Name: 高效的推导人类心脏的前体和从多能干的小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解利用小分子烟酰胺诱导人多能胚胎干细胞高效分化为心脏前体细胞和功能性心肌细胞的方法。该技术通过悬浮培养形成心芽体，再贴壁分化为搏动的心肌细胞，为心血管疾病治疗提供可靠的细胞来源。

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XHP 已获得美国国立卫生研究院（NIH）的老年研究所（NIHK01AG024496）和尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国立儿童健康与人类发育研究所（NIHR21HD056530）的资助。

1. 溶液与培养基的配制
<ol>
	<li>明胶包被液：将明胶溶于 ddH2O 中，配制成 0.1% (w/v) 溶液，经高压灭菌后于 4°C 保存。</li>
	<li>Matrigel 包被液。储备液：于 4°C 过夜缓慢解冻 Matrigel（10 ml），加入 10 ml 冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12，充分混匀，在无菌细胞培养操作台下分装为每管 1 ml，于 -20°C 保存。工作液：于 4°C 缓慢解冻 1 ml Matrigel 分装液 1–2 小时，立即转移至 14 ml 冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12 中，在无菌细胞培养操作台下充分混匀，现配现用。</li>
	<li>人源层粘连蛋白包被液：在无菌细胞培养操作台下，将 1 ml 人源层粘连蛋白溶液（0.5 mg/ml，溶于 Tris 缓冲 NaCl 溶液中，-80°C 保存，使用前于 4°C 缓慢解冻 1–2 小时）用冰冷的 DMEM 或 DMEM/F12 稀释至 12.5 ml 工作液（终浓度 40 μg/ml），现配现用。</li>
	<li>生长因子储备液（500–1000 倍）：将生长因子溶解于无菌缓冲液（0.5% BSA，1.0 mM DTT，10% 甘油，1×PBS）中，终浓度为 10 μg/ml，分装为每管 50–100 μl，在无菌条件下保存于 -80°C。</li>
	<li>人胚胎干细胞（hESC）培养基：DMEM/F12 或 KO-DMEM（80%）、KO 血清替代物（20%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺（2 mM）、MEM 非必需氨基酸（MNAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后于 4°C 保存，使用前添加 20 ng/ml bFGF。或以确定成分替代“KO 血清替代物”：DMEM/F12 或 KO-DMEM（100%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺（2 mM）、MNAA（1×）、MEM 必需氨基酸（MEAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后于 4°C 保存，使用前补充 bFGF（20 ng/ml）、人胰岛素（20 μg/ml）、抗坏血酸（50 μg/ml）、人 Activin A（50 ng/ml）、人白蛋白/Albumax（10 mg/ml）和人转铁蛋白（8 μg/ml）。</li>
	<li>hESC 心脏分化培养基：DMEM/F12（90%）、确定成分胎牛血清（10%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或 L-谷氨酰胺（2 mM）。</li>
	<li>含烟酰胺（NAM）的培养基：将 NAM 加入 hESC 培养基或 hESC 心脏分化培养基中，使终浓度为 10 mM，过滤后于 4°C 保存，配制后两周内使用完毕。</li>
</ol>
2. 包被平板
<ol>
	<li>用明胶包被培养板：向6孔板每孔加入2.5 ml明胶溶液，在37°C恒湿培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>用层粘连蛋白包被培养板：将已包被明胶的培养板冷却后去除明胶，向预冷的明胶包被6孔板每孔加入2.5 ml Matrigel或人源层粘连蛋白工作液，在4°C孵育过夜。</li>
</ol>
3. 在限定条件下传代和接种未分化 hESC
<ol>
	<li>让 hESC 克隆生长至 5–7 天，将 hESC 培养板置于解剖显微镜下（解剖台预热至 37°C），并在解剖用无菌罩内操作。</li>
	<li>选择需要传代的 hESC 克隆。从形态学上看，这些克隆应含有 > 75% 未分化的 hESC（细胞小而致密），通常略呈半透明（非白色堆积状细胞，非透明的已分化细胞），在解剖显微镜下具有清晰的边界。仔细勾画所选克隆的轮廓，并使用 P2 无菌移液器吸头边缘或拉制的玻璃毛细管去除克隆周围分化的成纤维细胞层及克隆中所有已分化的部分（如有）。</li>
	<li>通过抽吸去除含有悬浮脱落的已分化细胞的旧培养基。用 hESC 培养基（不含 bFGF）洗涤一次，然后每孔加入 3 ml 含 20 ng/ml bFGF 的新鲜 hESC 培养基。</li>
	<li>将未分化的 hESC 克隆切割成小块，并使用无菌移液器吸头或拉制的玻璃毛细管将其分离。</li>
	<li>将含有分离克隆碎片的培养基收集至 50 ml 锥形离心管中。用 1 ml/孔含 20 ng/ml bFGF 的 hESC 培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。</li>
	<li>从包被好的新培养板中吸除 Matrigel 或人层粘连蛋白溶液。将含有克隆碎片的 hESC 培养基按 4 ml/孔分装至 6 孔板中。轻轻将板转移至培养箱，避免震荡，在 37°C、5% CO2 的湿润培养箱中静置过夜，使克隆碎片贴壁。</li>
</ol>
4. 在含有烟酰胺的确定培养体系下对人胚胎干细胞进行心脏诱导
<ol>
	<li>接种后第3天，从培养板的每个孔中移除大部分旧培养基，保留足够的培养基以确保hESC集落保持浸没状态（切勿让hESC干燥）。每孔加入4 ml含有20 ng/ml bFGF和10 mM烟酰胺（NAM）的新鲜hESC培养基。</li>
	<li>每隔一天用含有20 ng/ml bFGF和10 mM NAM的新鲜hESC培养基更换旧培养基，使心脏诱导的hESC集落生长至第8–10天。在NAM作用下，集落内的所有细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的分化细胞，并持续增殖。集落体积逐渐增大，至第8–10天时，部分区域的细胞开始出现堆积现象。</li>
</ol>
5. 悬浮培养中持续进行心脏分化
<ol>
	<li>将hESC培养板置于解剖显微镜下（预先将显微镜载物台预热至37°C），并在解剖用无菌罩内操作。使用P2无菌移液枪头边缘或拉制的玻璃毛细管，仔细勾勒出克隆边缘，并去除围绕克隆的成纤维细胞层（从克隆中迁移出的已分化细胞）。</li>
	<li>通过抽吸去除含有悬浮脱落成纤维细胞的旧培养基。用hESC培养基（不含bFGF）洗涤一次，然后每孔加入3 ml新鲜的hESC培养基（不含bFGF）。</li>
	<li>将心肌诱导的hESC克隆切割成小块，并使用无菌移液枪头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。</li>
	<li>将含有脱落克隆碎片的培养基收集至一个50 ml锥形管中。用1 ml/孔的hESC培养基（不含bFGF）洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。</li>
	<li>将含有克隆碎片的无血清hESC培养基按每孔4 ml分装至6孔超低吸附板中，置于37°C恒湿培养箱中培养4–5天，以促进悬浮细胞团簇（心母细胞）的形成。</li>
</ol>
6. 黏附培养中搏动心肌细胞表型的成熟
<ol>
	<li>将含有悬浮心母细胞的培养基收集至一个50 ml锥形管中。在1400 rpm下离心5分钟。尽可能吸除旧培养基，并加入等体积含有10 mM NAM的新鲜hESC心肌分化培养基。</li>
	<li>用移液器吹打混匀悬浮的心母细胞，按每孔4 ml分装至6孔板中。将培养板转移至37°C、湿度饱和的培养箱中，过夜培养以使心母细胞贴壁。</li>
	<li>每隔一天更换一次含10 mM NAM的hESC心肌分化培养基。</li>
	<li>第8天时，更换为不含NAM的hESC心肌分化培养基，并继续每隔一天更换一次hESC心肌分化培养基。撤除NAM后，持续培养约1–2周即可观察到搏动的心肌细胞，且随时间推移数量逐渐增加；这些心肌细胞可维持强烈而节律性的收缩超过3个月。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
在定义的培养体系中，烟酰胺（NAM）足以诱导人胚胎干细胞（hESCs）从多能性状态完全转变为心中胚层表型（图 2B）。当未分化的 hESCs 暴露于 NAM 时，集落内的所有细胞均会发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，这些细胞下调 Oct-4 的表达，并开始表达心脏特异性转录因子 Csx Nkx2.5 和 α-肌动蛋白，符合心中胚层表型特征（图 2B）。这些分化后的细胞将继续增殖，集落随之增大。通常可在集落中细胞开始堆积的区域观察到 Nkx2.5 表达强度增强（图 2B）。经消化脱离后，经 NAM 处理的 hESCs 将在悬浮培养中形成漂浮的细胞团（心前体细胞），以继续心脏分化过程。在允许心前体细胞贴壁后，持续用 NAM 处理 1 周，随后撤除 NAM 并继续培养约 1–2 周，即可观察到搏动的心肌细胞出现，其分化效率相较于未经处理、自发进行多系分化的 hESCs 在相同时间段内的效率显著提高（图 2C）。搏动的心肌细胞团中的细胞将表达心肌细胞特征性标志物，包括 Nkx2.5 和 α-肌动蛋白（图 2C）。通过电生理记录证实，这些搏动的心肌细胞具有强而有节律、协调且同步性良好的收缩活动，其规律性电冲动类似于临床心电图中体表电极记录到的 p-QRS-T 波复合物（图 2C，另见视频）。这些心肌细胞可维持强烈的收缩能力超过 3 个月。
<img alt="多能细胞分化示意图；诱导方法；谱系特异性发育过程。" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1．人类多能干细胞向特化功能细胞分化的传统方法与小分子诱导方法的整体方案对比。（A） 通过人多能干细胞自发形成胚层分化实现多谱系倾向的传统方法示意图。（B） 仅通过提供小分子即可实现人多能干细胞高效、精确地定向诱导为特定临床相关谱系的示意图。
<img alt="心脏分化过程；Oct-4、Nkx2.5 染色；心肌细胞簇结果；时间线图表。" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在定义明确的条件下，烟酰胺可直接从多能性诱导心脏谱系特化，并促进其向搏动心肌细胞发展。（A） 示意图显示了人胚胎干细胞（hESCs）定向心脏分化的实验方案时间线。（B） 在定义明确的培养体系中，未分化的 hESCs 经烟酰胺（NAM）处理后，相较于对照组中经模拟处理（DMSO）的 hESCs，细胞集落内开始出现大量 Oct-4（红色）阴性的分化细胞。NAM 诱导产生的 Oct-4 阴性细胞开始表达 Nkx2.5（绿色）和 α-肌动蛋白（α-actinin，红色），符合早期心脏分化的特征。在细胞逐渐堆积的集落区域，通常可观察到 Nkx2.5 表达强度逐步增强。所有细胞的细胞核均经 DAPI 染色显示（蓝色）。（C） NAM 诱导的心脏定向 hESCs 生成了具有搏动功能的心肌细胞，且效率显著提高，表现为出现大量呈现节律性收缩的细胞簇（参见电生理图谱及视频），并免疫染色显示 Nkx2.5（绿色）和 α-肌动蛋白（α-actinin，红色）阳性。图中展示了代表性的大面积搏动心肌细胞簇的相差图像以及代表性收缩心肌的高倍镜图像（亦见相应视频）。箭头指示用于电生理记录的大型搏动心肌细胞簇。搏动心肌细胞的电生理图谱显示规律、同步的节律性脉冲，类似于临床心电图中观察到的 p-QRS-T 波复合体。比例尺：0.1 mm。
视频：由NAM诱导的hESC分化而来的收缩型心肌细胞。视频1和视频2展示了贴壁后约1个月和3个月时具有代表性的大块搏动心肌细胞簇。视频3和视频4展示了高倍镜下具有代表性的收缩性心肌组织。视频5展示了未经NAM处理、自发分化自hESC的典型小搏动心肌细胞簇，作为对照。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">单击此处观看 视频 1。</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">单击此处观看 视频 2。</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">单击此处观看 视频 3。</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">单击此处观看 视频 4。</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">单击此处观看 视频 5。</a>

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作者声明存在竞争利益。XHP 是 Xcelthera 公司的创始人。XHP 和 EYS 拥有与 hESCs 相关的知识产权。

对于发育研究和临床转化而言，一个主要挑战是如何高效且可预测地引导多能性人类干细胞广泛而多向的分化潜能，使其定向分化为特定表型。尽管这些细胞能够自发分化 体外 通过多谱系聚集体阶段分化为所有胚层的细胞，在人胚胎干细胞衍生的多谱系聚集体（类胚体）中，仅有极小部分细胞（&lt;2%）会自发分化为心肌细胞13-15 (图 1A经免疫筛选后，富集的心肌细胞群体在注入动物模型心脏后，能够作为生物起搏器，在机械和电学功能上挽救受损心肌的功能。13在啮齿类动物梗死模型中，移植的人胚胎干细胞来源的心脏前体细胞能够存活并成熟长达12周，部分重建受损心肌并改善心脏收缩功能14,15然而，通过多谱系分化方法从多能细胞生成人心脏定向细胞的效率低下，且移植后存在较高的致瘤风险，这些因素阻碍了其进一步的临床转化。开发能够将多能性人胚胎干细胞（hESC）的广泛分化潜能 exclusively 且可预测地导向心脏表型的策略，对于充分发挥 hESC 生物学在心脏领域的潜力至关重要。为了实现人多能干细胞向特定谱系的均一化转化，我们采用了一种明确的培养体系，在确保未分化 hESC 增殖的同时，探索仅通过添加小分子即可高效、可控地将多能 hESC 特异性诱导为某一具有临床相关谱系的条件图1B我们发现，在确定的培养条件下，烟酰胺可高效地直接诱导多能性hESCs向心肌细胞系分化，并进一步发育为高效搏动的心肌细胞（图 2Nkx2.5 是一种在进化上保守的同源框转录因子，对正常心脏发育至关重要，其基因突变与人类先天性心脏病（CHD）相关，后者是最常见的人类出生缺陷16Nkx2.5 的表达是迄今为止所研究的所有脊椎动物中心脏前体细胞的最早标志物，对于心脏正常分隔以及电传导系统的形成与成熟至关重要。16在脊椎动物中，早期 Nkx2.5 的表达起始时间与表达模式大致与胚胎早期发生中心脏特化的时间和区域相吻合，且 Nkx2.5 基因在心脏发育过程中持续表达16在我们的hESC模型中，NAM似乎通过促进心脏特异性转录因子Nkx2.5的表达，直接从多能性hESC诱导心脏分化，该过程可能模拟了人类胚胎心脏发生过程中从多能性上胚层形成心脏中胚层的特化过程。未来的研究将揭示人类心脏发育中调控基因和表观遗传的控制分子，这些分子可作为替代手段，为小分子介导的直接调控和调节hESC多能性命运提供途径，从而获得用于再生治疗的临床相关细胞谱系。未使用NAM处理时， &lt; 2%的人类胚胎干细胞将自发分化为跳动的心肌细胞12-15通过NAM处理，我们能够生成 &gt; 95% 胚胎心脏前体细胞及 &gt; 50% 跳动的心肌细胞来自在限定培养条件下维持培养的人胚胎干细胞，该过程可能模拟人类胚胎心脏发育12最近，已知的心脏命运决定基因已被用于将小鼠成纤维细胞直接重编程为出生后跳动的心肌细胞，但效率较低 &lt; 0.5%17, 18然而，重编程的体细胞历来存在基因表达异常和加速衰老的问题，从而限制了其治疗应用价值19-21最后，我们在此建立的方案仅限于来源于人类囊胚内细胞团（ICM）或上胚层的多能性hESCs4,5，可能不适用于其他多能性细胞，包括动物来源的胚胎干细胞以及从更早期的桑葚胚（八细胞期）胚胎衍生的胚胎干细胞22以及人工重编程细胞23.

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>生长因子减少型</td></tr><tr><td>人层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053036</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-KO</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（Knock-out serum replacement）</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（MNAA, 100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM 氨基酸溶液（MEAA, 100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11130050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇（Mercapt&amp;#8211;thanol）</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白组分 V 替代物（Albumax）</td><td>Invitrogen</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>PeproTech Inc</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Invitrogen</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>人激活素 A（activin A）</td><td>PeproTech Inc</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>成分明确的胎牛血清（Defined FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>6 孔超低吸附板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

迄今为止，缺乏合适的人类心肌细胞来源一直是通过细胞移植或心脏组织工程再生人心肌组织的主要障碍1-3心肌细胞在出生后很快进入终末分化状态，并失去增殖能力。目前没有证据表明，来源于其他组织（如骨髓或脐带血）的干细胞/祖细胞在移植到心脏后能够分化为具有收缩功能的心肌细胞。1-3成体干细胞治疗，无论是内源性干细胞还是通过细胞输送的方式，均未能满足心肌损伤后再生或修复的需求。1-3遗传稳定的 人类胚胎干细胞（hESCs）具有无限增殖能力和多向分化潜能，可提供一种多能性细胞资源 体外 获得大量仅限于需要修复和再生的谱系的人体体细胞4,5由于全球心血管疾病的高发以及供体器官的严重短缺，人们迫切希望开发基于人胚胎干细胞（hESC）的治疗方法作为替代策略。然而，如何高效且可预测地引导具有广泛分化潜能的多能hESC定向分化为特定表型，一直是发育生物学研究和临床转化面临的主要挑战。传统方法依赖于多能细胞通过自发的胚层分化产生多谱系倾向，导致谱系定向效率低下且不可控，常伴随表型异质性和不稳定性，因而具有较高的致瘤风险。6-8 （参见示意图） 图 1A此外，通常用于hESCs分离、扩增和分化过程中的未明确成分的外源性/动物源性生物添加剂和/或饲养层细胞，可能使此类细胞特化移植物在患者中的直接应用变得困难9-11为克服这些障碍，我们已确定了一种明确的培养体系所需且充分的组分，该体系可维持人胚胎干细胞（hESCs）上胚层多能性，并可作为后续研究的平台 从头合成 通过小分子诱导获得临床适用的hESCs并有效、均一地将其定向分化为临床相关谱系12 （见示意图于 图 1B）。在筛选了多种小分子和生长因子后，我们发现这种确定的条件使得烟酰胺（NAM）足以直接从多能性人胚胎干细胞诱导心中胚层的特化，随后进一步发育为心原细胞，并高效生成人类搏动的心肌细胞（图 2我们定义了直接从多能性人胚胎干细胞（hESCs）诱导心肌母细胞的条件，无需经过多谱系拟胚体中间阶段，从而能够高效、可控地获得大量涵盖各个发育阶段的人类心肌细胞，用于细胞治疗。

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。

迄今为止，缺乏合适的人类心肌细胞来源一直是通过基于细胞的方法再生人类心肌组织的主要障碍。

以下实验的总体目标是利用小分子诱导，直接且专一地从多能性人胚胎干细胞获得心源性后代细胞。该过程通过在特定条件下维持未分化的人胚胎干细胞，并向其中添加烟酰胺来实现。随后，将心脏分化细胞分离，形成心母细胞，即在悬浮培养中漂浮的细胞簇。心胚细胞形成后，将其接种于心脏分化培养基中，继续发育为跳动的心肌细胞。最终通过去卷积或共聚焦显微镜进行免疫荧光检测，并结合电生理记录来评估结果。该技术的主要优势在于，仅通过添加小分子即可高效地将人多能干细胞特异性地诱导分化为心脏谱系细胞。在现有的多谱系分化方法中，仅有少数细胞会向心肌表型分化。配制储存液时需注意几个步骤：将Matrigel和人层粘连蛋白从-80°C缓慢解冻至4°C，过夜保存；培养基在4°C保存，并在使用前始终将其预热至37°C。此外，在配制人ES细胞培养基时，某些添加剂需在使用前加入，包括bFGF、抗坏血酸、人胰岛素以及转铁蛋白。接下来，在包被培养板前应立即配制Matrigel或人层粘连蛋白工作液。在制备好明胶预包被的组织培养板后，将其置于含5%二氧化碳、37摄氏度的环境中孵育。明胶可替换为Matra胶或层粘连蛋白工作液。通过在4摄氏度下过夜孵育对这些培养板进行包被。首先让人类胚胎干细胞集落生长五至七天，然后准备对部分集落进行传代。选择含有超过75%未分化人类胚胎干细胞的集落。这些集落通常略显不透明，边缘清晰，含有堆积状细胞。开始分化的迹象通常表现为发白的集落，而主要含有已分化细胞的集落通常看起来较透明。不要选择白色或透明的克隆。将培养皿举至光亮处，用记号笔在培养皿底部沿克隆轮廓标记出略显不透明的克隆。使用无菌P2移液枪头的边缘，将人胚胎干细胞克隆周围的成纤维细胞层剥离。 然后去除周围的成纤维细胞，并移除集落中所有已分化的部分。接着吸除含有脱落分化细胞的旧培养基。随后，用不含bFGF的人类胚胎干细胞培养基每孔洗涤未分化细胞一次，然后在使用前立即向新鲜培养基中加入3毫升含B-F-G-F-B-F-G-F的人类胚胎干细胞培养基。现在使用无菌的 P2 移液枪头将菌落切成小块，并从平板上分离下来。将分离下来的菌落碎片及其培养基吸入一个 50 毫升的锥形管中。每个孔额外吸取 1 毫升培养基进行冲洗。细胞现已准备好使用小分子进行进一步分化。首先将新包被的培养板预热至37摄氏度。从培养板中吸除包被液，并向每个孔中加入含有细胞团块的4毫升培养基，然后轻轻将培养板转移至培养箱中，避免振荡。不要扰动培养板，以允许细胞贴壁。然后吸除大部分旧培养基，仅留下足够浸没细胞的培养基。切勿让细胞干燥。将含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和烟酰胺的新鲜人ESL培养基混合，并将配制好的培养基各取若干毫升加入到每孔中。该培养基可在4°C下保存长达两周，在此期间可每隔一天更换一次培养基，以促进细胞集落的生长。培养8至10天后，细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的已分化细胞，并大量增殖、堆积成层。随后进行悬浮培养：开始时，将已自发分化并迁移形成成纤维细胞层的细胞从ESL克隆中分离。使用前述方法，以无菌移液管头操作，然后吸除含有悬浮脱落的成纤维细胞的旧培养基。用HESC培养基洗涤细胞一次，并用三毫升HESC培养基重悬细胞，此时使用无菌P2移液管头。将菌落切成小块并从平板上剥离。将含有剥离菌落的培养基收集至一个 50 毫升的离心管中。用 1 毫升培养基冲洗孔板孔，然后将冲洗液加入收集的混合液中。随后将4毫升混合细胞分装至6孔超低吸附培养板的每个孔中，培养4至5天。将培养板置于培养箱中，使细胞形成悬浮的细胞簇或心肌前体细胞，并进一步发育为跳动的心肌细胞表型。用培养基将细胞收集至50毫升锥形管中。然后以 1,400 RPM 离心细胞 5 分钟。吸除上清液，尽可能称取大部分旧培养基，并加入等量的新鲜心肌分化培养基，其中含有 10 毫摩尔烟酰胺。用移液器混匀悬浮的心球细胞，然后将四毫升心球细胞悬液分装至六孔组织培养板的每个孔中。将培养板置于37摄氏度的湿润培养箱中，使心球细胞过夜贴附于组织培养板。每隔一天在培养过程中进行换液。第8天更换含有10 µmol/L烟酰胺的心肌分化培养基。转为心肌分化培养，此后继续每隔一天更换一次不含烟酰胺的培养基。在撤除烟酰胺后的两周内，开始出现搏动的心肌细胞，并且数量逐渐增加。烟酰胺足以诱导在特定培养体系中维持的人类胚胎干细胞从多能性状态完全转变为心源性中胚层表型。当未分化的人类胚胎干细胞暴露于烟酰胺后，集落内的所有细胞均发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，并下调OCT4的表达。这些细胞还开始表达心脏特异性转录因子NKX2.5，并表达α-肌动蛋白。这两个特征均与心源性中胚层表型一致。这些已分化的细胞在集落中细胞堆积的区域继续增殖并增大体积。在解离后，经烟酰胺处理的人类胚胎干细胞在悬浮培养中形成了心前体细胞，NKX2.5 的表达随之增强。在允许心源性前体细胞贴壁后，用烟酰胺处理心源性前体细胞一周，在撤除烟酰胺后一至两周内，开始出现搏动的心肌细胞，且效率显著提高。这些细胞表现为能够进行节律性收缩的细胞簇；而未经IDE处理的细胞则未表现出此类特征。搏动的心肌细胞簇内的细胞表达心肌细胞的特征性标志物，包括NKX2.5和α-肌动蛋白。通过电生理图谱证实，跳动的心肌细胞收缩力强、节律性好，且协调同步、节律稳定，表现出类似于临床心电图中体表电极记录到的P-Q-R-S-T复合波的规律性电冲动。此外，一旦掌握该技术，心肌细胞可长期维持其强劲的收缩能力，持续超过三个月。若操作得当，该技术可在约五周内从多能性人胚胎干细胞中稳定、均一地诱导生成心脏前体细胞及跳动的心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高效的推导人类心脏的前体和从多能干的小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子...

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

了解利用小分子烟酰胺诱导人多能胚胎干细胞高效分化为心脏前体细胞和功能性心肌细胞的方法。该技术通过悬浮培养形成心芽体，再贴壁分化为搏动的心肌细胞，为心血管疾病治疗提供可靠的细胞来源。

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

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