金支架和机械循环辅助装置。EPCs 通过铺板猪血的单个核细胞组分进行分离，通常在约七天后出现。可通过其典型的鹅卵石样形态加以识别。在培养中将 EPCs 扩增至总数为 900 万个细胞。用无血清培养基冲洗制备好的 EPCs 两次，注意在标记期间及之后尽量减少其光照暴露。然后用荧光标记物 PKH 26 覆盖细胞，并记录所加溶液的体积。室温孵育 4 分钟。一分钟后，向染料溶液中加入等体积的猪血清以终止标记反应。用完全培养基将合并后的溶液按1:1比例稀释。然后吸除液体，用完全培养基冲洗细胞3次，随后用不含氯化钙和氯化镁的DPBS洗涤2次。接着加入胰蛋白酶覆盖细胞，记录所用体积，并在37°C条件下孵育。孵育三分钟后，使用显微镜检查细胞是否已脱落，如果已脱落，则加入两倍于之前添加量的胰蛋白酶中和溶液。将细胞悬液合并至同一离心管中，并使用血细胞计数板测定细胞密度。最后，离心收集细胞沉淀，并将细胞重悬于至少 4.5 毫升无血清培养基中。手术准备完成后，使用15号手术刀片从第二组唾液腺开始沿中线切开，使用电凝术向头侧延伸至倒数第二组腺体，分离至腹膜筋膜层。用蚊式钳提起腹膜，用梅茨钳小心切开腹膜，将膀胱外翻，于膀胱壁置入一根3-0薇乔线荷包缝线。在其中央做一穿刺切口，将16法式 Foley 导尿管插入切口。然后输注静脉液体，术中将尿量调节至至少每公斤体重每小时1毫升。接下来，将扩大的小肠外置，并放置两个布尔氏手术拉钩以暴露腹膜腔后部，通过锐性与钝性分离辨认下腔静脉（IVC）。仔细游离下腔静脉周围组织。然后从右侧肾动脉近端至下腔静脉远端分叉处对血管进行充分剥离，裸露血管。 在分离下腔静脉（IVC）时需格外小心，因为即使IVC出现微小缺损，也可能导致动物迅速出血并失血死亡。应结扎IVC节段的所有侧支血管，尤其需仔细分离并结扎位于IVC分叉处近端的两条粗大的腰升静脉。通常在IVC后方可见一条较粗大的腰静脉。游离该静脉并用血管环控制。现在，在与手术并行的同时，在开始此操作之前，先用内皮祖细胞（EPCs）接种植入物。钛管组织嵌入支架必须在无菌区域中完全组装并准备就绪。在5 cc注射器中打开经气体灭菌的钛管组件。然后从5 cc注射器中取出活塞，但不要丢弃。将一个固定的吸引帽连接到注射器上。使用移液器将EPC悬液充满注射器。然后重新装上活塞。取下帽盖，将注射器的吸引端插入装置的开放式硅胶管中，直至刚好紧密贴合，但不要进一步插入。通过缓慢推动细胞溶液，使其上升至头部组件的顶端，以排除任何气泡。然后用诱捕帽封闭组件，并用胶带在无菌手套中将其封好。将整个组件插入机械加工的注射器 holder 中，并置于 37 °C 培养箱内。使用量规确保 seating chambers 处于水平状态，并让组件在缓慢旋转条件下孵育。在结扎下腔静脉后立即继续手术，按每公斤猪体重给予100单位肝素。然后立即在下腔静脉和腰静脉远端以45度角夹闭下腔静脉，再夹闭近端。接着使用11号手术刀片和组织剪，在近端和远端血管夹之间做一条四厘米长的纵向静脉切口。从下腔静脉（IVC）中抽出所有血液，并用无菌DPBS冲洗其内腔。随后将搭载EPC的植入物或裸金属对照物插入IVC中，以防止细胞干燥并排出空气。用含有氯化钙和氯化镁的DPBS填充IVC。然后用4-0普鲁线连续缝合关闭静脉切口，并移除近端血管夹，通过少量回血排出下腔静脉内的空气。回血结束后，移除远端血管夹以固定植入物。将一条固定缝线缝入穿过静脉壁的PVC导管中。使用 CT 针上的 OPDS 缝合筋膜。用两根 Vicryl 缝线连续缝合皮下组织。然后用缝钉闭合皮肤。沿切口部位皮下注射最多 20 毫升 0.25% 布比卡因，以缓解疼痛，并用纱布和 Tegaderm 覆盖伤口。根据需要皮下注射氟尼辛和氧吗啡酮。停止麻醉，当猪苏醒后，在接下来的七天内将其送回笼中。每24小时给予一次Atri作为抗生素预防用药，并确保术前贴敷的芬太尼透皮贴剂持续黏附达三天。三天后，取出坐位的钛管植入物并检查其内表面。在550纳米激发波长下，另一根管内发现一层融合的荧光标记细胞。此外，使用血小板内皮细胞黏附标志物对切片细胞进行染色，以显示细胞边界。本实验可采用多种不同的染色方法。相比之下，在促血栓形成的低剪切力环境下，裸钛管植入物会在下腔静脉中完全闭塞。如图像 A 和 C 所示，细胞接种的钛管见图像 B，经含峰值血液的分离程序处理后仍无血凝块。内皮祖细胞（EPC）在培养约七天后出现。在进行手术操作时，必须仔细且轻柔地游离下腔静脉（IVC），因为下腔静脉或其侧支的微小撕裂都可能导致猪只失血性死亡。通过该操作后，其他与血液接触的材料可快速实现内皮化，以防止血栓形成。内皮型血管支架，例如利用我们的人体血管内皮祖细胞（EPCs），可模拟血管壁的天然内膜结构，有望在支架植入后防止再狭窄和血栓形成。我们的快速原位技术可在手术室或导管室内，于数分钟内利用患者自体血液来源的内皮祖细胞完成对血管内装置的内膜化，从而避免长时间的体外培养。避免了设备本身的时间消耗，该技术因而可实际应用于临床实践。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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