Name: 平行板流动腔和评估内皮祖细胞层流剪应力下连续流电路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学习使用平行板流动腔和连续流电路对内皮祖细胞施加层流剪应力的方法。该技术可在无菌条件下实时观察细胞形态变化，适用于细胞生物学和生物医学工程研究。

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作者谨此感谢生物医学仪器与机械加工车间的 Joe Owen 在流动室部件的加工与组装过程中所付出的不懈努力，以及徕卡显微系统公司的 Matt Maudsley 在通过流动室成像细胞技术方面提供的协助。我们衷心感谢杜克大学灌注服务部的 Kevin Collins 和生物医学工程系的 Steve Wallace 博士在流动回路设计方面提出的宝贵建议。此外，我们还要感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目对 Alexandra Jantzen 的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）通过资助项目“自体EPC衬层改善循环辅助装置生物相容性”（项目编号：RC1HL099863-01）所提供的支持。

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</ol>

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我们的流体回路和流动腔室可使贴壁细胞（例如内皮祖细胞，EPCs）暴露于特定的流体剪切应力下。由于腔室的顶部和底部均为透明材质，因此可实时通过腔室直接观察细胞的黏附和形态，也可在流动实验结束后拆卸腔室进行观察。此时，可在无菌条件下收集细胞，用于重新接种，或提取其 DNA 或 RNA 等，以进行后续分析。
为实现层流，腔室的设计必须满足若干条件。
首先，流动必须是层流，可通过计算其雷诺数（Re）来验证，雷诺数是惯性力与黏性力的比值。（若黏性力占主导，则Re较小，流动为层流或“充分发展流”——通常当Re &lt; 2300时如此；若惯性力占主导，流动将变得越来越无序，直至形成湍流，通常当Re &gt; 4000时即为此情况。）我们可根据公式38计算Re，
<img alt="雷诺数公式，流体动力学方程，流动分析中的关键概念" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 3">
其中ρ为流体密度，Q为流速，μ为黏度，w和h分别为腔室的宽度和高度，Dh为水力直径，其定义见公式48，
<img alt="用于矩形通道流动分析的水力直径公式方程。" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 4">
我们三个流室的高度范围为166 - 267 μm，在计算得到15 dynes/cm2剪切应力的流速下，雷诺数范围为13.9 - 34.6。在计算得到100 dynes/cm2剪切应力的流速下，流室的雷诺数范围为90.4 - 234。所有这些雷诺数均远低于2300，符合层流条件。
其次，为了使速度场和剪切应力沿流动通道方向的距离无关（即充分发展），从流体入口到载玻片的距离必须大于入口段长度Le。这可通过根据公式59计算入口段长度来满足。
<img alt="科学分析研究中的热力学方程 Lₑ = 0.04hRₑ。" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 5">
对于上述列出的数值，入口段长度范围为 0.01 至 0.25 cm。
第三，为了确保横向方向上的流速和剪切应力与一维通道流的值（ΔPh/2L）相比无明显变化，高宽比 h/w 必须远小于1。当二维流动条件下的平均壁面剪切应力达到一维流动条件下壁面剪切应力的95%时，h/w 必须等于0.10；当二维流动条件下的壁面剪切应力达到一维流动条件下的97.5%时，h/w 必须等于0.05。本研究所设计的流动腔室宽度为1.7 cm，高度为166–267 μm，满足上述标准。
如果入口处不存在横向压力梯度，则压力仅沿流动方向发生变化。可通过在流动路径中使用染料或示踪粒子来评估这一情况。此外，对于稳态流动实验，需在流动回路中插入脉动阻尼器。该装置可消除由蠕动泵在回路中引起的大部分脉动，从而使我们能够近似满足稳态流动的假设条件。需要注意的是，所使用的脉动阻尼器应与回路中的泵和管路相兼容，以便有效消除蠕动泵在特定频率下所产生的输出流动脉动。在本演示中，当脉动阻尼器安装在排液管路中，并与任意一款 Masterflex L/S 系列泵（0 - 600 转/分钟）及 I/P 26 管路配合使用时，Masterflex L/S 脉动阻尼器可实现层流流动。对于脉动流动，可使用可编程泵来生成不同的波形。
对于脉动流，可以使用可编程泵来生成各种波形。
此外，该回路设计使得可在不同时间点轻松收集灌流液样品，而不会污染细胞或流动培养基。在本示例中，NO 的浓度2- 采用 Ionics/Sievers 一氧化氮分析仪（NOA 280，Sievers Instruments，Boulder，CO）通过化学发光法测定，方法如前所述10用于亚硝酸盐分析的还原剂为乙酸中的碘化钾（14.5 M 乙酸和 0.05 M KI），该还原剂具有将亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO）的还原电位，但不足以还原氮的其他高价氧化物（如硝酸盐），因此对亚硝酸盐具有相对特异性。亚硝酸盐的总生成量通过生成浓度与回路总体积的乘积计算，并根据取样过程中损失的体积进行校正。6.
以下步骤对于成功实施流式实验至关重要：
<ol class="lroman">
	<li>在建立流动系统时，应尽量避免气泡的形成，因为气泡可能将细胞从其表面撕脱。为避免此问题，在将流动室的上部放置到下部时应格外小心，最佳操作方式是保持上下两部分相互平行，并一次性平稳地将上部压下，过程中不再调整。这样，流动通道中可能存在的微小气泡或漂浮气泡将被引导至铝制外壳两端的气泡捕获区。</li>
	<li>必须确保储液罐中的出流管延伸至罐底。否则，当灌注液液面略低于管口时，空气可能被吸入从储液罐通向流动室的管路中。</li>
	<li>研究人员应熟悉泵的流动方向，以防止启动流动时泵意外反向运行，否则会导致空气被吸入回路和流动室中。</li>
	<li>为避免泡沫形成（由血清中变性蛋白引起），建议将从流动室通向储液罐的管路末端置于储液罐内灌注液液面上方约2.5厘米处。但保持管口高于液面有助于在实验过程中确认液体是否正常流入储液罐。</li>
	<li>在拧紧流动室各部件时，应一手牢固握住外壳，另一手操作电动螺丝刀。请注意，电动螺丝刀的运转会产生扭矩，当螺丝拧紧时可能导致流动室突然旋转。</li>
	<li>为防止回路中产生压力波而使细胞从表面脱落，启动流动前应确保所有旋塞阀均处于打开状态。</li>
	<li>对于较长时间的流动实验（> 48小时），我们建议使用更坚硬且更具弹性的管路插入泵头，以防止管路破裂。</li>
	<li>由于泵头滚轮调节不当，管路可能在泵头内部发生“迁移”。因此，我们建议密切注意管路在泵头中的固定情况，并用记号笔在管路两端做标记，以便在实验过程中轻松发现管路是否被“拉入”或移位。</li>
	<li>每次开始灌注前，务必仔细检查回路和流动室的每一个连接点，以防止因连接不良导致灌注液泄漏。这一点对于脉动阻尼器的进流和出流接头尤为重要！</li>
	<li>若使用荧光标记，请注意限制光照暴露时间。</li>
</ol>
我们流动腔的一个可能局限性在于，其高度由铝材上加工出的通道高度固定。然而，这一设计的优点是无需在每次实验前校验和调整通道高度，从而只需将泵的流速调节至目标值即可简化剪切应力的计算。根据您的研究目标，可能需要在不提高泵速的情况下增加剪切应力。在此情况下，我们建议提高灌注液的黏度，例如向培养基中添加葡聚糖11。
流动回路的一个可能局限性是所用培养基体积较大，这在尝试定量细胞代谢物的极低浓度时可能会带来问题。尽管此处未展示，但通过使用更小的储液罐和脉动阻尼器，并缩短管路长度和减小管径，可显著减小回路体积。
此外，还有多种其他可商业获得的系统可用于在培养细胞中施加流体剪切应力。基于微流控的系统，例如 Fluxion 公司的 BioFlux 系统，能够通过将溶液加载到作为这些通道输入和输出储液池的孔板中，实现对不同微流控通道内细胞的同时分析12,13,14。然而，这些微流控系统及其他类似系统不兼容标准显微镜载玻片，且无法回收足够数量的细胞用于后续实验，例如 RT-PCR 或 Western Blot。此外，这些系统操作性较差，成本至少为 40,000 美元，根据配套设备的不同，总费用可能超过 100,000 美元。
Flexcell International Corporation 提供的两种微流体系统——Flexcell Streamer 系统和 FlexFlow 系统——已成功用于在流体流动条件下研究内皮细胞15,16,17、人纤维环细胞18以及成纤维细胞19。另一种通过 GlycoTech 提供的系统已被用于研究肿瘤细胞黏附20和白细胞黏附21至内皮单层细胞。
Streamer 系统可同时对多张载玻片施加相同的剪切应力，但其缺乏观察窗口，且与我们的设计不同，无法实现对流动条件下细胞的实时观察。
FlexFlow 系统具有观察窗，但需要使用直立显微镜，而这种显微镜可能并非大多数实验室的标准配置。此外，将细胞包被的盖玻片放入流动室时，FlexFlow 系统要求将其倒置。这使得无法在不透明表面（例如我们研究中所展示的钛涂层玻璃）上观察荧光标记的细胞。最后，该系统需要专门购买配套的盖玻片，且整体设备价格高达数千美元，与 Flexcell Streamer 系统相当。
GlycoTech 提供圆形和平行板式矩形流动室，其成本显著较低，但由浇铸丙烯酸材料制成，无法像我们的流动室一样方便地进行蒸汽高压灭菌。值得注意的是，其他已有报道可高压灭菌的流动室因需要特殊显微镜镜头而显得不实用22,23。GlycoTech 系统在上下板之间使用硅橡胶垫圈，该垫圈在反复使用后厚度会发生变化，从而导致流动室高度随时间改变（制造商建议每使用十次后更换新的垫圈）。我们的铝制流动室内置O型圈，可确保上下板完全贴合，从而保证实验间流动室高度恒定。最后，许多流动室设计（包括 GlycoTech 流动室）需要真空泵来实现无泄漏密封，而我们的设计则无需此装置。
尽管此处未展示，整个流动实验过程中可将流室置于显微镜下，以实现对细胞黏附和/或行为的实时成像。如需如此，建议在流室下方使用加热灯或加热垫，以维持灌注液温度在37 °C。此外，若不希望对细胞、代谢物或研究性药物或试剂进行“循环”使用，则可用注射泵替代滚压泵24。
还可以将不同标记的细胞流经贴壁细胞，例如将荧光标记的血小板流经融合生长的内皮祖细胞（EPC）层（采用Achneck等人6,25描述的血小板检测方法），以评估在流体剪切应力条件下的细胞间相互作用。我们的流动腔室结合了其他现有流动腔室的多种优点，例如灌注液取样口和观察窗，并具有一个重要优势，即可兼容倒置或正置显微镜。该腔室可完全高压灭菌，允许在恒定腔室高度下重复实验，且无需使用真空泵即可实现密封防漏。

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0794012&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">10 ml 注射器&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0794012&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">07940-12&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060000&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">单向旋塞&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060000&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">30600-00&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060004&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">四通旋塞&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060004&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">30600-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>铝合金</td><td>N/A</td><td>6061</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（4孔，矩形）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>细胞示踪橙染料</td><td>英杰公司</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Research Organics</td><td>2162D</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>英杰公司</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 单次添加试剂盒</td><td>龙沙公司</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550004&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">雌性鲁尔接头&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550004&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>SI-45500-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895-2MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3459424&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">带盖玻璃瓶（250 ml）&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3459424&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>34594-24&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0650816&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">硬质管路&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0650816&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>06508-16&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8889-500ML</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6024</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>龙沙公司</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550504&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">雄性鲁尔接头&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550504&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>EW-45505-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131, 1X 培养基</td><td>Cellgro</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0636590&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">带凸缘聚丙烯接头&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0636590&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>06365-90&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>O型圈</td><td>N/A</td><td>AS568A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0759620&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">脉冲阻尼器&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0759620&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>07596-20&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0752440&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">泵驱动装置（Masterflex L/S 变速经济型驱动器）&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0752440&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>7524-40&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0751860&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">泵头（Masterflex 易装泵头）&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0751860&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>07518-60&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4850000&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">滑块&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4850000&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>48500-00&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=9640016&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">软管&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=9640016&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>96400-16&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0291512&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">注射器滤器&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0291512&amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank>02915-12&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Orange 核酸染料</td><td>英杰公司</td><td>S-11368</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>龙沙公司</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液</td><td>龙沙公司</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

本方法的总体目标是描述一种技术，用于使贴壁细胞经受层流条件，并评估其对可精确量化的流体剪切应力的响应1。
我们的流室设计和流路系统（图1）包含一个透明观察区域，可在流动开始前（图11A、B）、流动过程中不同时间点（图11C）以及流动结束后（图11D），用于检测细胞黏附并成像细胞形态。这些实验以人脐带血来源的内皮祖细胞（EPCs）和猪源性EPCs2,3为例进行说明。
该方法也适用于其他贴壁细胞类型，例如平滑肌细胞（SMCs）或成纤维细胞。
腔室及管路的所有部件均可通过蒸汽高压灭菌法轻松实现灭菌。与其他腔室（例如微流控腔室）相比，本装置可在流动实验结束后以无菌条件回收大量细胞（&gt;100万个，具体数量取决于细胞大小），用于后续细胞培养或其他实验，如DNA或RNA提取、免疫组织化学（图11E）或扫描电子显微镜观察5。剪切应力可通过调节灌注液流速、流体黏度或通道高度与宽度进行调整。后者可在确保一维流动的前提下，减少所需流体体积或细胞数量。由于腔室高度不依赖垫圈的使用，因此无需在每次实验之间测量腔室高度，从而显著提高了多次实验的操作便捷性。此外，该管路设计还可方便地收集灌注液样本，用于分析和（或）定量检测细胞在流体剪切应力作用下分泌的代谢物，例如一氧化氮（图12）6。

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。

本方法的总体目标是描述一种技术，用于使贴壁细胞经受层流条件，并评估其对稳定...的反应

本视频文章的总体目标是介绍一种技术，用于使贴壁细胞经受层流条件，并评估其对可精确量化的流体剪切应力的响应。该技术首先在不安装流室的情况下组装流路系统。该流路系统包括储液瓶、脉动阻尼器、硬管、软管、四通旋塞阀和连接的鲁尔接头适配器，以及一个空气过滤器。下一步是在无菌条件下用所需的培养基（如细胞培养液）填充回路，然后启动泵以填充脉冲阻尼器并排出管路中的空气。随后，将载有细胞的载玻片插入流室底部板中。该操作程序的最后一步是将流室串联接入，完成整个流体回路的组装。最终可以通过荧光显微镜利用透明腔室观察经荧光标记的内皮祖细胞在流体剪切应力作用下的排列情况，以研究细胞的功能行为。为了模拟体内生理环境，通常需要对细胞施加流体剪切应力。我们设计了一种平行板流动腔室和连续流动回路系统，可使我们在流动条件下研究细胞，并通过透明腔室对其进行观察。该技术可作为医学和工程学领域有价值的科研工具。我们的流动腔室允许使用正置或倒置显微镜对流动状态下的细胞进行间歇性或实时观察。此外，Ach Nick 博士的设计使研究人员能够利用标准显微镜镜头，在透明或不透射线的表面成像细胞。此外，它可作为药理学研究中的重要工具，用于研究药物在流动条件下对细胞的作用。实验装置的可视化至关重要，因为仅通过阅读实验方案很难掌握其中多个步骤。我将逐步介绍如何搭建奥克·内克斯博士实验室中常用的流室和流动回路，以完成流动回路的组装。首先，将一段 36 英寸的硬管连接到脉冲阻尼器的一端，再将一段 18 英寸的软管连接到另一端。在 18 英寸软管的末端安装一个 1/8 英寸的公头接头。将雄性引诱器连接至一个1/8英寸的雌性引诱器适配器。将雌性引诱器连接至一段新的18英寸软管。在250毫升玻璃烧杯盖上钻三个孔。为了适配管路，将一段1.5英寸长的软管插入一个孔中，作为通气口。将硬管和软管的自由端穿过瓶盖上的另外两个孔，插入250毫升玻璃瓶中，该玻璃瓶将作为储液瓶。确保硬质导管到达储液罐底部。在整个管路系统搭建过程中保持无菌状态对本实验的成功至关重要。因此，所有部件必须经过灭菌处理，且操作过程中必须全程佩戴无菌手套。除了组装好的部件外，这些部件还必须经过灭菌处理。包括一个完整的流式室、三段两英寸长的软管（公头和母头各一个）、一个八分之一英寸鲁尔接头、四个半英寸平头螺丝、6 个 5/16 英寸、八个 30 秒钟每英寸轨道的平头螺丝、一对镊子、一张载玻片，以及两条通过蒸汽灭菌的毛巾。在 121 摄氏度下高压灭菌 60 分钟。将流动回路、流动室、四通旋塞阀逐个以及单向旋塞阀和所有已灭菌的部件放置于该无菌区域。佩戴无菌手套的同时，连接两个四通旋塞阀。将盖帽盖在开放的样品端口上。拆下连接流动回路两段软管的公母接头，插入连接好的旋塞阀。将插入储液瓶中的软管连接至一个30毫升注射器，并取出注射器活塞。向瓶中加入 125 毫升 EPC 培养基。将软管重新连接至旋塞阀。在通气孔中放置一个无菌注射器滤器。现在将流路系统转移至37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中。将硬质管路夹入指定用于此类Palmer管路的Masterflex滚轴泵头中。确保管路不与滚轴泵的安装轨道重叠。使用记号笔在泵头两侧的管路出口处做标记。确保所有通向样品口的旋塞均已关闭，并且沿流动回路的旋塞处于打开状态后，启动泵。验证流动方向是否正确。PERFUSE 八应从玻璃储液罐经硬管流入脉动阻尼器。进行流室组装时，使用无菌手套将一段两英寸的软管连接至一个八分之一英寸的雌性螺口接头，再将另一段两英寸的软管连接至一个八分之一英寸的雄性螺口接头。将带有雌性鲁尔接头的两英寸软管连接至进液口，将带有雄性鲁尔接头的两英寸软管连接至出液口。在这两个鲁尔接头上均连接四通旋塞阀。用无菌镊子将另一段两英寸软管连接至气泡捕集器侧端接口，并安装一个单向旋塞阀。从细胞培养容器中取出接种有细胞的载玻片，将其放入流室底板的凹槽内。确保载玻片的细胞面朝上，并使用注射器或移液器在载玻片上加入10毫升预热的EPC培养基。使培养基覆盖流室内的载玻片，但避免培养基溢出至底板的O型密封圈上。将流动室的上板放置在下板上，对准螺丝孔。保持两块板平行，以免在拧紧螺丝时将气泡引入腔室内。使用自动电池驱动螺丝刀，通过打开连接在进液侧气泡捕集口的单向止流阀，排除进液气泡捕集器中的空气。使用一个10毫升注射器，用EPC培养基轻柔地冲洗流入管路，然后关闭并盖上此旋塞。现在打开流出端四通旋塞，通过流室用EPC培养基轻柔冲洗，以排除腔室通道中的空气。再次使用10毫升注射器，将所有四通旋塞的连接口盖上并关闭。将流室转移至带有组装好流路系统的加湿培养箱中。暂停流路系统泵，关闭流路系统。将旋塞转向流动方向，以防止泄漏。将流室连接至流路系统。连接完成后，打开流向方向的旋塞阀。重启流泵，并确保 PERFUSE eight 按正确方向流动。调节流速至所需的剪切应力。进行流式实验时，可将流室从管路中移除，以便通过明场或荧光显微镜观察细胞。操作时，需在旋塞至旋塞连接处断开流室与流路的连接。为收集灌流液，需采集八份样品用于分析。首先，暂停泵的运行，关闭靠近脉动阻尼器的旋塞阀。取下其保护帽，并将其倒置放置，以确保不被污染。将一个小注射器插入取样口。关闭朝向流室方向的旋塞阀，保持样品口和管路朝向脉冲阻尼器的方向打开。从管路中抽取所需量的样品，在移除注射器前，关闭朝向样品口的旋塞阀。将采集的八份样品存入标记好的小瓶中，并在负80摄氏度下冷冻保存。盖好样品端口，并在开始流动前确保所有旋塞阀均处于打开状态。采用该方法，可在15分钟内将人源血液内皮祖细胞接种至钛片表面，并在生理剪切力条件下实现黏附。如图所示，在15达因/平方厘米的流体剪切应力作用下，内皮祖细胞在接种后立即的铺展面积约为210平方微米，3小时后增至约657平方微米，经过48小时后进一步扩展至约1,152平方微米。这张光学显微镜图像展示了人源EPCs的随机排列方向。在以每平方厘米100达因的流体剪切力作用3小时后，静置6小时，细胞虽已铺展，但仍保持随机排列。在每平方厘米100达因的流体剪切应力持续作用48小时后，EPCs沿流动方向排列并定向整齐。此处，EPCs 用 CTO 标记，细胞核在流式处理后用 herx 染色。作为对比，本图像显示了在钛片上沿流动方向排列的猪 EPCs。在经受 48 小时流动和每平方厘米 15 达因的剪切应力暴露后，细胞边界用抗 pcam 染色剂染色，细胞核用 cytoxin 核酸染色剂染色。该方法还允许在预定的时间点获取 PERFUSE 八的样品，用于分析和/或定量分泌的细胞代谢物。此处展示的是猪 EPCs 在 48 小时灌流实验过程中亚硝酸盐的生成情况。在进行该操作时，必须始终保持无菌环境。此外，在开始持续流动之前，必须采取必要措施以减少流动室中气泡的数量，因为气泡可能会将细胞撕脱。我们还建议在灌注前检查流动室和管路中的每一个连接处，以防止实验过程中 PERFUSE 八发生泄漏。该腔室设计有内置的 O 型圈，可使顶板和底板完全贴合，无需使用真空泵即可实现密封防漏。该功能还可确保不同实验之间腔室高度恒定，并消除了对橡胶垫圈或调整的需要。我们的流动腔室采用标准化的显微镜载玻片，因此可提供大量细胞用于后续实验。例如，可以对流体作用后的细胞中的 RNA 和 DNA 进行分析，以评估蛋白质合成或基因表达情况。我们的电路设计可收集灌注的八个样本，用于分析和定量细胞代谢物（如亚硝酸盐），亚硝酸盐是一氧化氮的主要氧化代谢产物，由细胞在流体剪切应力作用下分泌。观看本视频后，您应能够充分理解如何组装我们的流动室及无菌流动回路，以对贴壁细胞施加流体剪切应力。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

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