高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

以下实验的总体目标是利用小分子诱导，直接且专一地从多能性人胚胎干细胞获得心源性后代细胞。该过程通过在特定条件下维持未分化的人胚胎干细胞，并向其中添加烟酰胺来实现。随后，将心脏分化细胞分离，形成心母细胞，即在悬浮培养中漂浮的细胞簇。

心胚细胞形成后，将其接种于心脏分化培养基中，继续发育为跳动的心肌细胞。最终通过去卷积或共聚焦显微镜进行免疫荧光检测，并结合电生理记录来评估结果。该技术的主要优势在于，仅通过添加小分子即可高效地将人多能干细胞特异性地诱导分化为心脏谱系细胞。

在现有的多谱系分化方法中，仅有少数细胞会向心肌表型分化。配制储存液时需注意几个步骤：将Matrigel和人层粘连蛋白从-80°C缓慢解冻至4°C，过夜保存；培养基在4°C保存，并在使用前始终将其预热至37°C。

此外，在配制人ES细胞培养基时，某些添加剂需在使用前加入，包括bFGF、抗坏血酸、人胰岛素以及转铁蛋白。接下来，在包被培养板前应立即配制Matrigel或人层粘连蛋白工作液。

在制备好明胶预包被的组织培养板后，将其置于含5%二氧化碳、37摄氏度的环境中孵育。明胶可替换为Matra胶或层粘连蛋白工作液。通过在4摄氏度下过夜孵育对这些培养板进行包被。

首先让人类胚胎干细胞集落生长五至七天，然后准备对部分集落进行传代。选择含有超过75%未分化人类胚胎干细胞的集落。这些集落通常略显不透明，边缘清晰，含有堆积状细胞。开始分化的迹象通常表现为发白的集落，而主要含有已分化细胞的集落通常看起来较透明。

不要选择白色或透明的克隆。将培养皿举至光亮处，用记号笔在培养皿底部沿克隆轮廓标记出略显不透明的克隆。使用无菌P2移液枪头的边缘，将人胚胎干细胞克隆周围的成纤维细胞层剥离。

然后去除周围的成纤维细胞，并移除集落中所有已分化的部分。接着吸除含有脱落分化细胞的旧培养基。随后，用不含bFGF的人类胚胎干细胞培养基每孔洗涤未分化细胞一次，然后在使用前立即向新鲜培养基中加入3毫升含B-F-G-F-B-F-G-F的人类胚胎干细胞培养基。

现在使用无菌的 P2 移液枪头将菌落切成小块，并从平板上分离下来。将分离下来的菌落碎片及其培养基吸入一个 50 毫升的锥形管中。每个孔额外吸取 1 毫升培养基进行冲洗。

细胞现已准备好使用小分子进行进一步分化。首先将新包被的培养板预热至37摄氏度。从培养板中吸除包被液，并向每个孔中加入含有细胞团块的4毫升培养基，然后轻轻将培养板转移至培养箱中，避免振荡。

不要扰动培养板，以允许细胞贴壁。然后吸除大部分旧培养基，仅留下足够浸没细胞的培养基。切勿让细胞干燥。

将含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和烟酰胺的新鲜人ESL培养基混合，并将配制好的培养基各取若干毫升加入到每孔中。该培养基可在4°C下保存长达两周，在此期间可每隔一天更换一次培养基，以促进细胞集落的生长。培养8至10天后，细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的已分化细胞，并大量增殖、堆积成层。

随后进行悬浮培养：开始时，将已自发分化并迁移形成成纤维细胞层的细胞从ESL克隆中分离。使用前述方法，以无菌移液管头操作，然后吸除含有悬浮脱落的成纤维细胞的旧培养基。用HESC培养基洗涤细胞一次，并用三毫升HESC培养基重悬细胞，此时使用无菌P2移液管头。

将菌落切成小块并从平板上剥离。将含有剥离菌落的培养基收集至一个 50 毫升的离心管中。用 1 毫升培养基冲洗孔板孔，然后将冲洗液加入收集的混合液中。

随后将4毫升混合细胞分装至6孔超低吸附培养板的每个孔中，培养4至5天。将培养板置于培养箱中，使细胞形成悬浮的细胞簇或心肌前体细胞，并进一步发育为跳动的心肌细胞表型。用培养基将细胞收集至50毫升锥形管中。

然后以 1,400 RPM 离心细胞 5 分钟。吸除上清液，尽可能称取大部分旧培养基，并加入等量的新鲜心肌分化培养基，其中含有 10 毫摩尔烟酰胺。

用移液器混匀悬浮的心球细胞，然后将四毫升心球细胞悬液分装至六孔组织培养板的每个孔中。将培养板置于37摄氏度的湿润培养箱中，使心球细胞过夜贴附于组织培养板。每隔一天在培养过程中进行换液。

第8天更换含有10 µmol/L烟酰胺的心肌分化培养基。转为心肌分化培养，此后继续每隔一天更换一次不含烟酰胺的培养基。

在撤除烟酰胺后的两周内，开始出现搏动的心肌细胞，并且数量逐渐增加。烟酰胺足以诱导在特定培养体系中维持的人类胚胎干细胞从多能性状态完全转变为心源性中胚层表型。当未分化的人类胚胎干细胞暴露于烟酰胺后，集落内的所有细胞均发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，并下调OCT4的表达。这些细胞还开始表达心脏特异性转录因子NKX2.5，并表达α-肌动蛋白。

这两个特征均与心源性中胚层表型一致。这些已分化的细胞在集落中细胞堆积的区域继续增殖并增大体积。在解离后，经烟酰胺处理的人类胚胎干细胞在悬浮培养中形成了心前体细胞，NKX2.5 的表达随之增强。

在允许心源性前体细胞贴壁后，用烟酰胺处理心源性前体细胞一周，在撤除烟酰胺后一至两周内，开始出现搏动的心肌细胞，且效率显著提高。这些细胞表现为能够进行节律性收缩的细胞簇；而未经IDE处理的细胞则未表现出此类特征。搏动的心肌细胞簇内的细胞表达心肌细胞的特征性标志物，包括NKX2.5和α-肌动蛋白。

通过电生理图谱证实，跳动的心肌细胞收缩力强、节律性好，且协调同步、节律稳定，表现出类似于临床心电图中体表电极记录到的P-Q-R-S-T复合波的规律性电冲动。此外，一旦掌握该技术，心肌细胞可长期维持其强劲的收缩能力，持续超过三个月。若操作得当，该技术可在约五周内从多能性人胚胎干细胞中稳定、均一地诱导生成心脏前体细胞及跳动的心肌细胞。