Name: 使用数字免疫荧光显微镜成像在大鼠软脑膜小动脉雌激素受体α (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习使用数字免疫荧光显微镜成像技术检测大鼠软脑膜小动脉中的雌激素受体α。该方法通过优化染色流程，实现ERα在血管组织中的清晰可视化，为神经科学研究提供可靠的技术支持。

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本项目的工作得到了美国国立卫生研究院（R01-NR5339）和健康科学统一服务大学（R061LD）基金的资助。

1. 软脑膜动脉的分离与制备
<ol>
	<li>在大鼠麻醉状态下，插入并固定导管至动脉，用含1%伊文思蓝的1×PBS灌注。伊文思蓝染料可使软脑膜血管着色良好，便于分离。</li>
	<li>取出脑组织，保存于-70°C，直至使用。最佳保存时间不应超过2个月。</li>
	<li>在解剖显微镜下，从脑表面分离软脑膜小动脉（平均直径35–50 μm）。使用尖头镊子仔细从大脑皮层的背侧和外侧表面剥离所有染成蓝色的小动脉。在放入固定液前，去除附着的多余皮层组织。</li>
	<li>将收获的小动脉置于含2%冷多聚甲醛的0.1 M PBS中固定30分钟。</li>
	<li>为准备切片，将包埋介质倾注于冷冻台/持样头（设定温度为-20°C）上。</li>
	<li>将小动脉切段平放于持样头上，待其冻结。将血管牢固地直立放置于恒冷箱切片机的冷冻台上，包埋介质朝下，动脉尖端朝向操作者。用镊子夹持直至完全冻结。</li>
	<li>将带有血管的冷冻台放入恒冷箱切片机头部，用切片机切出8 μm厚的软脑膜小动脉环。</li>
	<li>将小动脉切片贴附于铬钾明胶处理的载玻片上。</li>
	<li>将制备好的载玻片置于玻片盒中，于4°C冰箱内过夜保存。</li>
</ol>
2. ER-α 免疫荧光染色
第1天
<ol>
	<li>从冰箱中取出载玻片；将其恢复至室温。</li>
	<li>清洗载玻片时，加入1–1.5 ml 0.1M PBS（足以覆盖所有组织切片），静置10分钟，倾去液体，重复此步骤两次。载玻片每一边缘均用疏水性标记笔标记，因此液体可保留在载玻片表面。每次清洗时均倾去原有液体，并更换新鲜的0.1 M PBS。</li>
	<li>将载玻片在1 ml 50 mM氯化铵溶液中室温孵育30分钟，以降低内源性荧光。</li>
	<li>按照步骤2.2所述方法，用0.1M PBS清洗载玻片，每次10分钟，共清洗3次。</li>
	<li>用含0.1% Triton-X 100和1%正常山羊血清（NGS）的PBS溶液封闭载玻片，室温孵育30分钟，以减少非特异性结合。</li>
	<li>将样本与一抗（兔多克隆抗ER-α抗体；1:500）在含0.1% Triton-X 100和1% NGS的PBS溶液中4°C孵育过夜。</li>
</ol>
第2天
<ol start="7">
	<li>从冰箱中取出载玻片；将其恢复至室温。</li>
	<li>用 0.1 M PBS 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗 3 次，操作同 2.2 节所述。</li>
	<li>在避光条件下，室温孵育 Oregon Green 488 标记的羊抗兔二抗（溶于含 1% NGS、0.1% Triton-X100 的 PBS 中）2 小时。从本步骤开始，后续所有操作均需在避光条件下进行。</li>
	<li>用 0.1 M PBS 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗 3 次，操作同 2.2 节所述。</li>
	<li>在通风橱内，于样本上滴加一滴 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）与封片剂的混合液，然后盖上盖玻片。</li>
	<li>用透明指甲油封固盖玻片边缘。在完全干燥前（约需 24 小时）不要移动载玻片。</li>
</ol>
3. 数字荧光成像
<ol>
	<li>为成像软脑膜血管切片中的ER-α，我们使用配备数字相机和三种荧光滤光片（蓝色、绿色和红色）的尼康Eclipse 80i数字荧光显微镜。</li>
	<li>将染色后的软脑膜血管段切片置于显微镜下，调整焦距以观察荧光标记的目标区域。先使用100倍放大倍数，随后提高至600倍。</li>
	<li>使用相机通过尼康Extended Depth Focus软件在DAPI（蓝色）和FITC（绿色）通道中采集细胞核（DAPI）和ER-α（Oregon Green）的图像，将血管段的多个视野合成为二维图像。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
我们使用荧光探针定位了软脑膜动脉血管中的雌激素受体-α，并通过数字荧光显微镜优化了该受体的可视化效果。为了检测该受体的存在，采用兔多克隆一抗和 Oregon Green 488 标记的二抗对从脑表面分离的软脑膜动脉中的受体进行成像。同时，使用核染料（DAPI）标记细胞核，以确定我们是否能够检测到位于细胞核内的受体，因为已有文献报道 ER-α 可存在于细胞质和细胞核中。此外，我们还进行了验证性实验，以确认一抗的特异性，并验证二抗与一抗的结合。
<img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="显微镜图像；经荧光染色的细胞结构；蛋白质定位示意图；科研。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 对雌性大鼠脑部软脑膜动脉环进行ER-α（绿色）免疫荧光染色，并用DAPI复染（蓝色）。图1A为合并图像，提示存在部分核内雌激素受体-α（箭头所示）。图1B和1C为ER-α的聚焦图像，由Z轴层扫图像叠加而成。图像放大倍数为600倍，来自同一血管环状切片的不同焦平面。箭头指示雌激素受体-α。
<img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="荧光显微镜图像；细胞内蛋白质定位；左侧：低表达，右侧：高表达" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 来自雌性大鼠脑部软脑膜动脉环对照组的免疫荧光染色结果。图 2D 显示未使用一抗的血管样本。图 2E 显示未使用二抗的血管样本（注意沿内皮侧明显的自发荧光）。图像以 ×600 放大倍数拍摄，来自同一血管切开后环状组织的不同成像平面。

<ol><li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+compounds%2C+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li>
<li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+estrogens%3A+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li>
<li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+effects+of+oestrogen%3A+multiplicity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Parmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li>
<li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels%3A+regulation+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li>
<li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha%2C+but+not+-beta%2C+in+en+face+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li>
<li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+my+antibody+staining+specific%3F+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li>
<li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+and+Circ%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li>
<li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li>
<li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li>
<li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEBJ+Abstracts%22%5BJournal%5D)">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxical.+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li>
<li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+immunoreactants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li>
</ol>

文中观点仅代表作者个人立场，不代表健康科学统一服务大学、美国国防部或美国政府的官方政策或立场。

此前，我们发现，在经历短暂性全脑缺血性脑损伤后，年轻卵巢切除大鼠的软脑膜动脉对血管扩张剂7, 8和血管收缩剂9引起管径变化的能力显著降低。长期补充雌激素可恢复血管运动反应7-9。此外，延迟给予雌激素替代会逆转雌激素对软脑膜动脉血管舒张功能的有益作用10，这促使我们质疑长期雌激素缺乏是否会影响脑血管系统中雌激素受体-α（ER-α）的密度。我们原计划采用免疫荧光标记结合Western印迹法，评估慢性雌激素缺乏对ER-α表达水平的影响。由于我们在观察受体的离散分布时遇到了一些困难，因此对方法进行了改进，本文即展示这一优化后的方法。因此，本研究的主要目标是首先建立一种相对简便的方法，以优化软脑膜小动脉中受体的可视化效果。与多项研究报道一致6,11,12，我们发现有必要根据所检测组织的类型、样本厚度、ER-α在血管中的分布情况以及非特异性结合程度等因素对实验条件进行调整。
我们的方法在可视化软脑膜血管切片中ER-α的存在方面非常有效。但正如其他研究者先前指出的，这些方法的成功应用在很大程度上取决于抗体的特异性与浓度、目标蛋白的亚细胞定位、固定与封闭方案以及组织处理方式12。在对血管样本进行可视化之前，我们花费了时间优化上述各项变量。本文中我们已重点说明了在该过程中对部分实验方案进行的调整。
我们旨在对软脑膜小动脉中的ER-α进行最佳可视化，这一目标带来了一些挑战。首先，大鼠软脑膜动脉的平均直径为35–50 μm，使其从脑表面分离和取出具有一定的难度。我们发现，在处死前通过灌注伊文思蓝染料可使动脉解剖过程更为容易。伊文思蓝可能影响荧光信号，但我们认为使用该染料的优势远大于其轻微的不利影响。在本方案中，血管经过多次洗涤，以最大限度减少血管内残留的染料，从而降低染料对荧光的潜在干扰。我们遇到的另一个困难是软脑膜血管节段较厚，导致受体的清晰成像较为困难。此外，我们未能获得特别清晰的图像，可能是因为ER-α分散于多个细胞层中。我们曾尝试采用纵向血管切片（如其他研究者所用），但由于软脑膜血管尺寸较小，即使在显微镜下操作，也难以处理血管并防止其在载玻片上发生扭曲。最终，我们成功改进了技术，使用冷冻切片机将血管横向切割成8 μm厚的环状切片。这些环状切片更易于操作，且可在同一张载玻片上放置多个样本。
在获取血管后，我们认为有必要检验Danseshatalb及其同事建议的先对组织进行速冻再固定血管的方法的有效性11。尽管我们发现该方法仅略微降低了免疫荧光背景，但也注意到受体染色强度减弱，导致受体的可视化更加困难。因此，我们更倾向于首先将整个脑组织冷冻并保存至需要时使用（通常为1至2个月）。随后，我们按照所述方法剥离血管，并在使用冷冻切片机切片前对血管进行固定，正如本文所展示的那样。
一个必要的步骤是分别使用一抗和二抗进行对照实验，以确定免疫荧光的特异性和背景信号。雌激素受体-α 抗体可能较难操作。事实上，在获得满意的受体染色结果之前，我们尝试了3种不同的一抗（1种单克隆抗体和2种多克隆抗体）。作为对照的一部分，我们首先通过省略一抗的添加来验证一抗的特异性。图2D显示了未加一抗的血管样本，其中无染色信号，仅有轻微背景信号。由于该一抗为多克隆抗体，存在一定程度的弥散性非特异性背景染色。其次，我们加入了一抗但未加二抗（图2E）。可以观察到沿血管内皮边界呈现的自发荧光清晰轮廓。这一现象与Dan及其同事5的研究结果一致。然而，代表ER-α的微小免疫荧光点以及反映大量受体存在的颗粒状结构，均需在一抗和二抗共同作用下才能被检测到。我们注意到血管内皮边缘存在明显的自发荧光分布模式。这些针对抗体特异性的独立验证实验非常重要，因为它们证实了一抗对ER-α的特异性，以及二抗能够特异性结合一抗。
总之，正如其他研究者所证实的那样4, 5，脑血管中含有大量的ER-α亚型受体。在我们的实验中，制备8μm厚的分离软脑膜动脉横切片可增强受体的染色效果和可视化程度。传统方法采用共聚焦显微镜观察样本，而共聚焦显微镜的一个重要优势在于能够对厚样本进行连续光学切片观察。然而，购置一台性能良好的共聚焦显微镜可能非常昂贵。通过使用扩展景深（EDF）软件，我们发现可以显著降低设备成本。利用配备EDF功能的荧光显微镜，我们获得了清晰的图像，并可通过Z轴堆叠在多个层面观察软脑膜动脉中的ER-α受体。EDF软件的一个显著优势是，它能够以有效的方式整合图像，从而生成三维图像。对于无法获得共聚焦显微镜或缺乏购置资金的实验室而言，配备合适软件的数字荧光显微镜可能是一种实用且成本较低的替代方案，具体选择取决于研究者的研究目标。

<table><tbody><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5493</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>VWR international</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>ER-&amp;alpha; 兔多克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>H-184</td><td></td></tr><tr><td>Oregon green 488 标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>O-11038</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 荧光封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

使用数字免疫荧光显微镜对大鼠软脑膜小动脉中雌激素受体-α的成像

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

雌激素对血管反应性的许多作用是通过与雌激素受体相互作用介导的1, 2, 3。尽管存在两种亚型（雌激素受体-α和β），但利用荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜技术，已在软脑膜动脉节段的平滑肌细胞和内皮细胞中鉴定出雌激素受体-α4。此外，在大鼠基底动脉的细胞核和细胞质中也发现了ER-α5。这些受体数量丰富且荧光信号强，但由于其分布于软脑膜血管节段的多层细胞中，因此难以清晰观察到成簇的受体群。此外，许多采用免疫组织化学技术结合共聚焦显微镜的研究未能详细说明实验可重复所需的关键条件6。本文旨在描述一种简单技术，以优化从雌性大鼠脑组织中获取的软脑膜小动脉横切片上ER-α的染色与可视化效果。我们首先用伊文思蓝染料灌注大鼠，以便在解剖显微镜下易于识别脑表面的软脑膜动脉并进行分离。使用冷冻切片机将动脉切成8 μm的横截面，可获得较薄的血管切片，从而更清晰地观察不同层面的血管结构。与使用小段血管相比，横切血管的方式更有利于观察内皮层和平滑肌层。此外，使用配备扩展景深软件的数字免疫荧光显微镜，可清晰呈现十个至十二个不同血管层面的图像，且成本低于共聚焦激光扫描显微镜。

本文的目的是展示一种利用数字免疫荧光显微镜优化大鼠软脑膜动脉切片中雌激素受体-α（ERα）免疫荧光检测的方法。

雌激素对血管反应性的许多作用是通过与雌激素受体1、2、3的相互作用介导的。尽管存在两种亚型（雌激素……）

本实验的总体目标是描述一种简单技术，用于优化雌激素受体α的染色与可视化，所用材料为取自雌性大鼠脑组织的软脑膜动脉横切片。该方法首先从脑表面剥离经伊文思蓝染色的软脑膜动脉，切片后利用冷冻切片机将其切成8微米厚的环状切片。将横切片贴附于载玻片上，随后与抗雌激素受体α的一抗孵育。接下来，将切片与含 dpi 的封片剂中的二抗和复染剂共同孵育。最后，使用扩展焦深软件将荧光标记的剥离血管节段成像并转换为二维图像。最终，可通过配备扩展焦深软件的尼康免疫荧光显微镜获得显示剥离小动脉雌激素受体 α 的结果。我叫Marguerite Littleton Kearney博士。今天，我实验室的博士后研究员Neil Far ani博士将演示一种简单的方法，以优化雌激素受体α在切片中的可视化与染色效果。使用伊文思蓝染色灌注并储存在零下70摄氏度的大鼠脑部的动脉。在解剖显微镜下，辨认脑表面的穿支动脉，并用尖头镊子将其剥离。小心去除任何附着的脑组织。将动脉置于冰上的小试管中。在0.1摩尔PBS中用2%冷多聚甲醛固定动脉30分钟。为准备切片，将包埋介质倾注于设定为-20摄氏度的冷冻台上。将一段动脉平放在载物台上，等待其冻结。待其完全冻结后，将动脉直立置于冷冻切片机冷冻盘的包埋介质中，确保动脉尖端朝前。用镊子夹住动脉直至其完全冻结。将带有动脉的冷冻盘放入冷冻切片机头中，直接在载玻片上切割八微米厚的动脉环切片。将动脉切片贴附于铬钾明胶上。使用两把画笔整理动脉环的载玻片。将制备好的载玻片放入载玻片盒中，于4°C冰箱内过夜保存。从冰箱中取出载玻片，并在实验台面上恢复至室温。加入 1 至 1.5 毫升 0.1 摩尔 PBS 洗涤载玻片，10 分钟后弃去 PBS，重复洗涤两次。最后一次 PBS 洗涤后，在室温下用 1 毫升 50 毫摩尔氯化铵孵育 30 分钟，以降低内源性荧光。随后按照前述方法，用 0.1 摩尔 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。接下来，将载玻片置于含有 0.1% Triton X-100 和 1% 正常山羊血清的 PBS 溶液中封闭 30 分钟，以减少一抗的非特异性结合。封闭后，将切片与一抗（ER alpha 抗体）在封闭液中按 1:500 的比例稀释，于 4 摄氏度孵育过夜。从冰箱中取出切片，恢复至室温。用 0.1% PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟，每次使用 1 至 1.5 毫升，以去除未结合的一抗。每次孵育后，在室温避光条件下，将切片与含Oregon Green 488标记的山羊抗兔二抗的封闭液共同孵育2小时；随后用0.1 mol/L PBS洗涤切片3次，每次10分钟，然后将切片转移至通风橱中。在组织样本上滴加含DAPY的封片剂，再盖上盖玻片。用透明指甲油封固盖玻片边缘，并使其完全干燥。将染色后的果皮导管片段的预处理玻片置于显微镜下，调整焦距以观察荧光标记的目标区域。染色的内质网α受体的可视化是本实验步骤中最困难的部分。需找到切面最清晰、受体信号最明确的导管层面。从100倍放大开始，然后将放大倍数增加至600倍。使用相机在DPI通道和ZI通道分别采集细胞核和DR alpha的图像，然后使用软件将血管节段的多个视图转换为二维图像。此处显示的是ER alpha免疫荧光染色结果（绿色）以及DPI复染的结果。在从雌性大鼠脑组织中分离出的软脑膜动脉环中，蓝色显示的融合图像提示存在核内雌激素受体α。通过结合使用Zack图像，可获得聚焦的ERα免疫荧光图像，以排除自发荧光的干扰；因此，针对一抗和二抗均应进行自发荧光阴性对照实验。请注意，未经二抗孵育的动脉内皮侧显示出明显的自发荧光。观看本视频后，您应了解如何分离并剥离脑表面的动脉，以及如何制备八微米的横截面环。此外，您还应熟悉如何使用荧光标记的雌激素受体α，并通过数字免疫荧光显微镜及尼康扩展软件对受体进行可视化观察。

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生物学

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