Name: 人类神经祖细胞和神经元小分子诱导人类胚胎干细胞的多能干高效的推导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学习利用小分子诱导法从人类胚胎干细胞高效分化神经祖细胞和神经元的技术。该方法通过视黄酸处理实现定向神经谱系分化，为神经修复和再生医学研究提供可靠的细胞来源。

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XHP 得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助，资助项目来自美国国家衰老研究所（NIH K01 AG024496）和尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所（NIH R21 HD056530）。

1. 溶液与培养基的配制
<ol>
	<li>明胶包被溶液：0.1% (w/v) 明胶溶于 ddH2O 中，经高压灭菌后于 4°C 保存。</li>
	<li>Matrigel 包被溶液。储备液：于 4°C 过夜缓慢解冻 Matrigel（10 ml），加入 10 ml 冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12，充分混匀，在无菌细胞培养超净台中分装为 1 ml/管，于 -20°C 保存。工作液：使用前于 4°C 缓慢解冻 1 ml Matrigel 分装管 1–2 小时，立即转移至 14 ml 冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12 中，在无菌细胞培养超净台中充分混匀后立即用于包被。</li>
	<li>人源层粘连蛋白包被溶液：使用前，在无菌细胞培养超净台中将 1 ml 人源层粘连蛋白溶液（0.5 mg/ml，溶于 Tris 缓冲 NaCl 溶液，-80°C 保存，于 4°C 缓慢解冻 1–2 小时）用冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12 稀释至 12.5 ml 工作液（终浓度 40 μg/ml）。</li>
	<li>生长因子储备液（500–1000 倍）：将生长因子溶于无菌缓冲液（0.5% BSA，1.0 mM DTT，10% 甘油，1×PBS）中至浓度 10 μg/ml，分装为 50–100 μl/管，于 -80°C 保存。</li>
	<li>全反式维甲酸工作液（1000 倍）：10 mM 溶于 DMSO 中，分装后于 -80°C 保存。</li>
	<li>人胚胎干细胞培养基（hESC 培养基）：DMEM/F12 或 KO-DMEM（80%），KO 血清替代物（20%），L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺（2 mM），MEM 非必需氨基酸（MNAA，1×），β-巯基乙醇（100 μM），过滤后于 4°C 保存，使用前添加 20 ng/ml bFGF。或以确定成分替代“敲除（KO）血清替代物”：DMEM/F12 或 KO-DMEM（100%），L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺（2 mM），MNAA（1×），MEM 必需氨基酸（MEAA，1×），β-巯基乙醇（100 μM），过滤后于 4°C 保存，使用前补充 bFGF（20 ng/ml）、人胰岛素（20 μg/ml）、抗坏血酸（50 μg/ml）、人 Activin A（50 ng/ml）、人白蛋白/Albumax（10 mg/ml）和人转铁蛋白（8 μg/ml）。</li>
	<li>神经干细胞培养基（NSC 培养基）：DMEM/F12（100%），N-2 添加剂（1×），肝素（8 μg/ml）。</li>
</ol>
2. 包被平板
<ol>
	<li>用明胶包被培养板：向6孔板每孔加入2.5 ml明胶溶液，在37°C恒湿培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>用层粘连蛋白包被培养板：将已包被明胶的培养板冷却后去除明胶，向预冷的明胶包被6孔板每孔加入2.5 ml Matrigel或人源层粘连蛋白工作液，在4°C孵育过夜。</li>
</ol>
3. 在确定条件下传代和接种未分化 hESC
<ol>
	<li>让 hESC 克隆生长至 5–7 天，将 hESC 培养板置于解剖显微镜下（预先将解剖台加热至 37°C），并在解剖用无菌罩内操作。</li>
	<li>选择待传代的 hESC 克隆。从形态学上看，这些克隆应含有 > 75% 的未分化 hESC（细胞小而致密），通常略呈半透明（非白色堆积细胞，非透明的已分化细胞），在解剖显微镜下具有清晰的边界。仔细勾勒所选克隆的轮廓，并使用 P2 无菌移液枪头或拉制玻璃毛细管的边缘，去除克隆周围分化的成纤维细胞层及克隆中所有已分化的部分（若有）。请注意，多能性 hESC 处于一种短暂状态，即使在最佳培养条件下也会发生自发分化；尽管理想情况下希望细胞完全未分化，但在解剖显微镜下很难确认其为 100% 未分化，通常认为 > 75% 未分化即达到传代标准。已分化的细胞通常无法贴壁并继续生长，会在传代过程中被淘汰。</li>
	<li>通过抽吸去除含有悬浮脱落的已分化细胞的旧培养基。用不含 bFGF 的 hESC 培养基洗涤一次。每孔加入 3 ml 含 20 ng/ml bFGF 的新鲜 hESC 培养基。</li>
	<li>将未分化的 hESC 克隆切割成小块，并使用无菌移液枪头或拉制玻璃毛细管使其脱离。</li>
	<li>将含有脱离克隆碎片的培养基收集至 50 ml 圆底离心管中。用每孔 1 ml 含 20 ng/ml bFGF 的 hESC 培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。</li>
	<li>从包被好的新培养板中吸除 Matrigel 或人层粘连蛋白溶液。将含克隆碎片的 hESC 培养基以每孔 4 ml 分装至 6 孔板中。轻柔地将培养板转移至培养箱，避免震荡，在含 5% CO2 的湿润 37°C 培养箱中静置过夜，使克隆碎片贴壁，期间勿扰动。</li>
</ol>
4. 在含视黄酸的限定培养体系中诱导hESCs向神经细胞分化
<ol>
	<li>接种后第3天，吸除每个孔中的大部分旧培养基，保留足够培养基以确保hESC集落始终浸没在液体中（切勿让hESC干燥）。每孔加入4 ml含有20 ng/ml bFGF和10 μM视黄酸的新鲜hESC培养基。</li>
	<li>每隔一天用含有20 ng/ml bFGF和10 μM视黄酸的新鲜hESC培养基更换旧培养基，继续培养至第7或第8天。集落内的所有细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的分化细胞，并持续增殖。至第7或第8天，集落显著增大，可覆盖整个培养孔表面，部分区域的细胞开始堆积成层。</li>
</ol>
5. 悬浮培养中持续进行神经元分化
<ol>
	<li>将hESC培养板置于解剖显微镜下（预先将解剖载物台加热至37°C），并在解剖用无菌罩内操作。使用P2无菌移液枪头边缘或拉制的玻璃毛细管小心勾勒出克隆集落轮廓，并去除围绕集落的成纤维细胞层（即从集落迁移出的已分化细胞）。</li>
	<li>通过抽吸去除含有漂浮脱落成纤维细胞的旧培养基。用不含bFGF的hESC培养基洗涤一次，每孔加入3 ml新鲜的不含bFGF的hESC培养基。</li>
	<li>将经神经诱导的hESC集落切割成小块，并使用无菌移液枪头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。</li>
	<li>将含有脱落集落碎片的培养基收集至50 ml锥形管中。用1 ml/孔不含bFGF的hESC培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。</li>
	<li>将含有集落碎片的无血清hESC培养基按每孔4 ml分装至6孔超低吸附培养板中，置于37°C、湿润的培养箱内孵育4–5天，以促进悬浮细胞团簇（神经母细胞）的形成。</li>
</ol>
6. 黏附培养中神经元表型的成熟
<ol>
	<li>将含有悬浮神经前体细胞的培养基收集至一个50 ml圆锥形离心管中。以1400 rpm离心5分钟。尽可能吸除旧培养基，并加入等体积的新鲜神经干细胞培养基，其中含有VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）。</li>
	<li>用移液器轻轻吹打混匀悬浮的神经前体细胞，按每孔4 ml分装至6孔板中。也可将神经前体细胞接种于含VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）的无血清神经干细胞培养基中的层粘连蛋白/胶原（Matrigel）或人源层粘连蛋白聚合形成的三维基质中。将培养板置于37°C、湿润的培养箱中，过夜培养以使神经前体细胞贴壁。</li>
	<li>每隔一天更换一次含VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）的神经干细胞培养基。持续培养约2周后，开始出现大量带有神经突的神经元细胞网络及色素细胞，随时间推移数量逐渐增加，可维持培养超过3个月。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
视黄酸（RA）足以诱导在确定培养体系中维持的hESCs从多能性完全转变为神经外胚层表型图 2A）。当未分化的hESCs暴露于RA时，集落内的所有细胞将发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，停止表达与多能性相关的标志物（如Oct-4），并开始表达多种与神经外胚层相关的标志物，例如HNK1、AP2和TrkC（图 2B）。这些大型分化细胞将继续增殖，菌落随之增大，并自发进入表达早期神经元标志物 β-III-tubulin 的阶段。图 2B）。更成熟的神经元标志物 Map-2 将开始出现在细胞堆积的克隆区域图 2B). 与神经外胚层细胞的出现及神经元分化同时发生的是，神经元特异性转录因子 Nurr1 的表达，该因子参与多巴胺能神经元的分化以及酪氨酸羟化酶（TH）基因的激活16，将转位至细胞核（图 2B）。脱离后，经RA处理的hESCs将在悬浮培养中形成漂浮的细胞簇（神经母细胞），以继续神经分化过程。在去除bFGF后，将神经母细胞接种至组织培养板上，或接种于层粘连蛋白/胶原聚合的三维基质中，并在无血清的限定培养基中培养，可观察到表达β-III-微管蛋白和Map-2、具有神经突的细胞以及色素细胞的出现，其分化效率相较于未经处理、在相同时间内自发进行的多谱系分化显著提高，并可维持超过3个月。图 2C).
<img alt="多能性胚胎干细胞通过神经外胚层阶段向神经元细胞分化的示意图。" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1 通过添加小分子，实现将人类多能干细胞高效、精确地诱导为特定临床相关谱系的示意图。
<img alt="神经诱导示意图；hESC分化时间线及显微镜图像；β-III微管蛋白、Map-2。" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2 视黄酸在定义明确的条件下可直接诱导多能性细胞向神经谱系特化及神经元发育。 （A）示意图展示人胚胎干细胞（hESC）定向神经分化的实验流程时间线。（B）在定义明确的培养体系中，未分化的hESC经视黄酸（RA）处理后，集落内开始大量出现Oct-4（红色）阴性的分化细胞，而对照组（模拟处理，DMSO）则无此现象。RA诱导产生的Oct-4阴性分化细胞开始表达HNK-1（红色）、AP2（红色）、TrkC（绿色），随后表达β-III微管蛋白（红色），符合早期神经外胚层分化的特征。这些细胞进一步成熟，最终表达神经元标志物Map-2（绿色），通常出现在细胞堆积的区域。与此同时，出现神经外胚层细胞及神经元分化现象，与多巴胺能神经元分化相关并可激活酪氨酸羟化酶（TH）基因的神经元特异性转录因子Nurr1（绿色）发生核转位。所有细胞的细胞核均通过DAPI染色显示为蓝色。（C）RA处理可高效诱导细胞向神经元谱系分化，表现为广泛分布的表达β-III微管蛋白（红色）和Map-2（绿色，图中显示于三维基质中）的神经突起细胞网络。箭头所示为中枢神经系统中典型的色素细胞。插图中所有细胞的细胞核均通过DAPI染色显示为蓝色。比例尺：0.1 mm。

<ol><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li>
<li>Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+improvement+in+a+primate+Parkinson%27s+model+is+associated+with+multiple+homeostatic+effects+of+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).</li>
<li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nature Rev. 7, 395-406 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type%2C+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li>
<li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).</li>
<li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li>
<li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li>
<li>Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain. Res. 913, 201-205 (2001).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).</li>
<li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li>
<li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cells%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).</li>
<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

作者声明存在竞争利益。XHP 是 Xcelthera 公司的创始人。XHP 和 EYS 拥有与人胚胎干细胞（hESCs）相关的知识产权。

将多能性人类干细胞广泛而多样的分化潜能高效且可预测地导向特定表型，一直是发育研究和临床转化面临的主要挑战之一。尽管这类细胞能够自发分化 体外 通过多谱系聚集体阶段向所有胚层的细胞分化，但仅有少数细胞会选择特定谱系1,4在这些由hESC衍生的细胞聚集体中，常同时出现大量广泛分化的非目标细胞类型，这些细胞可能来源于三个胚胎胚层，使得目标表型的出现不仅效率低下，而且难以控制且不可靠。尽管已有文献报道成功获得了心肌和神经谱系细胞，但通过多能细胞的胚层诱导生成特化细胞的效率低下，以及移植后存在较高的致瘤风险，阻碍了其进一步的临床转化。
人类胚胎干细胞系最初是在与经生长阻滞的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）共培养的条件下建立并维持的4。尽管目前已开发出多种人类饲养层、无饲养层以及化学成分明确的培养体系用于培养人类胚胎干细胞（hESCs）11-13，但维持人类多能细胞自我更新所必需且充分的因子仍未完全阐明。这些外源性饲养细胞和生物制剂虽然有助于维持未分化hESC的长期稳定生长，但同时也掩盖了多能细胞对发育信号的响应能力。在一种定义明确且不含生物制剂的培养体系中维持未分化的hESC，使其能够可靠扩增并可控地定向分化，是实现其治疗应用潜力的关键之一。在既往报道的含有外源性饲养细胞的培养条件下，视黄酸（RA）不足以诱导未分化hESC向神经细胞分化。尽管神经谱系在hESC分化过程中较早出现，但用RA处理多谱系分化的hESC聚集体（类胚体）仅能略微提高神经元的低产量1, 14, 15。为了实现将人类多能干细胞高效、均一地转化为特定谱系，我们采用了一种定义明确的培养体系，该体系可确保未分化hESC的增殖，从而筛选出仅通过添加小分子即可高效、可控地将多能hESC特异性诱导为特定临床相关谱系的条件（图1，图2）。未来的研究将揭示在人类中枢神经系统发育中起遗传与表观遗传调控作用的分子，这些发现可能为利用小分子直接调控hESC多能性命运提供替代策略，从而推动临床相关谱系在再生治疗中的应用。在不使用RA处理的情况下，仅有1-5%的hESC会自发分化为神经元1, 14, 15。而在使用RA处理后，我们能够在定义明确的无饲养层培养体系中，将hESC转化为超过&gt;95%的胚胎神经前体细胞和神经元，该过程可能模拟了人类胚胎发育过程14。最近，已知的决定神经命运的基因被用于将小鼠成纤维细胞直接转分化为成体神经前体细胞和神经元，但效率较低，仅为0.5-8%17, 18。然而，重编程的体细胞历来存在异常基因表达和加速衰老的问题，限制了其治疗应用价值19-21。最后，本研究建立的方案仅适用于来源于人类囊胚内细胞团（ICM）或上胚层的多能hESC4，可能不适用于其他类型的多能细胞，包括动物来源的胚胎干细胞、来源于更早期桑葚胚（八细胞期）胚胎的ESC22，以及人工重编程的细胞23。

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>生长因子减少型</td></tr><tr><td>人层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>全-&lt;em&gt;反式&lt;/em&gt;-维甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053036</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-KO</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knock-out 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（MNAA，100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM 氨基酸溶液（MEAA，100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11130050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Invitrogen</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>人 bFGF</td><td>PeproTech Inc</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Invitrogen</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>人激活素 A</td><td>PeproTech Inc</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>人 BDNF</td><td>PeproTech Inc</td><td>AF-450-02</td><td></td></tr><tr><td>人 VEGF</td><td>PeproTech Inc</td><td>AF-100-20</td><td></td></tr><tr><td>人 NT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5284</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>6 孔超低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6 孔培养板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

目前医疗领域迫切需要一种适用于临床的人类神经元细胞来源，以修复或再生受损的中枢神经系统（CNS）结构与神经环路。基于细胞的治疗策略在恢复CNS疾病中丧失的神经组织与功能方面具有广阔前景。然而，源于中枢神经系统的神经干细胞在体外培养中扩增能力有限，且经过多次传代后可塑性下降，导致其在临床应用中面临供应受限和使用困难等问题。1-3尽管取得了一些有益的效果，但源自中枢神经系统的人源神经干细胞（hNSCs）似乎主要通过其非神经元谱系细胞发挥治疗作用，即通过分泌神经营养和神经保护分子来挽救内源性细胞。1-3或者，多能性人类胚胎干细胞（hESCs）可通过提供发育中的中枢神经系统中多种多样的人类神经元细胞类型，用于再生治疗，从而为多种神经系统疾病提供治愈可能。1,4-7然而，如何高效且可预测地引导多能性人胚胎干细胞（hESCs）广泛的分化潜能向特定表型定向分化，一直是发育生物学研究和临床转化应用面临的主要挑战。传统方法依赖于多能性细胞通过自发的胚层分化产生多谱系倾向，导致谱系定型效率低下且不可控，常伴随表型异质性和不稳定性，因而具有较高的致瘤风险。7-10此外，通常用于hESC分离、扩增和分化过程中的未明确定义的外源性/动物源性生物添加剂和/或饲养层细胞，可能使此类细胞特化移植物在患者中的直接应用变得困难11-13为克服这些障碍，我们已确定并解决了维持人胚胎干细胞上胚层多能性所必需且充分的限定培养体系的各个组分，为后续研究提供了平台 从头合成 通过小分子诱导获得临床适用的hESCs并有效、均一地将其定向分化为临床相关谱系14 （请参见示意图） 图1）。视黄酸（RA）不能诱导在饲养层上维持的未分化hESCs发生神经元分化1, 14而且与小鼠胚胎干细胞不同，对人胚胎干细胞分化形成的拟胚体（EBs）进行处理仅能略微提高其神经元的低产量1, 14, 15然而，在筛选了多种小分子和生长因子后，我们发现这种确定的条件使得视黄酸（RA）足以高效地直接从多能性hESCs诱导神经外胚层的特化，并进一步发育为神经母细胞，最终在发育中的中枢神经系统中生成人类神经前体细胞和神经元。图 2我们定义了直接从多能性hESCs诱导神经母细胞的条件，无需经过多谱系拟胚体阶段，从而能够高效、可控地获得大量处于不同发育阶段的人类神经细胞，用于细胞治疗。

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。

目前，临床上对于适合用于修复或再生受损中枢神经系统的功能性人类神经元细胞来源仍存在巨大未满足的需求。

以下实验的总体目标是利用小分子诱导，直接且专一地从多能性人类胚胎干细胞中获得神经元后代。该过程通过在特定条件下维持未分化细胞，并添加视黄酸来实现。随后，通过将细胞从培养物中解离并转入悬浮培养，继续诱导其分化，形成称为神经母细胞的漂浮细胞簇。如果允许神经母细胞在神经分化培养基中贴附于组织培养板，则它们会发育出成熟神经元的特征。最终，可通过免疫荧光结合去卷积显微镜或共聚焦显微镜，观察视黄酸处理对人胚胎干细胞形态及标志物表达的影响。在其他技术中，仅有少量细胞会向神经元表型分化，而我们的方法通过添加小分子，即可实现对多能人胚胎干细胞向神经元谱系的高效、可控且特异的诱导。在配制储存液时需注意几个步骤。Matrigel 和人源层粘连蛋白需从零下 80 摄氏度缓慢解冻至 4 摄氏度，并在 4 摄氏度下避光保存培养基；使用前务必将其预热至 37 摄氏度。此外，在配制人源 ESL 培养基时，部分添加剂需在使用前即时加入。这些成分包括bFGF、抗坏血酸、具有A活性的人胰岛素以及转铁蛋白。接下来，在包被培养板之前立即配制Matrigel或人层粘连蛋白工作液。在明胶预包被的组织培养板制备完成后，将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。明胶可用Matrigel或层粘连蛋白工作液替代。将这些培养板在4°C下孵育过夜以完成包被。首先让人胚胎干细胞集落生长5至7天，然后准备进行传代。挑选含有超过75%未分化人胚胎干细胞的克隆；这类克隆通常略呈半透明，边缘清晰，细胞堆积成簇。开始分化的迹象通常表现为含有大部分已分化细胞的白色克隆，外观透明。请勿挑选白色或透明的克隆。将培养皿置于光线下观察，用记号笔在培养皿底部沿菌落轮廓描出略显不透明的菌落。使用无菌P2移液器吸头的边缘，将人胚胎干细胞菌落周围的成纤维细胞层剥离。随后去除周围的成纤维细胞，并清除菌落中所有已分化的部分。现在吸除含有已脱落分化细胞的旧培养基。接下来，用不含BFGF的人类胚胎干细胞培养基洗涤未分化细胞，每孔洗涤一次，然后立即在新鲜培养基中加入三毫升含B-F-G-F的新鲜人类ESL培养基。现在使用无菌的P2移液枪吸头将细胞集落切割成小块，并从培养板上分离下来。将分离的菌落碎片连同培养基吸入一个50毫升的锥形管中。每个孔额外再吸入1毫升培养基进行冲洗。细胞现已准备好，可使用小分子进行进一步分化。首先将新包被的培养板预热至37摄氏度。从培养板中吸除包被液，然后向每孔加入含细胞集落片段的4毫升培养基，轻柔地将培养板转移至培养箱中，避免振荡。不要扰动培养板，以允许细胞贴壁。贴壁培养三天后，制备含有omic酸的新培养基。然后吸除大部分旧培养基，仅留下足以保持细胞浸没的培养基量。切勿让细胞干燥。每孔加入四毫升含BFGF和视黄酸的新鲜人胚胎干细胞培养基。每隔一天更换一次培养基，使经视黄酸处理的人胚胎干细胞集落继续生长。经过七到八天后，细胞将发生形态学变化，转变为大型分化细胞。随后开始制备悬浮细胞培养物：首先将已自发分化并迁移形成成纤维细胞层的 ESL 克隆从细胞中分离。使用前述方法配合无菌移液器吸头操作，然后吸除含有游离脱落的成纤维细胞的旧培养基。用 HESC 培养基洗涤细胞一次，并将细胞重悬于 3 毫升 HESC 培养基中。现在使用无菌的 P2 移液枪头，将细胞集落切割成小块，并从培养皿上分离下来。将含有脱落菌落的培养基转移至一个50毫升的锥形管中。用1毫升培养基冲洗孔板孔壁，并将冲洗液加入收集液中。随后，将混合细胞悬液每4毫升分装至6孔超低吸附板的每个孔中，培养4到5天，并将板置于培养箱中。在此期间，将形成漂浮的细胞簇或神经母细胞，以进一步促进神经母细胞向更成熟的神经元表型发育。将含有细胞的培养基转移至50毫升锥形管中，随后以1,400 RPM离心5分钟。吸出旧培养基，尽可能称取其重量，并加入等量含VEGF N NT three和BDNF的新鲜NSC培养基。用移液器吹打使细胞重悬，然后每孔加入4毫升细胞悬液至6孔组织培养板中，将培养板置于37°C恒温湿润培养箱中。神经母细胞将附着于培养板过夜，以便在Matrigel或人源层粘连蛋白上进行神经母细胞悬液的3D培养。3D基质将在37摄氏度下聚合。每隔一天更换一次培养基。两周内，将出现大量具有神经突的神经元细胞和色素细胞网络。视黄酸足以诱导在特定培养体系中维持的人胚胎干细胞从多能性完全转变为神经外胚层表型。当未分化的人胚胎干细胞暴露于视黄酸后，集落中的所有细胞均发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，并停止表达多能性相关标志物OCT4。这些细胞还开始表达多种神经外胚层相关标志物，如HNK-1、P2和TRKC。这些大型分化细胞持续增殖，细胞集落自发增大，并表达早期神经元标志物 beta three tubulin。在细胞堆积区域的集落中，开始出现更为成熟的神经元标志物 map two。与此同时，随着神经外胚层细胞的出现，与多巴胺能神经元分化及酪氨酸羟化酶基因激活相关的神经元特异性转录因子 NER one 转位进入细胞核。解离后，视黄酸处理的人胚胎干细胞在撤除基础成纤维细胞生长因子（bFGF）并置于悬浮培养时形成神经母细胞；当允许这些神经母细胞贴附于组织培养板上后，开始出现大量带有神经突起的神经元细胞网络以及色素细胞，这些特征典型地代表中枢神经系统（CNS），且分化效率显著提高，可连续培养超过三个月。与未经视黄酸处理而自发进行多谱系分化的细胞相比，这些人胚胎干细胞来源的神经元细胞表达βIII微管蛋白，并且共表达MAP2。一旦掌握该技术，可在约四周内从多能性人胚胎干细胞中稳定、均一地诱导生成神经前体细胞及神经元细胞。请注意，操作人类细胞可能具有极高危险性，因此在进行本实验前，必须采取相应预防措施，例如确保细胞系无病原体和支原体污染。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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