Name: 负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物:从电网的制备图像采集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习负染色电子显微镜技术，用于可视化纯化蛋白质和大分子复合物。本方法涵盖EM载网制备、染色溶液配制及图像采集，适合结构生物学研究中的常规分析。

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程实验室的电子显微镜研究工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助（1R01GM082893、1R01GM098672、1S10RR026814-01 和 P50GM082250（授予 A. Frankel））以及加州大学旧金山分校（UCSF）突破性生物医学研究项目的机会奖和新技术奖的资助。

1. 用于碳镀膜的电镜载网的制备
<ol>
 <li>用一个大玻璃烧杯装入蒸馏水。</li>
 <li>使用玻璃移液管将一滴火棉胶（~20μl，2% 溶于乙酸戊酯，Electron Microscopy Sciences，PA，USA）滴加到水的表面。火棉胶会扩散并在水/空气界面形成一层薄的塑料膜；注意：第一滴火棉胶可用于清除水面的灰尘颗粒。在移除第一滴形成的膜后，水面即可无尘。</li>
 <li>将从 Ted Pella Inc.（USA）购买的 400 或 200 目 Gilder 铜 EM 载网逐个放置到漂浮在水面的塑料膜上；我们通常以紧密排列的方式放置 50 ~ 100 个载网，使载网的光亮面朝下接触塑料膜（图 1A）。注意：400 目载网适用于常规负染 EM 载网；而 200 目载网适用于采集倾转配对图像。</li>
 <li>裁剪一张略大于载网放置区域的纸片。小心地将纸片覆盖在载网上方（图 1B），等待纸片完全浸湿（图 1C）。注意：不同类型的纸吸水速率不同。所用纸张吸水不能过快。例如，普通滤纸不适合此用途，因其吸水过快并产生大量褶皱。由起皱纸张制成的碳膜不平整，因此不适合用于随机锥形倾转三维重构的倾转配对图像采集。需测试多种纸张以找到合适的一种。在我们实验室，通常使用从当地杂货店购买的记事本用纸。有时报纸用纸也被发现适用。另一种选择是使用较厚的中国/日本书法用宣纸。</li>
 <li>迅速在浸湿纸片周围及附近对塑料膜进行切割。随后立即用镊子夹起纸片，此时载网被夹在塑料膜与纸片之间。将纸片放入培养皿中，使载网朝上自然晾干（图 1D）；注意：必须让纸片自然风干。干燥过快会导致纸张产生大量褶皱。</li>
</ol>
2. 碳膜载网
<ol>
 <li>我们实验室使用的碳镀膜仪为 Cressington 208C 高真空涡轮碳镀膜仪（Ted Pella）。我们的系统配备有 Cressington 膜厚监测仪，该监测仪基于石英晶体振荡频率随其表面沉积薄膜质量变化的原理，测量所镀碳膜的厚度。然而，本文所述方案无需使用膜厚监测仪，因为该设备并非每个实验室都具备。</li>
 <li>使用碳棒磨刀器（Ted Pella）将碳棒磨尖，并将碳棒装入碳镀膜仪中（图 2A）。将一根尖端尖锐的碳棒与另一根端面平整的碳棒相对放置。</li>
 <li>在载玻片磨砂区域的一半涂上真空脂，并将其放置在载网旁边（图 2B）。仅需将载玻片磨砂区域的一半涂覆真空脂。注意：涂有真空脂的区域在碳镀膜后颜色不会改变。涂与未涂真空脂区域之间的颜色对比可用于估计所镀碳膜的厚度。</li>
 <li>将带有载网的纸片置于碳镀膜仪的样品台上。将载玻片放置在载网旁（图 2C）。注意：若许多载网容易从纸上脱落，也可先将覆有塑料膜的载网转移至载玻片上，再进行镀膜。</li>
 <li>抽真空至真空腔内压力达到 10-5 Torr。注意：真空度较低时进行镀膜常会产生大量电火花，导致载网上出现许多较大的碳颗粒。</li>
 <li>极其缓慢地增加电流。随着电流增大，碳棒的尖端首先变为红色，随后变为白色。切勿用肉眼直接观察高亮度的尖端。当镀膜开始时即停止增加电流。载玻片颜色将由白色变为浅灰色，再变为深灰色。载玻片颜色的深浅与所镀碳膜的厚度相关。当达到所需厚度时，关闭电流以停止镀膜（图 2D）。注意：1）经过多次碳镀膜操作后，玻璃钟罩内壁沉积的碳层可能使其颜色变深，导致所观察到的碳膜显得比实际更厚。2）一根磨尖的碳棒可多次使用。每次使用后，其尖端锐度逐渐降低，而碳棒的锐度会影响最大所需电流。新磨尖的细直径碳棒蒸发碳所需电流相对较低；后续使用时可能需要略高的电流。</li>
 <li>释放真空腔，取出镀膜后的载网以供后续使用。 
 注意 1. 控制碳膜厚度更准确的方法是使用膜厚监测仪。也可通过监测仪测得的精确厚度对颜色进行定性校准。本技术适用的碳膜厚度范围为 3 至 7 nm。</li>
</ol>
这是一种制备大量碳膜支持铜网的简单易行的方法，通常每次可制备约100个铜网。这些铜网表面含有一层薄塑料膜，通常不会影响负染样品成像的质量。然而，采用该方法制备的铜网不适用于冷冻电镜（cryoEM）。此塑料膜可通过将铜网浸入氯仿中数小时予以去除。
3. 制备用于负染电镜的甲酸铀酰溶液（0.75%）。详细方案此前已有描述5
<ol>
 <li>称取 37.5 mg 甲酸铀酰至一小烧杯中；</li>
 <li>加入 5 ml 沸水，在避光条件下搅拌 5 分钟；</li>
 <li>加入 10 μl 5 M NaOH，继续搅拌 5 分钟；</li>
 <li>使用注射器滤器（Fisherbrand，13 mm 注射器滤器，0.2 μm，尼龙非无菌，货号 09-720-5）过滤溶液，并将滤后溶液储存于 8 ml Falcon 管中，管外包裹铝箔； 
 注意。 甲酸铀酰粉末可从 Electron Microscopy Sciences（Hatfield, PA）购买，货号 22451。甲酸铀酰溶液对光敏感，应避免直接光照，例如用铝箔包裹 Falcon 管。新鲜配制的溶液呈淡黄色（图 3A）。染色液在室温下可稳定存放一至两周，之后开始出现沉淀。甲酸铀酰呈酸性，pH 约为 4。加入 NaOH 可提高 pH，但若加入过快或过量，会导致染色剂沉淀。甲酸铀酰除了提供反差外，还可固定蛋白质样品。由于其固定速度极快，低 pH 通常不会影响蛋白质的整体构象或蛋白质复合物的形成7。</li>
</ol>
4. 负染电镜载网制备方案。该方案此前已有详细描述5
<ol>
 <li>使用 PELCO easiGlow 溅射镀膜仪（Ted Pella Inc., USA）对碳膜载网进行辉光放电处理，电流为 15 mA，辉光放电时间为 30 秒。注意。 辉光放电后的载网应尽快使用，通常在放电后 2 小时内使用。</li>
 <li>在一块 Parafilm 膜上分别放置两滴 20 μl 的蒸馏水和两滴 25 μl 的甲酸铀酰染色液（图 3B）。</li>
 <li>用反向施力防毛细镊子夹住经辉光放电处理的载网，使碳膜面朝上。注意：必须使用防毛细镊子，否则镊子间的毛细作用会将液体样品从载网上吸走。</li>
 <li>将 2 μl 蛋白样品加到辉光放电处理的载网上，静置 30 秒。注意：静置时间和辉光放电时长会影响蛋白在载网上的吸附浓度。样品浓度过低时需延长吸附时间。但过长的吸附时间可能因水分蒸发而改变缓冲液浓度。获得合适的颗粒分布通常需要通过反复试验进行优化。</li>
 <li>用滤纸吸去样品液滴。</li>
 <li>将载网表面轻触第一滴水，随后用滤纸吸去水分，再用第二滴水重复此步骤。</li>
 <li>将载网表面短暂接触第一滴染色液，随后用滤纸吸去染色液。</li>
 <li>将载网表面接触第二滴染色液 20 秒，随后用滤纸吸去染色液。</li>
 <li>使用真空干燥载网。注意：也可将载网置于实验台或通风橱中自然晾干。真空干燥的优势在于可立即用于电镜观察，但快速干燥可能导致染色不均等假象。</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜
<ol>
 <li>本演示中使用的显微镜为配备 Gatan 4K x 4K CCD 相机的 Tecnai T12（FEI 公司）。</li>
 <li>插入样品前，简要检查显微镜的光路对中情况；注意：每次电镜使用会话中仅需执行一次。在标准型号的显微镜中，可预先保存接近完美的对中状态。加载此类对中文件即可将显微镜恢复至接近理想的对中条件。</li>
 <li>将电镜载网装入单倾标准样品 holder 中。</li>
 <li>将 holder 插入 T12 的 CompuStage 中。等待抽真空循环完成。</li>
 <li>将 holder 插入镜筒中。</li>
 <li>对样品进行聚焦，并设定所需的欠焦值，通常为 -1.5 µm。注意：聚焦可通过手动使用最小对比度法实现，也可通过 CCD 相机采集实时图像并计算实时傅里叶功率谱来完成。</li>
 <li>使用 CCD 相机记录图像；</li>
 <li>在负染蛋白质样品的图像中，蛋白质通常呈现白色对比度，即在较暗背景上的白色密度。需注意，尽管同一载网上不同区域的蛋白质浓度通常较为接近，但可观察到不同区域染色程度存在差异。某些区域可能出现染色不均，甚至出现正染色（蛋白质在亮背景上呈暗色），而其他区域则染色良好。通常需要在载网上寻找合适的成像区域。</li>
</ol>
6. 代表性结果
图4A（马脾铁蛋白）、图4B（Fab片段）、图4C（古菌20S蛋白酶体）和图4D（核小体）展示了负染样品的典型优质图像示例。
<img alt="水基转移方法示意图，展示带有疏水涂层的纸张提升过程。" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 负染电镜用碳膜载网的制备。 A) 将电镜载网逐个以紧密排列的方式放置在火棉胶膜表面。B) 放置一张略大于载网区域的纸片。C) 等待纸片完全润湿。D) 将纸片连同载网一起提起，进行空气干燥。
<img alt="用于薄膜层沉积的真空沉积装置，带有样品支架；实验设备。" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用碳膜包被电镜载网。 A) 设置碳蒸发装置：将两根碳棒装入镀膜装置中，其中一根（左侧）尖端磨成尖锐状。另一根（右侧）具有平坦表面，并与对面碳棒的尖端接触。B) 在培养皿玻璃片的一侧涂抹少量真空润滑脂。黑色框内区域即为涂有真空润滑脂的区域。C) 设置待镀膜的载网。玻璃片用于固定纸片位置。箭头所指为涂有真空润滑脂的区域。D) 镀膜完成后，覆盖真空润滑脂的玻璃片区域颜色未发生变化。颜色对比表明所镀碳膜的厚度。
<img alt="色谱装置：试管样品、薄层色谱板、天平；溶剂分离过程。" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 负染色步骤示意图。 A) 新配制的（左）甲酸铀酰溶液透明澄清，无沉淀迹象。1~2周后，试管底部开始出现沉淀物。B) 在一块封口膜上分别放置两滴（约25μl）蒸馏水和两滴甲酸铀酰溶液。用一对防毛细作用镊子夹持经辉光放电处理的碳膜支持铜网，碳膜面朝上。在铜网上加一滴样品（约2μl）。C) 静置30秒后，用滤纸吸去溶液。D) 将铜网翻转，使样品面接触第一滴水液。重复步骤C和D，完成染色过程。
<img alt="纳米颗粒的电子显微镜图像，A-D 面板，20 nm 比例尺，颗粒分布分析。" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 负染色蛋白质样品的电镜图像示例。 A）马脾铁蛋白，B）抗原结合片段（Fab），C）古菌20S蛋白酶体，D）核小体。所有图像均以相同放大倍数采集。比例尺为20 nm。

<ol><li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li>
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<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li>
<li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li>
<li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure%2C+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li>
<li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li>
<li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li>
</ol>

本视频文章的制作与免费访问由 FEI 赞助。

负染电镜是一种强大的工具，可用于研究纯化蛋白质样品的三维结构，例如使用随机锥形倾斜8方法，该方法需要采集一对图像：一份来自倾斜60°的样品区域，另一份来自同一区域但未倾斜的样品，以计算大分子复合物的三维重构。此外，负染电镜还可用于多种其他应用，例如筛选膜蛋白的二维（2D）晶体9、观察蛋白质复合物在不同构象状态下的形态10，或简单地用于观察纯化蛋白质样品的均一性及/或异质性，从而为优化蛋白质纯化流程提供反馈信息等。该技术可成为生物化学家强有力的实验手段。本文介绍了从制备碳支持膜载网到在电子显微镜下采集负染蛋白质样品图像的完整操作流程。如图所示，该流程相对简单且易于操作。若旨在通过随机锥形倾斜法计算样品的三维重构，则必须获取倾斜配对图像；但若仅进行单颗粒分析，则采集多张未倾斜图像即可。无论哪种情况，后续均需进行图像处理，相关内容已超出本视频文章的范围。
与任何方法一样，该实验方案也存在多种变异。在大多数情况下，甲酸铀酰作为负染色试剂效果非常好。醋酸铀酰是另一种常用的负染色试剂，其作用方式与甲酸铀酰非常相似，但颗粒尺寸较大，且在许多情况下对比度低于甲酸铀酰。使用醋酸铀酰的优点在于其溶液比甲酸铀酰更稳定，无需每隔一至两周重新配制新鲜溶液。甲酸铀酰和醋酸铀酰均为酸性物质，因此一个明显的担忧是低pH值可能引起所研究蛋白样品的结构变化。然而，这两种染色液同时也具有蛋白质固定剂的功能。先前的研究已表明，它们均能快速固定蛋白样品7。这种快速固定作用使得低pH值的影响变得不那么重要，因为在染色过程中，蛋白样品在低pH引发任何改变之前就已经被固定。尽管如此，当低pH值成为关注问题时，其他负染色试剂（如钼酸铵和磷钨酸）可能在染色样品时获得更优的结果7。钼酸铵和磷钨酸的pH值接近中性，但这些染色剂所产生的蛋白样品对比度通常不如甲酸铀酰。

<table><tbody><tr><td>火棉胶</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12620-30</td><td>30ml，溶于乙酸戊酯，浓度2%</td></tr><tr><td>铜质载网（Gilder Cu grids）</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>G400/G200</td><td>400/200目</td></tr><tr><td>Cressington 208C 高真空涡轮碳镀膜仪</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>9260</td><td> </td></tr><tr><td>双头碳棒</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>58</td><td> </td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16984-59-1</td><td>纯度99.9%</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow 等离子清洗系统</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td>在当地药店购买</td></tr><tr><td>Whatman #1 滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805E</td><td> </td></tr></tbody></table>

通过负染电镜技术观察蛋白质与大分子复合物：从载网制备到图像采集

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

单颗粒电子显微镜技术（EM），无论是针对负染色还是冷冻水合的生物样品，已成为结构生物学中一种多功能的工具1。近年来，该方法在研究蛋白质及大分子复合物结构方面取得了巨大成功2, 3。与电子冷冻显微镜技术（cryoEM）相比，负染色是一种更简单的样品制备方法；在cryoEM中，冷冻水合的蛋白质样品被包埋在一层薄的玻璃态冰中4，而在负染色法中，蛋白质样品则被包埋在一层干燥的重金属盐薄膜中，以增强样品的对比度5。负染色电镜所增强的对比度使得相对较小的生物样品得以观察。除了用于测定纯化蛋白质或蛋白质复合物的三维（3D）结构6之外，该方法还可用于更广泛的目的。例如，负染色电镜可简便地用于观察纯化的蛋白质样品，获取有关样品均一性/非均一性、蛋白质复合物或大型组装体形成情况的信息，或仅用于评估蛋白质制备的质量。
在本视频文章中，我们介绍了一套完整的透射电镜观察负染蛋白质样品的实验方案，内容涵盖用于负染电镜的碳支持膜铜网的制备，到在加速电压为120 kV的透射电子显微镜下获取负染样品图像的全过程。这些实验方案已在我们的实验室中常规使用，初学者也可轻松掌握和操作。

通过负染电子显微镜（EM）观察蛋白质样品已成为一种流行的结构分析方法。该方法既可用于定量结构分析，例如计算所研究分子的三维重构，也可用于定性评估蛋白质样品的质量。本文提供了制备EM载网、染色样品以及在电子显微镜下观察样品的详细实验方案。初学者可轻松遵循这些操作步骤，将负染EM作为常规检测手段，结合其他生物化学分析方法，用于评估其蛋白质样品。

单颗粒电子显微镜（EM）技术，无论是对负染色还是冷冻水合的生物样品进行分析，都已成为结构生物学中一种多功能的工具……

本实验的总体目标是通过负染电子显微镜技术对纯化的蛋白质样品进行可视化观察。首先需制备用于支撑样品的电子显微镜载网，完成此步骤后，再进行负染液的配制。接下来，将样品施加到透射电镜载网上并进行负染。最后，将电镜载网装入电子显微镜中，在适当的光学条件下记录图像。传统的明场、差分相衬显微（DEM）图像具有高对比度和清晰的细节，可显示单个大分子分散在无特征的背景上。负染电子显微镜是一种用于观察您目标蛋白的简单方法。该技术可作为常规检测手段，用于检查纯化后的蛋白质，适用于结构分析或其他生物化学与生物物理实验。本文将演示如何制备用于电子显微镜观察的负染样品。该方法的可视化演示非常有帮助，因为其中一些步骤仅通过文字描述和图示难以掌握。首先使用玻璃移液管将一滴火棉胶滴入盛有水的大烧杯的水面上。当火棉胶扩散时，可能会捕获水面上的灰尘。移除并替换火棉胶塑料的灰尘薄膜，换上另一滴。随后将50至100个透射电镜载网逐个放置于漂浮的塑料膜上，光面朝下。常规负染色选用400目载网，也可选用200目载网。用于采集倾斜对图像。选择一块吸水性较慢、无皱褶的纸片，其尺寸应略大于载网区域。将纸片放置在载网上方，等待直至纸片完全湿润。纸张不应过快吸收水分。我们使用廉价笔记本中的纸张。网格现在被夹在塑料膜和纸张之间。使用镊子将纸张放入培养皿中，缓慢风干。避免使用较快的干燥方法，因为这可能导致起皱。我们实验室使用的碳镀膜机是Creston 2 0 8 C高真空涡轮碳镀膜仪。配备Creston薄膜厚度监测仪。该监测仪采用对碳沉积敏感的石英平衡装置。然而，此处所述的方案无需使用此设备。首先，在碳镀膜机中对碳棒进行 sharpening 并装入碳棒。下一步，在载玻片上用真空润滑脂涂抹，使磨砂区域的一半保持未覆盖。碳镀膜后，利用载玻片上涂有润滑脂的区域来估算碳膜的厚度。将带有网格的纸张放置在碳镀膜机钟罩内的载物台上。放置涂有润滑脂的玻璃片。将样品移至网格旁。将真空室抽至至少10微托，否则放电会产生大量大颗粒污染物。现在缓慢增加电流。碳棒的尖端将变得极其明亮。在镀膜开始时，切勿用肉眼直接观察；随着碳层逐渐沉积，玻璃载片将变为深灰色。根据所需的碳膜厚度切断电流，并考虑钟罩的透光性。在作出判断时，一旦载片的暗度与碳膜厚度完成校准，该方法的准确度可与更昂贵的薄膜厚度监测仪相媲美。当过程结束后，释放真空室内的真空，取出镀膜载网以备后续使用。薄塑料层不会影响负染图像的质量，但可在使用前将载网浸泡于氯仿中数小时以去除该层。制备新鲜的尿素甲酸溶液，或使用避光保存不足两周的溶液。良好的新鲜溶液呈黄色，pH 值约为 4，溶液清澈无沉淀。首先使用市售系统进行辉光放电，使碳膜载网活化。接下来，在一张滤纸上放置两滴20微升的蒸馏水以及两滴25微升的新鲜尿素甲酸铵溶液。使用反向作用抗毛细作用力镊子夹持经辉光放电处理的载网，碳膜面朝上。需要注意的是，此类镊子不会通过虹吸作用将液体从载网上吸走。现在将2 µL蛋白样品加入载网上，等待蛋白质被载网吸附。此过程通常需要30秒，但样品浓度极低时所需时间更长，这可能影响缓冲液浓度。完成后，用滤纸吸去蛋白样品。然后将网格用蒸馏水洗涤两次，每次将网格表面短暂接触一滴水，并在几秒内用滤纸吸干。接着，将网格短暂接触一滴染液，迅速吸干。采用相同方法，使网格与第二滴染液接触 20 秒。最后，将载网在实验台通风橱中风干，或者更优地，在电镜实验前进行真空干燥。如有已优化的校准文件，加载该文件以检查电镜的对中情况，应使其恢复至接近完美的状态。现在将电镜载网装入单倾标准样品台。接着，将样品台插入电镜样品腔的载物台上。然后等待泵送循环完成，将样品台插入柱体。现在开始寻找染色良好的样品区域。使用最小对比度方法，或通过CCD相机并计算实时图像的四倍放大来手动对焦。您的功率谱。然后根据需要设置深聚焦，通常为负1.5微米。网格上的染色浓度可能不均，因此请使用白色对比度寻找蛋白质。避免选择染色不均匀或出现阳性染色的区域，因为在这些区域中蛋白质对比会呈现黑色。采用上述制备载网并观察负染样品的方法，本文对几种常见的蛋白质进行了成像，以作示范。注意其细节和高对比度。观看本视频后，您应能很好地掌握如何制备负染色大分子样品，以用于电子显微镜观察。一旦熟练掌握，该技术可在约四小时内完成。完成此操作后，可进行其他方法，如三维重建，以更深入地理解分子结构。

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负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物：从电网的制备图像采集

本视频介绍了一种对纯化外泌体进行负染色的实验方法。通过透射电子显微镜对外泌体负染样品进行成像，该技术有助于观察外泌体的形态特征。...

纯化外泌体的负染色法：利用透射电子显微镜观察外泌体形态的实验步骤

关键词：外泌体，负染色，透射电子显微镜，形态学，纯化，纳米囊泡

在本视频中，我们演示了在生物安全防护环境中利用处理胶囊对包膜病毒样本进行负染色的方法。通过透射电子显微镜观察经负染色处理的病毒，可对病毒的结构与形态进行纳米级分辨率的研究。...

基于胶囊的病毒样本负染技术在透射电镜载网上的应用：一种用于观察包膜病毒超微结构的重金属染色技术

为了保存神经元结构以进行超微结构分析，我们描述了一种将原代神经元接种于透射电镜载网后进行瞬时冷冻的实验方案，从而获得悬浮于玻璃态冰层中的样品。这些样品可用于冷冻电子显微镜观察，以在纳米尺度上可视化细胞结构。...

利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

超过一半的蛋白质是小分子蛋白质（分子质量 &lt;200 kDa），这类蛋白质在电子显微镜成像和三维重构方面均具有挑战性。优化的负染色法是一种可靠且高通量的方案，可在不同生理条件下获得小分子非对称蛋白质或复合物的高对比度和相对高分辨率（约 1...

优化的负染色法：一种高通量电镜检测小分子及非对称蛋白结构的实验方案

负染电镜是一种用于观察大分子结构的强大技术，但不同的染色方法可能因样本而异，产生不同的结果。本文详细描述了多种负染方法，旨在为解决复杂体系的可视化问题提供初步的工作流程。...

负染电子显微镜方法的多种改进：应对复杂体系的工具

本文介绍了一种用于制备纳升级样品体积以进行透射电子显微镜观察的仪器及方法。该方法无需滤纸吸 blotting...

用于透射电子显微镜的微型化样品制备

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

本实验方案描述了一种利用量子点对心脏组织切片中的蛋白质进行免疫标记的方法。该技术为在超微结构水平上观察任何蛋白质的亚细胞定位和表达提供了有效的工具。...

利用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜观察心脏中蛋白质的亚细胞定位

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本文提供了一步一步制备链霉亲和素亲和载网的方案，用于通过冷冻电子显微镜对难以处理的大分子样品进行结构研究。...

用于冷冻电镜样品制备的链霉亲和素亲和力载网制备

优化冷冻电子显微镜样品制备

学习负染色电子显微镜技术，用于可视化纯化蛋白质和大分子复合物。本方法涵盖EM载网制备、染色溶液配制及图像采集，适合结构生物学研究中的常规分析。

通过负染电镜技术观察蛋白质与大分子复合物：从载网制备到图像采集

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