使用数字免疫荧光显微镜对大鼠软脑膜小动脉中雌激素受体-α的成像

本实验的总体目标是描述一种简单技术，用于优化雌激素受体α的染色与可视化，所用材料为取自雌性大鼠脑组织的软脑膜动脉横切片。该方法首先从脑表面剥离经伊文思蓝染色的软脑膜动脉，切片后利用冷冻切片机将其切成8微米厚的环状切片。将横切片贴附于载玻片上，随后与抗雌激素受体α的一抗孵育。

接下来，将切片与含 dpi 的封片剂中的二抗和复染剂共同孵育。最后，使用扩展焦深软件将荧光标记的剥离血管节段成像并转换为二维图像。最终，可通过配备扩展焦深软件的尼康免疫荧光显微镜获得显示剥离小动脉雌激素受体 α 的结果。

我叫Marguerite Littleton Kearney博士。今天，我实验室的博士后研究员Neil Far ani博士将演示一种简单的方法，以优化雌激素受体α在切片中的可视化与染色效果。

使用伊文思蓝染色灌注并储存在零下70摄氏度的大鼠脑部的动脉。在解剖显微镜下，辨认脑表面的穿支动脉，并用尖头镊子将其剥离。小心去除任何附着的脑组织。

将动脉置于冰上的小试管中。在0.1摩尔PBS中用2%冷多聚甲醛固定动脉30分钟。为准备切片，将包埋介质倾注于设定为-20摄氏度的冷冻台上。

将一段动脉平放在载物台上，等待其冻结。待其完全冻结后，将动脉直立置于冷冻切片机冷冻盘的包埋介质中，确保动脉尖端朝前。

用镊子夹住动脉直至其完全冻结。将带有动脉的冷冻盘放入冷冻切片机头中，直接在载玻片上切割八微米厚的动脉环切片。将动脉切片贴附于铬钾明胶上。

使用两把画笔整理动脉环的载玻片。将制备好的载玻片放入载玻片盒中，于4°C冰箱内过夜保存。从冰箱中取出载玻片，并在实验台面上恢复至室温。

加入 1 至 1.5 毫升 0.1 摩尔 PBS 洗涤载玻片，10 分钟后弃去 PBS，重复洗涤两次。最后一次 PBS 洗涤后，在室温下用 1 毫升 50 毫摩尔氯化铵孵育 30 分钟，以降低内源性荧光。随后按照前述方法，用 0.1 摩尔 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。接下来，将载玻片置于含有 0.1% Triton X-100 和 1% 正常山羊血清的 PBS 溶液中封闭 30 分钟，以减少一抗的非特异性结合。

封闭后，将切片与一抗（ER alpha 抗体）在封闭液中按 1:500 的比例稀释，于 4 摄氏度孵育过夜。从冰箱中取出切片，恢复至室温。用 0.1% PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟，每次使用 1 至 1.5 毫升，以去除未结合的一抗。

每次孵育后，在室温避光条件下，将切片与含Oregon Green 488标记的山羊抗兔二抗的封闭液共同孵育2小时；随后用0.1 mol/L PBS洗涤切片3次，每次10分钟，然后将切片转移至通风橱中。在组织样本上滴加含DAPY的封片剂，再盖上盖玻片。用透明指甲油封固盖玻片边缘，并使其完全干燥。

将染色后的果皮导管片段的预处理玻片置于显微镜下，调整焦距以观察荧光标记的目标区域。染色的内质网α受体的可视化是本实验步骤中最困难的部分。需找到切面最清晰、受体信号最明确的导管层面。

从100倍放大开始，然后将放大倍数增加至600倍。使用相机在DPI通道和ZI通道分别采集细胞核和DR alpha的图像，然后使用软件将血管节段的多个视图转换为二维图像。此处显示的是ER alpha免疫荧光染色结果（绿色）以及DPI复染的结果。

在从雌性大鼠脑组织中分离出的软脑膜动脉环中，蓝色显示的融合图像提示存在核内雌激素受体α。通过结合使用Zack图像，可获得聚焦的ERα免疫荧光图像，以排除自发荧光的干扰；因此，针对一抗和二抗均应进行自发荧光阴性对照实验。请注意，未经二抗孵育的动脉内皮侧显示出明显的自发荧光。

观看本视频后，您应了解如何分离并剥离脑表面的动脉，以及如何制备八微米的横截面环。此外，您还应熟悉如何使用荧光标记的雌激素受体α，并通过数字免疫荧光显微镜及尼康扩展软件对受体进行可视化观察。