Name: 从人类乳腺成纤维细胞癌相关的成纤维细胞的实验发电（CAFS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 了解从原代人乳腺成纤维细胞生成癌相关成纤维细胞（CAFs）的实验方法。该技术通过共植入肿瘤异种移植模型，使正常成纤维细胞在肿瘤微环境中逐步转化为促进肿瘤进展的肌成纤维细胞。

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我们感谢 Robert A. Weinberg 博士（美国剑桥市生物医学研究怀特黑德研究所）对本工作的大力支持与指导，感谢 Kieran Mellody 先生（英国曼彻斯特大学）对本文稿的严谨审校。本项目得到了英国癌症研究基金会（CR-UK）资助，资助编号为 C147/A6058（A.O.）。

1. 原代培养人正常乳腺成纤维细胞的分离
图1A概述了分离原代培养的人正常乳腺成纤维细胞的实验步骤。
<ol>
	<li>按前述方法配制细胞解离缓冲液12：含10%胎牛血清（FCS）、青霉素-链霉素（200单位/毫升）、I型胶原酶（1毫克/毫升）和透明质酸酶（125单位/毫升）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>将来自乳房缩小成形术的乳腺组织（约0.5克）用磷酸盐缓冲液（PBS）反复清洗数次。使用无菌剃刀片将组织切成小碎片（&lt;1.5 mm3）。</li>
	<li>将组织碎片转移至含有适量上述细胞解离缓冲液（每0.5克组织加10毫升）的15毫升锥形管中，涡旋震荡1分钟（最大速度）。</li>
	<li>在37°C下缓慢振荡消化组织碎片12–18小时。*注意：管中仍会有大量未完全消化的组织碎片残留。</li>
	<li>室温静置5分钟，不振荡。用5毫升移液管将富含基质细胞的上清液转移至新的锥形管中。</li>
	<li>以250 × g离心5分钟收集基质细胞组分，弃上清后用PBS重悬细胞沉淀。再次以250 × g离心5分钟，弃上清后用含10% FCS的DMEM重悬细胞沉淀。将细胞接种于15厘米培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养。</li>
	<li>继续传代培养至细胞融合，通常需要8–10天。使用冻存液（含10%二甲基亚砜和20% FCS的DMEM）将细胞于-80°C保存。制备5支冻存管作为原始细胞库。取一支冻存管复苏后扩增，制备5支次级细胞库，所用成纤维细胞应在5次群体倍增（PDs）内完成传代，用于后续实验。上述操作可最大限度减少长期体外培养过程中可能出现的克隆选择和培养应激。*注意：P1.1–7步骤也可用于从乳房切除术获得的乳腺癌组织中分离癌相关成纤维细胞（CAFs）12。</li>
</ol>
2. 生成表达GFP标记、耐嘌呤霉素的永生化人正常乳腺成纤维细胞
<ol>
	<li>为了永生化在 P1.7) 步骤中分离得到的原代人正常乳腺成纤维细胞，引入表达 hTERT 和 GFP 的逆转录病毒 pMIG（MSCV-IRES-GFP）载体12。将细胞培养 4–5 天，然后通过流式细胞术分选 GFP 阳性细胞。</li>
	<li>将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒 pBabe-puro 载体导入 GFP 标记的永生化成纤维细胞中。在嘌呤霉素（终浓度：1 μg/ml）存在下培养细胞 5–7 天，以获得 GFP 阳性（GFP+）、嘌呤霉素抗性（puroR）的永生化人乳腺成纤维细胞。</li>
	<li>接下来，为检测这些成纤维细胞是否产生具有活性的病毒（可能导致 GFP 和嘌呤霉素抗性基因发生水平转移），将 2.5×105 个 GFP+puroR 永生化人乳腺成纤维细胞接种于 6 cm 培养皿中，培养 2 天。</li>
	<li>使用注射器滤器（孔径：0.45 μm）过滤上述成纤维细胞条件培养基，并在鱼精蛋白硫酸盐（5 μg/ml）存在下将其加入 10T1/2 小鼠成纤维细胞中，孵育 12 小时（鱼精蛋白硫酸盐可提高病毒感染效率）。随后更换为含 10% FCS 的 DMEM 培养基，继续培养 2 天。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察细胞。若 10T1/2 细胞被 GFP 病毒感染，则会呈现 GFP 阳性。同时，用嘌呤霉素（1 μg/ml）处理细胞 5–7 天，观察培养皿中是否有 puroR 的 10T1/2 细胞存活并形成克隆集落。</li>
	<li>需注意，亲代 GFP+puroR 人乳腺成纤维细胞所产生的具有活性的病毒可能引起基因的水平转移，导致肿瘤异种移植模型中的邻近小鼠细胞和/或癌细胞转变为 GFP+puroR 表型。这可能会干扰从肿瘤异种移植组织中分离最初注射的 GFP+puroR 人乳腺成纤维细胞的实验过程。</li>
</ol>
3a. 将人乳腺成纤维细胞与乳腺癌细胞共同注射至免疫缺陷小鼠
生成exp-CAFs的实验步骤如图1Ba所示。
<ol>
	<li>将1×106个MCF-7-ras人乳腺癌细胞与3×106个GFP+puroR永生化人乳腺成纤维细胞（于P2.2步骤中制备）混合。每注射样本用400 μl含50% (v/v) Matrigel的培养基悬浮细胞。</li>
	<li>将细胞混合物皮下注射至免疫缺陷裸鼠体内。当CAF从不同肿瘤中独立提取时，将每种混合物分别注射至多只小鼠的左右侧 flank 部位。</li>
</ol>
3b. 将人乳腺成纤维细胞注射至免疫缺陷小鼠体内
<ol>
	<li>为生成用于与实验组CAFs对照的成纤维细胞，将P2.2中获得的3×106个GFP+puroR永生化人乳腺成纤维细胞重悬于400 μl培养基中，每注射点加入50% (v/v) Matrigel（图1Bb）。切勿将成纤维细胞与癌细胞混合。</li>
	<li>将P3b.1步骤中制备的成纤维细胞植入裸鼠皮下部位。</li>
</ol>
*请注意，接种的成纤维细胞将在皮下形成成纤维结缔组织，而非肿瘤。
4a. 肿瘤异种移植瘤的解剖
<ol>
	<li>在植入后第42天处死携带皮下人乳腺癌异种移植瘤的小鼠（图1Ba）。*注意：当共植入其他癌细胞和/或成纤维细胞时，成纤维细胞可能需要在肿瘤异种移植体内孵育超过42天，以启动其肌成纤维细胞表型。</li>
	<li>使用镊子和剪刀通过钝性解剖从小鼠侧腹收获肿瘤异种移植组织。将肿瘤组织浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
</ol>
4b. 成纤维细胞异种移植体的解剖
<ol>
	<li>在植入后第42天处死携带成纤维细胞异种移植瘤的小鼠（图1Bb）。</li>
	<li>使用镊子和剪刀解剖皮下成纤维细胞异种移植瘤组织，将成纤维组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。*请注意，成纤维细胞异种移植瘤呈微小透明状组织，可能在皮肤下难以发现。</li>
</ol>
5. 异种移植瘤原代培养细胞的制备
<ol>
	<li>使用无菌生物安全柜解剖肿瘤（约 0.5 克）或成纤维组织（约 0.1 克）。将切除的组织转移至含有 1 ml PBS 的 15 cm 培养皿表面。使用无菌剃刀片将组织切碎成小的组织碎片（<1.5 mm3）。*注意：如果成纤维细胞异种移植组织重量小于 0.1 克，应收集数个额外的成纤维细胞异种移植组织并混合，以增加细胞分离的数量。</li>
	<li>将组织碎片转移至含有细胞解离缓冲液（每 0.5 克组织加入 10 ml）的 15 ml 圆锥形离心管中，并在最大转速下涡旋震荡 1 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液在 37°C 条件下孵育 3 小时，期间持续缓慢振荡。</li>
</ol>
6. 培养中嘌呤霉素抗性细胞的分离
<ol>
	<li>将从肿瘤或成纤维细胞异种移植中分离的细胞悬液在250 × g条件下离心5分钟，并用PBS重悬细胞沉淀。再次在250 × g条件下离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基（10% FCS-DMEM）中。将细胞接种于15 cm培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养，并加入嘌呤霉素（1 μg/ml）以清除可能污染的癌细胞和/或小鼠间质细胞。持续传代培养细胞直至形成融合单层（2–4周）。使用冻存液将细胞于-80°C保存。*注意：所得的嘌呤霉素抗性细胞（puroR），分别命名为42天龄的exp-CAF1细胞（图1Ba）或对照成纤维细胞-1细胞（图1Bb），具有永生化特性且GFP表达呈阳性。建议使用10T1/2细胞检测这些细胞是否产生活性病毒，方法见P2.3-6。</li>
</ol>
7a. 体外培养中 exp-CAF2 细胞的分离
为了进一步增强CAF的活化肌成纤维细胞表型，将培养42天的exp-CAF1细胞与MCF-7-ras细胞混合，再次皮下注射到裸鼠体内，继续培养200天。解剖并分离肿瘤异种移植组织，制备成单细胞悬液，并在含嘌呤霉素（1 μg/ml）的10% FCS-DMEM培养基中，接种于15 cm培养皿中培养，具体操作如P6.1所示。将细胞扩增培养至融合状态（8–10天）。使用冻存液将细胞在-80°C保存。所得嘌呤霉素抗性（puroR）细胞命名为培养242天的exp-CAF2细胞（图1Ba）。
7b. 培养中对照成纤维细胞-2 的提取
为了生成针对 exp-CAF2 细胞的对照成纤维细胞，将 42 日龄的对照成纤维细胞-1 单独注射到裸鼠皮下，不与癌细胞共注射，并额外培养 200 天。解剖并消化成纤维组织，制备成单细胞悬液，将细胞接种于 15 cm 培养皿中，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，在存在嘌呤霉素（1 μg/ml）的条件下培养，如 P6.1 所示。持续传代培养至细胞融合（3–4 周）。使用冻存液将细胞在 -80°C 条件下保存。所得的嘌呤霉素抗性（puroR）细胞命名为对照成纤维细胞-2 细胞（图 1Bb）。
8. 典型结果：
对照成纤维细胞-2和从乳腺肿瘤异种移植模型中分离的exp-CAF2细胞对间充质标志物呈强阳性染色，包括人特异性波形蛋白（vimentin）、脯氨酰-4-羟化酶（prolyl-4-hydroxylase）、I型胶原（collagen 1A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4以及成纤维细胞表面蛋白（图2A）11，表明这些细胞具有人类来源及间充质特性。相比之下，上皮细胞标志物细胞角蛋白（cytokeratin）在这些GFP+成纤维细胞中未见染色（图2B）。因此，这些结果提示，所分离的exp-CAF2细胞和对照成纤维细胞-2来源于最初植入小鼠异种移植模型中的人乳腺成纤维细胞。
重要的是，与培养42天的exp-CAF1细胞和对照成纤维细胞-2细胞相比，更高比例的exp-CAF2细胞对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞外基质糖蛋白tenascin-C5染色呈阳性，这两种蛋白均为肌成纤维细胞的标志物（图2C、D）11。这些数据表明，人乳腺驻留成纤维细胞在肿瘤异种移植模型中逐步演变为癌症相关成纤维细胞（CAF）类型的肌成纤维细胞。
<img alt="乳腺癌细胞-成纤维细胞相互作用示意图；FACS 分选；肿瘤进展过程" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 人乳腺成纤维细胞分离的示意图。A) 乳房缩小术获取的组织使用无菌剃刀片切碎（P1.2），并转移至15 ml锥形管中（P1.3）。将小块组织在细胞解离缓冲液中进行消化（P1.4），随后制备用于培养 体外 (P1.5-7)。为了永生化分离得到的原代人乳腺成纤维细胞，引入了一种表达hTERT和GFP的逆转录病毒pMIG（MSCV-IRES-GFP）载体，并通过流式细胞术分选获得GFP阳性细胞（P2.1）。随后将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒pBabe-puro载体导入这些细胞中。经嘌呤霉素处理后，筛选出GFP标记（GFP+) 嘌呤霉素抗性（PuroR），永生化的人类乳腺成纤维细胞被分离（P2.2）。
Ba) 为了生成exp-CAFs，GFP+puroR 永生化的人类乳腺成纤维细胞与MCF-7-ras乳腺癌细胞共同皮下注射至免疫缺陷裸鼠（P3a）体内。移植后42天切除异种移植瘤（P4a），并解离为单细胞悬液（P5），随后对这些细胞进行培养 体外 在嘌呤霉素存在下培养以清除任何污染的癌细胞和小鼠间质细胞（P6）。获得的嘌呤霉素抗性细胞称为实验生成的CAF1（exp-CAF1）细胞。这些细胞在植入后第42天被切除，再次与MCF-7-ras细胞混合，并如前所述皮下植入宿主小鼠体内（P7a）。将所形成的肿瘤继续生长200天，随后解剖、解离，并在嘌呤霉素存在下进行培养。分离得到的嘌呤霉素抗性细胞称为exp-CAF2细胞（242天龄）。
Bb) 为分离对照细胞以对抗exp-CAFs，将GFP+puroR永生化的人乳腺成纤维细胞作为不含MCF-7-ras细胞的纯培养物皮下注射至裸鼠体内（P3b）。在植入后42天（P4b）分离成纤维组织，将其解离为单细胞悬液（P5），并如前所述分离出嘌呤霉素抗性细胞，命名为对照成纤维细胞-1（P6）。这些成纤维细胞再次在不含MCF-7-ras细胞的条件下皮下植入裸鼠体内，额外培养200天（P7b）。取出成纤维组织，进行解离，并在含嘌呤霉素的培养基中培养。分离得到的嘌呤霉素抗性细胞称为对照成纤维细胞-2（242天龄）。
<img alt="细胞蛋白表达；免疫荧光图像；实验组与对照组成纤维细胞；柱状图结果。" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2 实验组癌相关成纤维细胞（Exp-CAFs）与对照组成纤维细胞均来源于亲本人类乳腺成纤维细胞。（A） 对照组成纤维细胞-2（对照组成纤维细胞）与 exp-CAF2 细胞的免疫荧光分析。两种细胞类型均对间充质标志物（红色）呈阳性染色，包括人波形蛋白（vimentin）、脯氨酰-4-羟化酶（prolyl-4-hydroxylase）、胶原蛋白1A（collagen 1A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4 及成纤维细胞表面蛋白。 （B） 相反，表达绿色荧光蛋白（GFP，绿色）的 exp-CAF2 细胞中未检测到上皮细胞标志物广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）。细胞核使用 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色）。比例尺，50 μm（引自 Kojima 等11）
（C） exp-CAF2细胞和对照成纤维细胞-2细胞（对照f.）的免疫荧光染色，使用针对α-SMA（红色）或腱生蛋白-C（TN-C）（红色）的抗体。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺， 50 μm. (D) 48%的exp-CAF2细胞α-SMA染色呈阳性，而42天龄的exp-CAF1细胞中14%、对照组成纤维细胞-2细胞群中2.5%呈α-SMA阳性。（引自Kojima等11）

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<li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li>
<li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

缺乏针对CAF的特异性标志物以及CAF之间存在的高度异质性，使得对该细胞类型的表征本身即构成挑战。研究CAF 体外 还因这些细胞在长期培养过程中会发生衰老并停止增殖而受到阻碍。我们此前尝试使用逆转录病毒介导的hTERT cDNA构建体直接永生化原代CAFs未能成功。因此，为了进一步研究这些细胞的促肿瘤特性，我们开发了一种利用共移植肿瘤异种移植模型从人乳腺成纤维细胞生成永生化CAFs的方法。从乳房缩小成形术组织中分离得到的原代人乳腺成纤维细胞，在与乳腺癌细胞共同注射入小鼠体内之前先进行永生化处理。随后，从所形成的肿瘤异种移植物中分离出人成纤维细胞（详见图1Ba）。重要的是，在肿瘤进展过程中，这些人乳腺成纤维细胞逐渐演变为具有促肿瘤作用的肌成纤维细胞样CAFs。我们确实观察到，与42天或70天的exp-CAF1细胞及对照成纤维细胞-2细胞相比，242天的exp-CAF2细胞表现出更强的促肿瘤肌成纤维细胞特性。11. 这种促肿瘤的肌成纤维细胞特性在乳腺癌患者来源的CAFs中同样可见，其依赖于由TGF-β和SDF-1细胞因子介导的自分泌信号环路的建立11基因转移或癌细胞与成纤维细胞之...

<table><tbody><tr><td>DMEM </td><td>英杰</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 </td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白（V9）抗体</td><td>诺沃卡斯特拉实验室</td><td>&lt;p&gt;NCL-L-&lt;/p&gt;VIM-V9</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin C（BC-8）抗体</td><td></td><td></td><td>&lt;p&gt;一份来自&lt;br/&gt;博士 &lt;strong&gt;Luciano &lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;strong&gt;Zardi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;α-SMA-Cy3（1A4）抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;脯氨酰-4-羟化酶 &lt;/p&gt;</td><td>Dako</td><td>M0877</td><td></td></tr><tr><td>(5B5) 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I型胶原1A抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA011795</td><td></td></tr><tr><td>广谱细胞角蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5992</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;S100A4/FSP-1（成纤维细胞特异性蛋白-1）&lt;/p&gt;特异性蛋白-1（specific protein-1）抗体</td><td>Dako</td><td>A5114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;成纤维细胞表面蛋白 &lt;/p&gt;（克隆1B10）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11333</td><td></td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP 质粒构建体</td><td></td><td></td><td>向作者索取</td></tr><tr><td>pBabe-puro 载体</td><td></td><td></td><td>&lt;p&gt;购买 &lt;/p&gt;来自 Addgene</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>康宁</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>裸鼠</td><td>Taconic</td><td>NCRNU-F</td><td>雌性 NCr 裸鼠</td></tr><tr><td>C3H/10T1/2 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>CCL-226</td></tr></tbody></table>

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（cafs）

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

癌组织是由肿瘤细胞和称为“间质”的非癌性成分组成的复杂组织。间质包括细胞外基质（ECM）以及多种间充质细胞，如成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、周细胞和白细胞1-3。
肿瘤相关间质会对邻近癌细胞释放的大量旁分泌信号产生响应。在疾病发展过程中，间质常被癌相关成纤维细胞（CAFs）所占据，其中包括大量肌成纤维细胞。这些细胞此前已从多种不同类型的人类癌瘤组织中被分离提取用于研究 体外 培养。一部分CAF亚群可通过其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的上调而加以区分4,5这些细胞是“活化成纤维细胞”的特征性标志，具有与在损伤和纤维化组织中常见的肌成纤维细胞相似的特性。 6该肌成纤维细胞型CAFs亚群的存在与高级别恶性肿瘤密切相关，并且与患者的不良预后相关。
许多实验室（包括我们自己的实验室）已经证明，当将癌相关成纤维细胞（CAFs）与癌细胞共同注射到免疫缺陷小鼠体内时，能够显著促进肿瘤发生7-10。然而，从癌症患者体内分离得到的CAFs在体外传代培养过程中常常发生衰老，限制了其在持续实验研究中的广泛应用。为克服这一难题，我们开发了一种新颖的技术，利用共移植乳腺肿瘤异种移植模型，从人乳腺成纤维细胞实验性地生成永生化的人乳腺CAFs细胞系（exp-CAFs）。
为了获得实验性癌症相关成纤维细胞（exp-CAFs），首先从乳房缩小成形术组织中分离得到原代人乳腺成纤维细胞，并利用端粒酶全酶的催化亚基hTERT使其永生化，同时通过基因工程手段使其表达绿色荧光蛋白（GFP）和嘌呤霉素抗性基因。这些细胞随后与表达激活型 ras 将癌基因（MCF-7-ras细胞）植入小鼠异种移植模型。经过一段时间的孵育 体内最初注射的人乳腺成纤维细胞根据其嘌呤霉素抗性从肿瘤异种移植组织中提取 11.
我们观察到，定居的人类乳腺成纤维细胞在肿瘤进展过程中发生了分化，呈现出肌成纤维细胞样的表型，并获得了促进肿瘤的特性。重要的是，这些被定义为 exp-CAFs 的细胞，与从患者乳腺癌组织中分离得到的 CAFs 所具有的促肿瘤肌成纤维细胞表型非常相似。因此，我们从肿瘤异种移植模型中获得的 exp-CAFs 为研究人类乳腺癌中 CAFs 的生物学特性提供了一个有效的模型。所描述的实验方案也可拓展用于生成和表征来自其他类型人类癌组织的多种 CAF 群体。

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

癌组织是由肿瘤细胞和被称为“间质”的非癌性成分组成的复杂组织。间质包括……

本视频介绍了一种从原代培养的人类记忆细胞中生成癌相关成纤维细胞（calfs）的实验方法。癌组织是复杂的组织，由肿瘤细胞和被称为间质的非癌性成分组成。肿瘤相关的间质包含细胞外基质以及多种间质细胞，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、寄生虫和白细胞。其中富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞，是存在于肿瘤内部活化成纤维细胞的典型特征。基质细胞在驱动肿瘤进展中起着重要作用。这些细胞可在体外生成，首先从通过乳房缩小术获得的健康乳腺组织中分离原代人乳腺成纤维细胞。将获得的组织解离为单细胞悬液，然后通过病毒转导使其永生化，并通过基因工程使其表达GFP和嘌呤霉素抗性基因。随后将细胞与人乳腺癌MCF7细胞共同注射到免疫缺陷小鼠的皮下。注射的人类记忆成纤维细胞将演变为促进肿瘤发生的肌成纤维细胞。然后，从肿瘤异种移植模型中提取亲代正常乳腺成纤维细胞，并在嘌呤霉素存在条件下进行培养。所获得的嘌呤霉素抗性细胞被称为实验性生成的肿瘤相关成纤维细胞（calfs）或 exp calfs。免疫组织化学分析显示，最初存在的正常人乳腺成纤维细胞在肿瘤异种移植环境中演变为calf肌成纤维细胞，并获得了促进肿瘤发生的能力。该技术相较于现有方法（如从乳腺癌患者中分离原代cals）的主要优势在于，我们能够通过共移植肿瘤的方式，从人乳腺成纤维细胞实验性地生成calfs。演示该操作流程的通用模型将由我实验室的博士后研究员 Kar 和实验室的博士生 Ahmed Kar 担任。取一克从乳房缩小整形手术中分离得到的健康人乳腺组织开始实验。用磷酸盐缓冲液（PBS）将组织清洗数次，然后将组织放入一个15厘米的培养皿中，使用无菌剃刀片将其切碎成体积小于1.5立方毫米的小片段。接下来，使用剃刀片将组织碎片转移至一个15毫升锥形管中，每半克组织加入10毫升细胞解离缓冲液。然后以最大速度涡旋震荡一分钟。将试管置于37摄氏度培养箱中的摇床上，使组织碎片消化12至18小时。第二天，离心管涡旋中仍会残留大量未消化的组织碎片。首先以最高速度离心，然后将离心管置于实验台面上，在室温下静置孵育五分钟，期间不进行任何震荡。孵育结束后，使用5毫升生理学移液管将所得富含基质细胞的上清液转移至新的锥形管中。然后以250 × g离心stromal组分5分钟。离心后，将细胞沉淀重悬于PBS中，再以250 × g离心5分钟。随后将沉淀重悬于添加了10% FCS的DMEM培养基中，并转移至直径15厘米的培养皿中。将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。培养8至10天后，细胞应达到汇合状态。此时，收集细胞并可进行长期冻存。为了永生化所分离的原代人正常记忆成纤维细胞，引入表达 H turt 和 GFP 的逆转录病毒 P MIG 载体，培养细胞四到五天，然后通过流式细胞术分选 GFP 阳性细胞。将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒 P babe puro 载体导入 GFP 标记的永生化成纤维细胞中，在终浓度为每毫升 1 微克的嘌呤霉素存在下培养细胞五至七天。分离表达GFP标记且具有嘌呤霉素抗性的永生化人记忆成纤维细胞。接下来检测这些成纤维细胞是否产生具有活性的病毒，从而介导编码GFP和嘌呤霉素抗性基因的水平转移。将2.5 × 10⁵个具有嘌呤霉素抗性的永生化人记忆成纤维细胞接种于6厘米培养皿中，培养两天。用孔径为0.45微米的注射器滤器收集并过滤成纤维细胞的条件培养基。然后将其加入含有10个半量小鼠成纤维细胞的培养物中，在每毫升5微克蛋白硫酸盐存在下培养12小时，该处理可提高12小时后的病毒感染效率。之后将培养基更换为添加了10% FCS的DMEM，继续培养额外两天。通过荧光显微镜观察细胞。感染了GFP病毒的10个T细胞及其一半子代细胞将呈GFP阳性。现在更换培养基，用每毫升1微克的浓度处理细胞。用嘌呤霉素处理五到七天。再次通过荧光显微镜观察细胞，以确定是否有嘌呤霉素抗性的单层半细胞形成克隆。请注意，由亲代嘌呤霉素抗性且GFP标记的人乳腺成纤维细胞产生的具有活性的病毒所介导的水平基因转移，可能会使周围的嘌呤霉素敏感型小鼠细胞及癌细胞获得抗性。在肿瘤异种移植体中具有嘌呤霉素抗性且GFP呈阳性。这可能会阻碍从肿瘤异种移植体中分离出注射用的GFP标记且嘌呤霉素抗性的纯人乳腺成纤维细胞，从而影响实验性地生成可用于注射至免疫缺陷小鼠中的癌相关成纤维细胞的过程。首先，将刚制备的人乳腺细胞系与人乳腺癌细胞系MCF7 RAs分别加入新的微量离心管中进行胰酶消化并计数。将1×10⁶个mc777RAs人乳腺癌细胞和3×10⁶个GFP标记的嘌呤霉素抗性永生化人乳腺成纤维细胞重悬于400微升含50%Matrigel的培养基中，每注射点使用该悬液。将试管置于冰上作为对照。同时准备不含MCF7 RAs细胞的相同人乳腺成纤维细胞。接下来，使用27号针头将细胞混合物注射到免疫缺陷裸鼠的皮下部位，以检测肿瘤内成纤维细胞表型的异质性。从多个不同的肿瘤异种移植模型中分离成纤维细胞及对照成纤维细胞。然后将每种混合物分别植入每只小鼠的左右两侧。注射后让肿瘤或成纤维细胞异种移植物生长42天。成纤维细胞在肿瘤异种移植物内的孵育时间应根据亲代成纤维细胞在肿瘤中获得的肌成纤维细胞表型进行优化。将安乐死小鼠体内的移植物组织取出，分别取至少0.5克的对照成纤维细胞或实验成纤维细胞移植物组织，置于不同的培养皿中。接着，使用无菌剃刀片将组织切成小于1.5立方毫米的小组织碎片。然后用剃刀片将组织碎片转移至含有细胞解离缓冲液的15毫升锥形管中，涡旋震荡1分钟至最大速度。将细胞悬液在37摄氏度下孵育3小时，同时持续缓慢振荡，随后离心细胞悬液。将细胞从肿瘤组织或玻璃纤维sano移植物中分离后，在250 × g条件下离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并重复离心一次。随后将所得细胞沉淀重悬于添加了10% FCS的DMEM培养基中，以分离嘌呤霉素抗性的亲本人类乳腺成纤维细胞培养物。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，将来源于肿瘤或成纤维细胞的细胞漂浮培养于含有1微克/毫升嘌呤霉素的15厘米培养皿中。此步骤将清除任何污染的癌细胞和/或小鼠来源的细胞。将间充质细胞在冷冻培养基中扩增至共培养状态后，于零下80摄氏度保存。需要注意的是，获得的嘌呤霉素抗性细胞被命名为42日龄XP小牛1号或对照成纤维细胞1号细胞，这些细胞具有永生性且GFP呈阳性。人源记忆成纤维细胞在肿瘤异种移植过程中通过与癌细胞相互作用，增强了其促肿瘤的肌成纤维细胞表型。将1×10⁶个MCF7 RAs细胞与3×10⁶个42日龄P小牛细胞混合。在1.5毫升离心管中，将一细胞与含50% Matrigel的400微升培养基混合进行强力注射。同时，在另一离心管中准备三份10的6次方个42日龄对照成纤维细胞一细胞，不含癌细胞。为进一步增强exp calf一细胞的促肿瘤性肌成纤维细胞表型，将这些细胞与CF7 RA细胞混合后皮下注射至裸鼠体内。如需制备对照细胞，可单独注射不含癌细胞的对照成纤维细胞一细胞。将exp calf one细胞在肿瘤异种移植体内继续孵育200天，以生成exp C two细胞，从而增强其促进肿瘤的肌成纤维细胞表型。同时生成对照组。通过将未与癌细胞共注射的对照成纤维细胞one细胞注入小鼠体内，取出肿瘤并置于组织培养皿中，获得对照成纤维细胞two细胞，作为exp calf two细胞的对照。将肿瘤或成纤维细胞的异种移植组织解剖并解离为单细胞悬液后进行培养。将细胞接种于15厘米的培养皿中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基（10% FCS-DMEM），并在嘌呤霉素存在条件下培养，直至细胞达到完全汇合，随后使用冻存液将细胞在-80 °C条件下保存。获得的嘌呤霉素抗性细胞命名为242日龄exp calf 2细胞或对照成纤维细胞2细胞。经GFP标记的exp calf 2细胞及对照成纤维细胞2细胞均提取自乳腺肿瘤异种移植模型，其经免疫组织化学分析结果如图所示：这些细胞对多种间充质标志物呈强阳性染色，包括人特异性波形蛋白（vimentin）、脯氨酸4-羟化酶、I型胶原蛋白（collagen I A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4以及成纤维细胞表面蛋白（fibroblast surface protein）。这些结果表明这些细胞具有人类来源及间充质特性。相比之下，作为上皮细胞标志物的细胞角蛋白在上述GFP阳性成纤维细胞中未见染色。这些发现提示，实验组C2和对照组成纤维细胞2细胞均来源于最初接种至小鼠异种移植模型中的人乳腺成纤维细胞。重要的是，与对照组成纤维细胞二代细胞相比，实验组小牛二代细胞中表达α-SMA和细胞外基质糖蛋白nasin C的细胞数量显著增多，这两种分子均为肌成纤维细胞的标志物。需要注意的是，与42天龄的实验组小牛一代细胞相比，实验组小牛二代细胞中α-SMA阳性肌成纤维细胞的比例更高。这些数据表明，在肿瘤异种移植瘤进展过程中，定居的人类记忆成纤维细胞会逐渐转化为小牛肌成纤维细胞，并持续至肿瘤发育完成后。互补性肿瘤异种移植模型为研究肿瘤微环境中正常成纤维细胞向癌相关成纤维细胞演化过程的研究人员铺平了道路。因此，成纤维细胞如此说。

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Medicine

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从人类乳腺成纤维细胞癌相关的成纤维细胞的实验发电（CAFS）

癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。...

三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

该方法的目的是获得成纤维细胞来源的三维基质，作为后续细胞实验的天然支架。将成纤维细胞接种于预处理的培养板中，并用抗坏血酸刺激以生成基质。随后对基质进行脱细胞处理并阻断，以用于培养相关细胞（例如内皮细胞）。...

成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

提供了一种共注射癌细胞和成纤维细胞并随时间监测肿瘤生长的实验方案。该方案可用于理解成纤维细胞作为肿瘤生长调控因子的分子基础。...

一种用于研究肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤生长中作用的小鼠模型

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。...

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

采用肺腺癌细胞、成纤维细胞和单核细胞制备多细胞三维肿瘤球体，随后从这些球体中分离出肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）。将分离得到的CAFs与正常成纤维细胞进行比较，通过检测线粒体膜电位、活性氧水平及酶活性来评估线粒体功能状态。...

评估从三维多细胞肺癌球体中分离出的肿瘤相关成纤维细胞的线粒体健康状况

本方案概述了培养、操作和分析小鼠CAFs的方法，包括 体外/体内...

小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

本方案提供了从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化成纤维细胞的完整操作流程。此外，还介绍了利用条件培养基处理和共培养技术评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间相互作用功能效应的实验方法。...

前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养与表征

本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。...

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

了解从原代人乳腺成纤维细胞生成癌相关成纤维细胞（CAFs）的实验方法。该技术通过共植入肿瘤异种移植模型，使正常成纤维细胞在肿瘤微环境中逐步转化为促进肿瘤进展的肌成纤维细胞。

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

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