从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

本视频介绍了一种从原代培养的人类记忆细胞中生成癌相关成纤维细胞（calfs）的实验方法。癌组织是复杂的组织，由肿瘤细胞和被称为间质的非癌性成分组成。肿瘤相关的间质包含细胞外基质以及多种间质细胞，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、寄生虫和白细胞。其中富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞，是存在于肿瘤内部活化成纤维细胞的典型特征。

基质细胞在驱动肿瘤进展中起着重要作用。这些细胞可在体外生成，首先从通过乳房缩小术获得的健康乳腺组织中分离原代人乳腺成纤维细胞。将获得的组织解离为单细胞悬液，然后通过病毒转导使其永生化，并通过基因工程使其表达GFP和嘌呤霉素抗性基因。

随后将细胞与人乳腺癌MCF7细胞共同注射到免疫缺陷小鼠的皮下。注射的人类记忆成纤维细胞将演变为促进肿瘤发生的肌成纤维细胞。

然后，从肿瘤异种移植模型中提取亲代正常乳腺成纤维细胞，并在嘌呤霉素存在条件下进行培养。所获得的嘌呤霉素抗性细胞被称为实验性生成的肿瘤相关成纤维细胞（calfs）或 exp calfs。免疫组织化学分析显示，最初存在的正常人乳腺成纤维细胞在肿瘤异种移植环境中演变为calf肌成纤维细胞，并获得了促进肿瘤发生的能力。该技术相较于现有方法（如从乳腺癌患者中分离原代cals）的主要优势在于，我们能够通过共移植肿瘤的方式，从人乳腺成纤维细胞实验性地生成calfs。

演示该操作流程的通用模型将由我实验室的博士后研究员 Kar 和实验室的博士生 Ahmed Kar 担任。取一克从乳房缩小整形手术中分离得到的健康人乳腺组织开始实验。用磷酸盐缓冲液（PBS）将组织清洗数次，然后将组织放入一个15厘米的培养皿中，使用无菌剃刀片将其切碎成体积小于1.5立方毫米的小片段。

接下来，使用剃刀片将组织碎片转移至一个15毫升锥形管中，每半克组织加入10毫升细胞解离缓冲液。然后以最大速度涡旋震荡一分钟。将试管置于37摄氏度培养箱中的摇床上，使组织碎片消化12至18小时。

第二天，离心管涡旋中仍会残留大量未消化的组织碎片。首先以最高速度离心，然后将离心管置于实验台面上，在室温下静置孵育五分钟，期间不进行任何震荡。孵育结束后，使用5毫升生理学移液管将所得富含基质细胞的上清液转移至新的锥形管中。

然后以250 × g离心stromal组分5分钟。离心后，将细胞沉淀重悬于PBS中，再以250 × g离心5分钟。随后将沉淀重悬于添加了10% FCS的DMEM培养基中，并转移至直径15厘米的培养皿中。

将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。培养8至10天后，细胞应达到汇合状态。此时，收集细胞并可进行长期冻存。

为了永生化所分离的原代人正常记忆成纤维细胞，引入表达 H turt 和 GFP 的逆转录病毒 P MIG 载体，培养细胞四到五天，然后通过流式细胞术分选 GFP 阳性细胞。将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒 P babe puro 载体导入 GFP 标记的永生化成纤维细胞中，在终浓度为每毫升 1 微克的嘌呤霉素存在下培养细胞五至七天。

分离表达GFP标记且具有嘌呤霉素抗性的永生化人记忆成纤维细胞。接下来检测这些成纤维细胞是否产生具有活性的病毒，从而介导编码GFP和嘌呤霉素抗性基因的水平转移。将2.5 × 10⁵个具有嘌呤霉素抗性的永生化人记忆成纤维细胞接种于6厘米培养皿中，培养两天。

用孔径为0.45微米的注射器滤器收集并过滤成纤维细胞的条件培养基。然后将其加入含有10个半量小鼠成纤维细胞的培养物中，在每毫升5微克蛋白硫酸盐存在下培养12小时，该处理可提高12小时后的病毒感染效率。之后将培养基更换为添加了10% FCS的DMEM，继续培养额外两天。

通过荧光显微镜观察细胞。感染了GFP病毒的10个T细胞及其一半子代细胞将呈GFP阳性。现在更换培养基，用每毫升1微克的浓度处理细胞。

用嘌呤霉素处理五到七天。再次通过荧光显微镜观察细胞，以确定是否有嘌呤霉素抗性的单层半细胞形成克隆。请注意，由亲代嘌呤霉素抗性且GFP标记的人乳腺成纤维细胞产生的具有活性的病毒所介导的水平基因转移，可能会使周围的嘌呤霉素敏感型小鼠细胞及癌细胞获得抗性。

在肿瘤异种移植体中具有嘌呤霉素抗性且GFP呈阳性。这可能会阻碍从肿瘤异种移植体中分离出注射用的GFP标记且嘌呤霉素抗性的纯人乳腺成纤维细胞，从而影响实验性地生成可用于注射至免疫缺陷小鼠中的癌相关成纤维细胞的过程。首先，将刚制备的人乳腺细胞系与人乳腺癌细胞系MCF7 RAs分别加入新的微量离心管中进行胰酶消化并计数。

将1×10⁶个mc777RAs人乳腺癌细胞和3×10⁶个GFP标记的嘌呤霉素抗性永生化人乳腺成纤维细胞重悬于400微升含50%Matrigel的培养基中，每注射点使用该悬液。将试管置于冰上作为对照。

同时准备不含MCF7 RAs细胞的相同人乳腺成纤维细胞。接下来，使用27号针头将细胞混合物注射到免疫缺陷裸鼠的皮下部位，以检测肿瘤内成纤维细胞表型的异质性。从多个不同的肿瘤异种移植模型中分离成纤维细胞及对照成纤维细胞。

然后将每种混合物分别植入每只小鼠的左右两侧。注射后让肿瘤或成纤维细胞异种移植物生长42天。成纤维细胞在肿瘤异种移植物内的孵育时间应根据亲代成纤维细胞在肿瘤中获得的肌成纤维细胞表型进行优化。

将安乐死小鼠体内的移植物组织取出，分别取至少0.5克的对照成纤维细胞或实验成纤维细胞移植物组织，置于不同的培养皿中。接着，使用无菌剃刀片将组织切成小于1.5立方毫米的小组织碎片。然后用剃刀片将组织碎片转移至含有细胞解离缓冲液的15毫升锥形管中，涡旋震荡1分钟至最大速度。将细胞悬液在37摄氏度下孵育3小时，同时持续缓慢振荡，随后离心细胞悬液。

将细胞从肿瘤组织或玻璃纤维sano移植物中分离后，在250 × g条件下离心5分钟。用PBS重悬细胞沉淀，并重复离心一次。随后将所得细胞沉淀重悬于添加了10% FCS的DMEM培养基中，以分离嘌呤霉素抗性的亲本人类乳腺成纤维细胞培养物。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，将来源于肿瘤或成纤维细胞的细胞漂浮培养于含有1微克/毫升嘌呤霉素的15厘米培养皿中。此步骤将清除任何污染的癌细胞和/或小鼠来源的细胞。

将间充质细胞在冷冻培养基中扩增至共培养状态后，于零下80摄氏度保存。需要注意的是，获得的嘌呤霉素抗性细胞被命名为42日龄XP小牛1号或对照成纤维细胞1号细胞，这些细胞具有永生性且GFP呈阳性。人源记忆成纤维细胞在肿瘤异种移植过程中通过与癌细胞相互作用，增强了其促肿瘤的肌成纤维细胞表型。将1×10⁶个MCF7 RAs细胞与3×10⁶个42日龄P小牛细胞混合。

在1.5毫升离心管中，将一细胞与含50% Matrigel的400微升培养基混合进行强力注射。同时，在另一离心管中准备三份10的6次方个42日龄对照成纤维细胞一细胞，不含癌细胞。为进一步增强exp calf一细胞的促肿瘤性肌成纤维细胞表型，将这些细胞与CF7 RA细胞混合后皮下注射至裸鼠体内。如需制备对照细胞，可单独注射不含癌细胞的对照成纤维细胞一细胞。

将exp calf one细胞在肿瘤异种移植体内继续孵育200天，以生成exp C two细胞，从而增强其促进肿瘤的肌成纤维细胞表型。同时生成对照组。通过将未与癌细胞共注射的对照成纤维细胞one细胞注入小鼠体内，取出肿瘤并置于组织培养皿中，获得对照成纤维细胞two细胞，作为exp calf two细胞的对照。

将肿瘤或成纤维细胞的异种移植组织解剖并解离为单细胞悬液后进行培养。将细胞接种于15厘米的培养皿中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基（10% FCS-DMEM），并在嘌呤霉素存在条件下培养，直至细胞达到完全汇合，随后使用冻存液将细胞在-80 °C条件下保存。获得的嘌呤霉素抗性细胞命名为242日龄exp calf 2细胞或对照成纤维细胞2细胞。经GFP标记的exp calf 2细胞及对照成纤维细胞2细胞均提取自乳腺肿瘤异种移植模型，其经免疫组织化学分析结果如图所示：这些细胞对多种间充质标志物呈强阳性染色，包括人特异性波形蛋白（vimentin）、脯氨酸4-羟化酶、I型胶原蛋白（collagen I A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4以及成纤维细胞表面蛋白（fibroblast surface protein）。

这些结果表明这些细胞具有人类来源及间充质特性。相比之下，作为上皮细胞标志物的细胞角蛋白在上述GFP阳性成纤维细胞中未见染色。这些发现提示，实验组C2和对照组成纤维细胞2细胞均来源于最初接种至小鼠异种移植模型中的人乳腺成纤维细胞。

重要的是，与对照组成纤维细胞二代细胞相比，实验组小牛二代细胞中表达α-SMA和细胞外基质糖蛋白nasin C的细胞数量显著增多，这两种分子均为肌成纤维细胞的标志物。需要注意的是，与42天龄的实验组小牛一代细胞相比，实验组小牛二代细胞中α-SMA阳性肌成纤维细胞的比例更高。这些数据表明，在肿瘤异种移植瘤进展过程中，定居的人类记忆成纤维细胞会逐渐转化为小牛肌成纤维细胞，并持续至肿瘤发育完成后。

互补性肿瘤异种移植模型为研究肿瘤微环境中正常成纤维细胞向癌相关成纤维细胞演化过程的研究人员铺平了道路。因此，成纤维细胞如此说。