通过负染电镜技术观察蛋白质与大分子复合物：从载网制备到图像采集

本实验的总体目标是通过负染电子显微镜技术对纯化的蛋白质样品进行可视化观察。首先需制备用于支撑样品的电子显微镜载网，完成此步骤后，再进行负染液的配制。

接下来，将样品施加到透射电镜载网上并进行负染。最后，将电镜载网装入电子显微镜中，在适当的光学条件下记录图像。传统的明场、差分相衬显微（DEM）图像具有高对比度和清晰的细节，可显示单个大分子分散在无特征的背景上。

负染电子显微镜是一种用于观察您目标蛋白的简单方法。该技术可作为常规检测手段，用于检查纯化后的蛋白质，适用于结构分析或其他生物化学与生物物理实验。本文将演示如何制备用于电子显微镜观察的负染样品。

该方法的可视化演示非常有帮助，因为其中一些步骤仅通过文字描述和图示难以掌握。首先使用玻璃移液管将一滴火棉胶滴入盛有水的大烧杯的水面上。当火棉胶扩散时，可能会捕获水面上的灰尘。

移除并替换火棉胶塑料的灰尘薄膜，换上另一滴。随后将50至100个透射电镜载网逐个放置于漂浮的塑料膜上，光面朝下。常规负染色选用400目载网，也可选用200目载网。

用于采集倾斜对图像。选择一块吸水性较慢、无皱褶的纸片，其尺寸应略大于载网区域。将纸片放置在载网上方，等待直至纸片完全湿润。

纸张不应过快吸收水分。我们使用廉价笔记本中的纸张。网格现在被夹在塑料膜和纸张之间。

使用镊子将纸张放入培养皿中，缓慢风干。避免使用较快的干燥方法，因为这可能导致起皱。我们实验室使用的碳镀膜机是Creston 2 0 8 C高真空涡轮碳镀膜仪。

配备Creston薄膜厚度监测仪。该监测仪采用对碳沉积敏感的石英平衡装置。然而，此处所述的方案无需使用此设备。首先，在碳镀膜机中对碳棒进行 sharpening 并装入碳棒。

下一步，在载玻片上用真空润滑脂涂抹，使磨砂区域的一半保持未覆盖。碳镀膜后，利用载玻片上涂有润滑脂的区域来估算碳膜的厚度。将带有网格的纸张放置在碳镀膜机钟罩内的载物台上。放置涂有润滑脂的玻璃片。

将样品移至网格旁。将真空室抽至至少10微托，否则放电会产生大量大颗粒污染物。现在缓慢增加电流。

碳棒的尖端将变得极其明亮。在镀膜开始时，切勿用肉眼直接观察；随着碳层逐渐沉积，玻璃载片将变为深灰色。根据所需的碳膜厚度切断电流，并考虑钟罩的透光性。在作出判断时，一旦载片的暗度与碳膜厚度完成校准，该方法的准确度可与更昂贵的薄膜厚度监测仪相媲美。

当过程结束后，释放真空室内的真空，取出镀膜载网以备后续使用。薄塑料层不会影响负染图像的质量，但可在使用前将载网浸泡于氯仿中数小时以去除该层。制备新鲜的尿素甲酸溶液，或使用避光保存不足两周的溶液。

良好的新鲜溶液呈黄色，pH 值约为 4，溶液清澈无沉淀。首先使用市售系统进行辉光放电，使碳膜载网活化。

接下来，在一张滤纸上放置两滴20微升的蒸馏水以及两滴25微升的新鲜尿素甲酸铵溶液。使用反向作用抗毛细作用力镊子夹持经辉光放电处理的载网，碳膜面朝上。需要注意的是，此类镊子不会通过虹吸作用将液体从载网上吸走。

现在将2 µL蛋白样品加入载网上，等待蛋白质被载网吸附。此过程通常需要30秒，但样品浓度极低时所需时间更长，这可能影响缓冲液浓度。完成后，用滤纸吸去蛋白样品。

然后将网格用蒸馏水洗涤两次，每次将网格表面短暂接触一滴水，并在几秒内用滤纸吸干。接着，将网格短暂接触一滴染液，迅速吸干。采用相同方法，使网格与第二滴染液接触 20 秒。

最后，将载网在实验台通风橱中风干，或者更优地，在电镜实验前进行真空干燥。如有已优化的校准文件，加载该文件以检查电镜的对中情况，应使其恢复至接近完美的状态。现在将电镜载网装入单倾标准样品台。接着，将样品台插入电镜样品腔的载物台上。

然后等待泵送循环完成，将样品台插入柱体。现在开始寻找染色良好的样品区域。使用最小对比度方法，或通过CCD相机并计算实时图像的四倍放大来手动对焦。

您的功率谱。然后根据需要设置深聚焦，通常为负1.5微米。网格上的染色浓度可能不均，因此请使用白色对比度寻找蛋白质。

避免选择染色不均匀或出现阳性染色的区域，因为在这些区域中蛋白质对比会呈现黑色。采用上述制备载网并观察负染样品的方法，本文对几种常见的蛋白质进行了成像，以作示范。

注意其细节和高对比度。观看本视频后，您应能很好地掌握如何制备负染色大分子样品，以用于电子显微镜观察。一旦熟练掌握，该技术可在约四小时内完成。

完成此操作后，可进行其他方法，如三维重建，以更深入地理解分子结构。