负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物:从电网的制备图像采集
December 22nd, 2011
负染色电子显微镜（EM）的可视化蛋白质样品已成为一种流行的结构分析方法。它是有用的定量结构分析，如计算一个正在研究的分子的三维重建，也为蛋白质制剂质量的定性检查。在这篇文章中，我们目前准备的EM电网，染色样品，并在电子显微镜下的可视化样品的详细协议。新手用户可以轻松地遵循这些协议，并利用负染作为常规检测EM，除了其他生化分析评估其蛋白质样品，。
该程序的总体目标是通过负染色电子显微镜观察纯化的蛋白质样品。这是通过首先准备支撑样品的电子显微镜网格来完成的。该程序的第二步是制备阴性染色溶液。
接下来，将样品施加到电子显微镜网格上并进行阴性染色。最后，将 EM 网格加载到电子显微镜中，并在适当的光学条件下记录图像。传统的明场 DEM 图像具有高对比度和清晰的细节，显示单个大分子分散在无特征的背景上。
负染色电子显微镜是一种可视化您最喜爱的蛋白质的简单方法。它可以用作常规检测试剂盒，用于检测纯化的蛋白质，用于结构分析或其他生化和生物物理检测。在这里，我们演示了如何制备用于电子显微镜检查的负染样品。
这种方法的可视化演示很有帮助，因为某些步骤很难从文本描述和图形中学习。首先使用玻璃移液管将一滴火棉胶滴入水面上的大烧杯中。随着火棉胶的扩散，它可能会从水面上捕获灰尘。
取出一层布满灰尘的火棉胶塑料薄膜，然后用另一滴代替。接下来，将 50 到 100 个 EM 网格一个接一个地放在浮动塑料薄膜闪亮的一面朝下。选择 400 个网格进行常规负染，并选择 200 个网格。
用于收集倾斜对图像。选择一张吸收率低、不起皱的纸，该纸的面积略大于网格的面积。将纸张放在网格顶部，等待纸张完全湿润。
纸张不应太快地吸收水分。我们使用廉价记事本中的纸张。网格现在夹在塑料薄膜和纸张之间。
用一把镊子将纸放入培养皿中，慢慢风干。避免使用快速干燥方法，因为它们会导致皱纹。我们实验室使用的碳涂层机是 Creston 2 0 8 C 高真空涡轮增压碳锥机。
配备 Creston 薄膜厚度监视器。该显示器采用对积碳敏感的石英天平。但是，此处描述的协议不需要此设备首先在碳涂层机中磨锐和加载碳棒。
下一层涂层，用真空润滑脂涂覆玻璃载玻片，留下一半的磨砂区域未涂层 碳涂层后，使用载玻片的润滑区域来估计碳涂层的厚度。将带有网格的纸张放在碳素涂布机钟罩下方的载物台上。放置涂有油脂的玻璃。
滑动到网格旁边。将真空室抽真空至至少 10 次微行程，否则火花将在网格中产生许多大颗粒。现在非常缓慢地增加电流。
碳棒的锋利尖端会变得非常亮。涂层开始时不要用肉眼观察它，随着碳涂层的积累，载玻片会变成深灰色，以所需的碳厚度切割电流，并考虑到钟罩的透明度。在做出此判断时，一旦将载玻片的暗度校准到碳厚度，这种方法与更昂贵的薄膜厚度监测器一样准确。
该过程完成后，对真空室进行通风并去除涂层网格以备后用。薄塑料层不会影响负染色图像的质量，但可以通过在继续之前将网格浸泡在氯仿中数小时来去除。制备新鲜的 urin L 甲酸盐溶液或使用在黑暗中储存不到两周的溶液。
好的新鲜溶液呈黄色，pH 值约为 4，运行非常干净，无沉淀物。首先使用市售系统发光。排出碳涂层网格。
接下来，将两滴 20 微升蒸馏水和 2 滴 25 微升新鲜小便池甲酸盐溶液滴到一块 perfil 上。使用反向力防毛细管镊子，握住辉光放电网格，碳涂层面朝上。至关重要的是，这些镊子不会从网格中吸取液体。
现在将两微升蛋白质样品加入网格中，等待蛋白质被吸收到网格中。这通常需要 30 秒，但非常稀释的样品需要更多时间，这可能会影响缓冲液浓度。完成后，用滤纸吸干蛋白质样品。
然后通过短暂接触一滴水来清洗网格两次，并在几秒钟内将其吸干。水短暂接触网格后，沾上一滴污渍，然后迅速将其吸干。使用相同的技术，让网格与第二滴污渍接触 20 秒。
最后，在台式通风橱上风干网格，或者最好在 EM 会话之前在真空中风干，检查 EM 显微镜的对准情况，加载完美的对准文件（如果有），应将其恢复到近乎完美的状态。现在将 EM 网格加载到单个倾斜标准试样夹具座上。接下来，将支架插入载物台。
然后等待泵送循环完成，并将支架插入色谱柱中。现在开始寻找染色效果好的样品区域。使用最小对比度方法或使用 CC、D 相机并计算实时 4 进行手动对焦。
您的功率谱。然后根据需要设置深焦，通常为负 1.5 微米。染色剂浓度在整个网格中可能有所不同，因此请搜索具有白色对比的蛋白质。
避免染色不均匀或阳性染色的区域，这些区域会使蛋白质对比度变黑。使用概述的方法来制作网格和可视化负染样品。出于演示目的，对几种熟悉的蛋白质进行了成像。
注意它们的细节和鲜明的对比。观看此视频后，您应该对如何生成负染色大分子样品以在电子显微镜下进行观察有很好的了解。一旦掌握，这项技术可以在大约四个小时内完成。
按照这个程序，可以执行其他方法，如 3D 重建，以更好地了解分子结构。
概述
本文介绍了一种使用负染电子显微镜（EM）来观察纯化蛋白样品的详细协议。该方法适用于新手用户，并作为蛋白质结构分析的常规测定。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 电子显微镜
- 蛋白质分析
背景
- 负染EM是一种广泛用于观察蛋白质的技术。
- 它允许进行定性和定量的结构分析。
- 样品准备和可视化的协议对于成功应用至关重要。
- 这种方法可以增进对蛋白质结构的理解。
研究目的
- 提供准备EM网格和染色样品的全面指南。
- 展示使用负染EM来观察蛋白质。
- 促进这种方法在蛋白质分析中的常规使用。
使用的方法
- 电子显微镜网格的制备。
- 将负染液应用于蛋白质样品。
- 在电子显微镜中观察样品。
- 在最佳条件下记录图像。
主要结果
- 获得了蛋白质的高对比度图像。
- 详细协议得以成功演示。
- 视觉辅助增强了对复杂步骤的理解。
- 结果支持使用负染EM进行常规蛋白质分析。
结论
- 负染EM是一种有效的蛋白质可视化方法。
- 所提供的协议可以轻松地被新手用户遵循。
- 这种技术可以补充其他生化测定。
常见问题
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
