自体血管内皮祖细胞接种技术及心血管器械在大型动物模型中的生物相容性测试

本实验的总体目标是利用自体血液来源的内皮祖细胞接种血管植入物，然后观察该处理在大型动物模型中对血栓形成的影响。为此，首先从猪的外周血中获取血样，以分离晚期生长型猪内皮祖细胞。接下来，植入装置。

在我们的原理验证研究中，将自体PCs植入钛管内。随后将该装置植入猪的下腔静脉。结果显示，与对照组中发生闭塞的裸金属管相比，内皮祖细胞包被的钛管保持通畅，显示出抗血栓形成的保护作用。

杜克大学外科致力于推动具有开创性和创新性的研究。以下展示的项目便是我们如何跨科室、跨学科合作以推进医学发展的一个实例。EK博士一直领导着一项研究工作，旨在开发一种细胞接种技术，通过用患者自身的祖细胞覆盖血管器械的血液接触表面，从而预防血栓形成。

由于这些细胞来源于将接受植入物的同一患者，因此可避免免疫系统的排斥反应。我们的成功以及本文所述方法是大量团队协作的成果。血管外科的 Sean Gage、杜克大学医学院学生 Whitney Lane 以及我本人将演示手术植入过程。

现在，我将介绍来自生物医学工程系的博士生 Alexander Janssen，他将为我们详细讲解细胞接种过程。在将钛管植入猪模型之前，我将演示如何用血液来源的内皮祖细胞对钛管进行接种。该方法作为概念验证，其相同的基本原理可应用于其他多种可植入装置，例如镍钛合金支架和机械循环辅助装置。EPCs 通过铺板猪血的单个核细胞组分进行分离，通常在约七天后出现。

可通过其典型的鹅卵石样形态进行识别。在培养中将EPC扩增至总数为900万个细胞。用无血清培养基冲洗制备好的EPC两次，注意在标记期间及之后尽量减少光照暴露。

然后用荧光标记物 PKH 26 覆盖细胞，并记录所加溶液的体积。室温孵育细胞 4 分钟。一分钟后，向染料溶液中加入等体积的猪血清以终止标记反应。

用完全培养基将合并后的溶液按1:1比例稀释。然后吸除液体，用完全培养基冲洗细胞三次，随后用不含氯化钙和氯化镁的DPBS洗涤两次。接下来，加入胰蛋白酶覆盖细胞，记录所用体积，并在37°C下孵育。

孵育三分钟后，使用显微镜检查细胞是否已脱落；若已脱落，则加入两倍体积的胰蛋白酶中和溶液。胰蛋白酶处理后，将细胞悬液合并至同一离心管中，并使用血细胞计数板测定细胞密度。最后，离心收集细胞沉淀，并将细胞重悬于至少4.5毫升无血清培养基中。

手术准备完成后，使用15号手术刀片从第二组唾液腺开始沿正中线切开，使用电凝术向头侧延伸至倒数第二组腺体，继续分离至腹膜筋膜层。

用蚊式钳提起腹膜，小心地用梅茨钳和剪刀切开腹膜，将膀胱外翻，于膀胱壁置入一根3-0薇乔缝线作荷包缝合。在其中心做一穿刺切口，将16 French Foley导尿管插入切口内。随后输注静脉液体，术中将尿量调节至至少每小时每公斤体重1毫升。

接下来，将扩大的小肠外置，并放置两个布尔式手术拉钩以暴露腹膜腔后部，通过锐性与钝性分离辨认下腔静脉（IVC）。仔细游离下腔静脉周围组织。然后从右侧肾动脉近端至下腔静脉远端分叉处对血管进行骨骼化处理。

在进行下腔静脉（IVC）解剖时需格外小心，因为即使下腔静脉出现微小破损，也可能导致动物迅速出血并失血死亡。在分离和结扎下腔静脉节段的所有侧支时应特别仔细，尤其要注意在下腔静脉分叉处近端的两条粗大的腰升静脉。通常在下腔静脉后方可见一条较粗的腰静脉。

游离此静脉并用血管环控制。现在，在手术进行的同时，开始在植入物上接种内皮祖细胞（EPCs），以便在开始此操作前完成接种。钛管组织嵌合支架必须完全组装完毕，并已准备好置于无菌区域待用。

在5 cc注射器中打开经气体灭菌的钛管组件。然后将5 cc注射器的活塞取出，但不要丢弃。将一个固定的吸引帽连接到注射器上。使用移液器将EPC悬液注入注射器中。

然后装回推杆。取下帽盖，将注射器的诱饵端插入装置的开放式硅胶管中，直至紧密贴合即可，注意不要插入过深。通过缓慢推动细胞溶液，直至其到达头部组件的顶端，以排除任何气泡。

然后用诱捕帽封闭组件，并在无菌手套中用胶带将其封紧。将整个组件插入机械加工的注射器支架中，并置于37°C培养箱内。使用量规确保 seating chambers 水平，并让组件在缓慢旋转条件下孵育。

在结扎下腔静脉后立即继续手术，按每公斤猪体重给予100单位肝素。然后立即在下腔静脉和腰静脉远端以45度角夹闭下腔静脉，随后在近端夹闭。接下来，使用11号手术刀片和组织剪，在近端和远端血管夹之间做一道4厘米长的纵向静脉切口。

从下腔静脉（IVC）中抽出所有血液，并用无菌的DPBS冲洗其内腔。现在将装有EPC的植入物或裸金属对照物插入下腔静脉，以防止细胞干燥并排出空气。用含有氯化钙和氯化镁的DPBS填充下腔静脉。

然后用4-0普理灵线连续缝合闭合静脉切口，并松开近端血管夹，通过少量回血排出下腔静脉内的空气。回血后，移除远端血管夹以固定移植物位置。将一条固定缝线缝入穿过静脉壁的PVC管中。

使用CT针上的OPDS缝合筋膜。用两针Vicryl连续缝合皮下组织。然后用缝合钉闭合皮肤。

沿切口部位皮下注射最多 20 毫升 0.25% 布比卡因，以缓解疼痛，并用纱布和 Tegaderm 覆盖伤口。根据需要皮下注射氟尼辛和氧吗啡酮。停止麻醉，待猪苏醒后，在接下来的七天内将其送回笼中。

每24小时给予一次阿奇霉素作为抗生素预防用药，并确保术前贴敷的芬太尼透皮贴剂持续黏附，共维持三天。三天后，取出已植入的钛管，检查其内表面。在550纳米激发波长下，另一根钛管内表面发现一层融合的荧光标记细胞。

此外，使用血小板内皮细胞黏附标志物对切片细胞进行染色，以显示细胞边界。本实验中可采用多种不同的染色方法。相比之下，在促血栓形成的低剪切力环境下，裸钛管植入物在下腔静脉中会完全闭塞。

如图A和图C所示，细胞接种的钛管见图B，经我们采用峰值血液进行的分离程序后，仍保持无血凝块状态。内皮祖细胞（EPC）在培养约平均七天后出现。在进行手术操作时，必须仔细且轻柔地游离下腔静脉（IVC），因为即使IVC或其侧支发生微小撕裂，也可能导致猪只失血性休克。完成该操作后，其他与血液接触的材料可快速实现内皮化，以预防血栓形成。

例如，我们的内皮祖细胞（EPCs）模拟了血管壁的天然内皮层，可能在支架植入后防止再狭窄和血栓形成。我们的快速涂层技术可在手术室或导管室内，于数分钟内利用患者自体血液来源的内皮祖细胞覆盖血管内装置，从而避免长时间的体外培养。

避免了设备本身的时间消耗，该技术因而可实际应用于临床实践。