平行板流动腔和评估内皮祖细胞层流剪应力下连续流电路
January 17th, 2012
我们所描述的主题贴壁的细胞在无菌的连续流电路层流剪应力的方法。细胞的黏附，形态可通过透明腔研究，从代谢物的分析和对未来的实验或文化的剪切曝光后的干细胞的电路样本。
本视频文章的总体目标是描述一种使贴壁细胞处于层流条件下的技术，并评估对可量化的流体剪切应力的响应。这是通过首先组装没有流室的流动回路来实现的。该回路包括储液罐脉冲、阻尼器、硬管、软管、四向旋塞和连接的诱饵适配器，以及空气过滤器。
下一步是用所需的 8 种丰富的物质填充回路，例如在无菌条件下的细胞培养基，然后启动泵以填充脉冲阻尼器并清除管道中的空气。然后将池座载玻片插入流通室的底板。该过程的最后一步是将流动回路与流动室对齐进行完整组装。
最终可以获得结果，显示荧光标记的内皮祖细胞在液体剪切应力暴露下通过荧光显微镜的排列研究细胞的功能行为。通常需要通过使细胞承受流体剪切应力来模拟体内生理学。我们设计了一个平行的板流室和连续流回路，使我们能够在流动条件下研究细胞并通过透明室观察它们。
这项技术可以作为医学和工程领域的宝贵研究工具。我们的流通室允许使用正置或倒置显微镜对流动中的细胞进行间歇性或实时可视化。此外，Ach Nick 博士的设计允许研究人员使用标准显微镜镜头对透明或不透射线表面的细胞进行成像。
此外，它可以作为药理学研究中的重要工具，研究药物在流式条件下对细胞的影响。设置的可视化至关重要，因为仅通过阅读协议很难掌握其中几个步骤。我将逐步说明如何设置 Dr.Ock Next 实验室常用的流动室和流动回路来组装流动回路。
首先将一段 36 英寸的硬管连接到脉冲阻尼器的一端到另一端。连接一段 18 英寸的软管。在 18 英寸软管部分的末端放置一个 1 8 英寸的公诱饵适配器。
将公诱饵连接到 1 8 英寸母诱饵适配器。将母诱饵连接到新的 18 英寸软管段上。在 250 毫升玻璃烧杯盖上钻三个孔。
为了安装管子，将一段 1.5 英寸的软管插入一个孔中。作为通风口。将硬管和软管的自由端穿过瓶盖上的其他两个孔插入 250 毫升玻璃瓶中，该玻璃瓶将充当储液器。
确保硬管到达储液槽底部。在整个回路设置过程中保持无菌对于该程序的成功至关重要。因此，所有部件都必须进行消毒，并且您必须全程佩戴无菌手套。
除了组装的零件外，这些零件还必须进行消毒。一个完整的流动室，三个 x 2 英寸的软管段，一个公头和一个母头，一个八分之一的诱饵适配器，四个半英寸的平头螺钉，6 个 5 16 英寸，八个 30 秒。每英寸轨道、平头螺钉、一把镊子、一张载玻片和两条蒸汽消毒毛巾。
在 121 摄氏度下高压灭菌 60 分钟。将流动回路流通室 4 x 4 向截止旋塞逐一放置，将截止旋塞和所有消毒部件放在该无菌区域上。戴着无菌手套，连接两个四向旋塞。
将盖子盖在打开的样品端口上。拆下连接流量回路的两个软管段的公式和式内螺纹诱饵适配器，并插入连接的旋塞。将插入储液槽的软管连接到 30 毫升注射器中，然后取下注射器活塞。
用 125 毫升 EPC 培养基填充瓶子。将软管重新连接到旋塞上。将无菌注射器过滤器放入通风口。
现在将流动回路转移到 37 摄氏度、5% 二氧化碳的加湿培养箱中。将硬管夹入指示用于此类煤 Palmer 管的主柔性辊泵头中。确保管道不与滚轮泵安装轨道重叠。
用记号笔在泵头的两侧标记管路。确保所有旋塞旋塞都朝向样品端口关闭并沿流路打开后，启动泵。验证流向。
PERFUSE 8 应从玻璃储液器通过硬管移动到脉冲阻尼器中。对于流通室组装，使用无菌手套将一个 2 英寸的软管段连接到一个 8 英寸的母诱饵适配器。将另一个 2 英寸的软管段连接到一个 1 8 英寸的公诱饵适配器。
将带内螺纹诱饵适配器的 2 英寸软管连接到流入口，将带有内螺纹诱饵适配器的 2 英寸软管连接到流出口。将四向旋塞连接到这两个诱饵适配器上。将剩余的 2 英寸软管连接到从气泡捕集器上取下的侧端口连接器上，并使用无菌镊子连接单向截止旋塞。
从细胞培养容器中取出细胞接种载玻片，并将其放入流通室底板上的凹槽中。确保使用注射器或移液管将玻片置于细胞固定的一侧朝上，将 10 mL 温热的 EPC 培养基放在细胞固定的玻片上。让介质覆盖流通室中的载玻片，但不要将介质溢出底板上的 O 形圈。
将流通室的顶板放在底板上，对齐螺孔。保持两块板平行，以免气泡进入腔室螺板。一起。使用电动自动螺丝刀打开连接到流入侧气泡捕集器端口的单向旋塞，对流入的气泡捕集阱进行空气处理。
使用 10 毫升注射器用 EPC 培养基轻轻冲洗流入管，然后关闭该旋塞并盖上盖子。现在，通过打开流出口四向旋塞并轻轻冲洗 EPC 介质通过流通室，对腔室通道进行通风。再次使用 10 毫升注射器盖，将所有四向旋塞连接处关闭。
将流通室转移到装有组装好的流路的加湿培养箱中。暂停 flow circuit 泵关闭 flow 回路。沿流动方向停止旋塞以防止泄漏。
将流通室连接到流通回路 将流通室连接到流通回路后，沿流动方向打开旋塞阀。恢复流量泵并确保 PERFUSE 8 流向正确。将流速调整到所需的剪切应力。
在流动实验期间，可以将流动室从回路中取出，以便通过光学或荧光显微镜对细胞进行成像。为此，请断开流量室与旋塞旋塞处的流路的连接，以停止旋塞连接。收集灌注 8 个样品进行分析。
首先，暂停泵，关闭最靠近脉冲阻尼器的旋塞旋塞。取下保护盖，将其倒置，以确保其不受污染。将小注射器插入样品端口。
沿流通室方向关闭旋塞，保持样品端口和电路沿脉冲阻尼器方向打开。从回路中吸取所需量的样品，在取出注射器之前将旋塞阀朝向样品端口关闭。将大量 8 个样品储存在贴有标签的小瓶中，并在零下 80 摄氏度下冷冻。
重新盖上样品端口并确保在开始流路之前所有旋塞阀都已打开。使用这种方法，人血源性内皮祖细胞可以在 15 分钟内接种到钛载玻片上，并在生理剪切力下粘附。如图所示，EPC 在气流的影响下扩散，从接种后立即到三小时后的约 657 平方微米，以及在每平方厘米 15 丁的流体剪切应力下 48 小时后扩散到约 1， 152 平方微米。
该光学显微镜图像说明了人类 EPC 的随机取向。在以每平方厘米 100 次用餐的速度流动 3 小时后，经过 6 小时的静态静置期后，细胞已经扩散，但保持随机方向。以每平方厘米 100 次的速度承受 48 小时的流体剪切应力后，EPC 对齐并沿流动方向定向。
在这里，EPC 用 CTO 标记，细胞核用 herx 染色，在流后死亡。为了进行比较，该图像显示了钛载玻片上的猪 EPC 与流动方向对齐。经过 48 小时的流动和每平方厘米 15 次的剪切应力暴露后，细胞边界用抗 pcam 染色，细胞核用胞质素核酸染色。
该方法还允许在预定时间点获得 PERFUSE 8 的样品，用于分析和/或定量分泌的细胞代谢物。这里显示的是猪 EPC 在 48 小时流动实验中产生亚硝酸盐的示例。在尝试此程序时，始终保持无菌很重要。
此外，在连续流动开始之前，采取必要的步骤以减少流通室中的气泡数量也很重要，因为它们可能会撕裂细胞。我们还建议在大量流动之前检查流通室和回路中的每一个连接，以防止 PERFUSE 8 在实验期间泄漏。该腔室设计有内置 O 形圈，允许顶板和底板完全对立，并提供防漏密封，而无需真空泵。
此功能还确保了实验之间的腔室高度恒定，并且无需橡胶垫圈或调整。我们的流通室采用标准化的显微镜载玻片。因此，有大量的细胞可用于进一步的实验。
例如，可以评估流式细胞中的 RNA 和 DNA 的蛋白质合成或基因表达。我们的电路设计允许收集灌注 8 个样品，用于分析和定量细胞代谢物，例如亚硝酸盐，亚硝酸盐是一氧化氮的主要氧化代谢物，由细胞在流体剪切应力下分泌。观看此视频后，您应该对如何组装我们的流动室和无菌流动回路以使粘附池承受流体剪切应力有很好的了解。
概述
本文描述了一种使用无菌连续流回路对附着细胞施加层流剪切应力的方法。该技术允许通过透明腔室研究细胞黏附和形态，使得在暴露后能够进行代谢物分析和细胞收集。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 流体力学
- 生物医学工程
背景
- 了解剪切应力下的细胞行为对模拟体内条件至关重要。
- 流体剪切应力影响各种细胞功能和反应。
- 平行板流动腔室的设计有助于研究这些效应。
- 在流动条件下观察细胞对于准确分析至关重要。
研究目的
- 开发一种对附着细胞施加剪切应力的可靠方法。
- 定量评估细胞对流体剪切应力的响应。
- 为医学和工程领域的研究人员提供协议。
使用的方法
- 组装包括各种管路和止水阀的流动回路。
- 在无菌条件下用细胞培养基填充回路。
- 将种有细胞的载玻片插入流动腔室中进行观察。
- 使用荧光显微镜来观察剪切应力下细胞的排列情况。
主要结果
- 观察到荧光标记的内皮祖细胞成功排列。
- 流动腔室设计允许实时观察细胞反应。
- 结果表明剪切应力在研究细胞行为中的重要性。
- 该方法可应用于药理学以评估药物对细胞的影响。
结论
- 这种技术是研究细胞对机械力响应的研究人员的宝贵工具。
- 它增强了对生理条件下细胞行为的理解。
- 该协议可以适应各种细胞类型和实验条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative evaluation of endothelial progenitor cells (EPCs) under controlled laminar flow shear stress addresses a critical gap in modeling vascular biology for early-stage drug discovery. This platform enables reproducible assessment of cell adhesion, morphology, and metabolite secretion under physiologically relevant mechanical forces, supporting predictive confidence in vascular target validation. The scalable recovery of viable cells and secreted factors positions this method as a reusable asset for portfolio-wide mechanistic de-risking and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanosensitive pathways in EPCs and other adherent cell types.
- Supports functional target validation by quantifying cellular alignment and secreted metabolites under defined shear stress.
- Facilitates biological de-risking by mimicking in vivo vascular conditions in a controlled ex vivo system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, sterilizable platform for reproducible cell-based assays under flow.
- Allows for high-yield recovery of cells and perfusate for downstream molecular analyses.
- Enables quantitative readouts of cell morphology, adhesion, and metabolite secretion for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical stimulation with disease-relevant vascular biology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling collection of RNA, DNA, and secreted factors post-flow.
- Reduces translational risk by modeling physiologically relevant shear stress responses in human and animal EPCs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of vascular targets, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanotransduction and endothelial function under controlled shear stress.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cell adhesion, morphology, and metabolite secretion.
- Analytics: Facilitates collection and analysis of perfusate for secreted metabolites such as nitrite, supporting comparative studies.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo vascular responses for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, sterilizable platform adaptable to multiple cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and high-throughput sample recovery.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular and mechanosensitive targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and flow system assembly.
- Needs access to incubators, roller pumps, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of flow rates, chamber dimensions, and sample handling.
- Adaptable to various adherent cell types, but optimization may be needed for cell-specific responses.
- Careful management of air bubbles and leak prevention is essential for experimental success.
