平行板流动腔和评估内皮祖细胞层流剪应力下连续流电路

本视频文章的总体目标是介绍一种技术，用于使贴壁细胞经受层流条件，并评估其对可精确量化的流体剪切应力的响应。该技术首先在不安装流室的情况下组装流路系统。该流路系统包括储液瓶、脉动阻尼器、硬管、软管、四通旋塞阀和连接的鲁尔接头适配器，以及一个空气过滤器。

下一步是在无菌条件下用所需的培养基（如细胞培养液）填充回路，然后启动泵以填充脉冲阻尼器并排出管路中的空气。随后，将载有细胞的载玻片插入流室底部板中。该操作程序的最后一步是将流室串联接入，完成整个流体回路的组装。

最终可以通过荧光显微镜利用透明腔室观察经荧光标记的内皮祖细胞在流体剪切应力作用下的排列情况，以研究细胞的功能行为。为了模拟体内生理环境，通常需要对细胞施加流体剪切应力。我们设计了一种平行板流动腔室和连续流动回路系统，可使我们在流动条件下研究细胞，并通过透明腔室对其进行观察。

该技术可作为医学和工程学领域有价值的科研工具。我们的流动腔室允许使用正置或倒置显微镜对流动状态下的细胞进行间歇性或实时观察。此外，Ach Nick 博士的设计使研究人员能够利用标准显微镜镜头，在透明或不透射线的表面成像细胞。

此外，它可作为药理学研究中的重要工具，用于研究药物在流动条件下对细胞的作用。实验装置的可视化至关重要，因为仅通过阅读实验方案很难掌握其中多个步骤。我将逐步介绍如何搭建奥克·内克斯博士实验室中常用的流室和流动回路，以完成流动回路的组装。

首先，将一段 36 英寸的硬管连接到脉冲阻尼器的一端，再将一段 18 英寸的软管连接到另一端。在 18 英寸软管的末端安装一个 1/8 英寸的公头接头。

将雄性引诱器连接至一个1/8英寸的雌性引诱器适配器。将雌性引诱器连接至一段新的18英寸软管。在250毫升玻璃烧杯盖上钻三个孔。

为了适配管路，将一段1.5英寸长的软管插入一个孔中，作为通气口。将硬管和软管的自由端穿过瓶盖上的另外两个孔，插入250毫升玻璃瓶中，该玻璃瓶将作为储液瓶。

确保硬质导管到达储液罐底部。在整个管路系统搭建过程中保持无菌状态对本实验的成功至关重要。因此，所有部件必须经过灭菌处理，且操作过程中必须全程佩戴无菌手套。

除了组装好的部件外，这些部件还必须经过灭菌处理。包括一个完整的流式室、三段两英寸长的软管（公头和母头各一个）、一个八分之一英寸鲁尔接头、四个半英寸平头螺丝、6 个 5/16 英寸、八个 30 秒钟每英寸轨道的平头螺丝、一对镊子、一张载玻片，以及两条通过蒸汽灭菌的毛巾。

在 121 摄氏度下高压灭菌 60 分钟。将流动回路、流动室、四通旋塞阀逐个以及单向旋塞阀和所有已灭菌的部件放置于该无菌区域。佩戴无菌手套的同时，连接两个四通旋塞阀。

将盖帽盖在开放的样品端口上。拆下连接流动回路两段软管的公母接头，插入连接好的旋塞阀。将插入储液瓶中的软管连接至一个30毫升注射器，并取出注射器活塞。

向瓶中加入 125 毫升 EPC 培养基。将软管重新连接至旋塞阀。在通气孔中放置一个无菌注射器滤器。

现在将流路系统转移至37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中。将硬质管路夹入指定用于此类Palmer管路的Masterflex滚轴泵头中。确保管路不与滚轴泵的安装轨道重叠。

使用记号笔在泵头两侧的管路出口处做标记。确保所有通向样品口的旋塞均已关闭，并且沿流动回路的旋塞处于打开状态后，启动泵。验证流动方向是否正确。

PERFUSE 八应从玻璃储液罐经硬管流入脉动阻尼器。进行流室组装时，使用无菌手套将一段两英寸的软管连接至一个八分之一英寸的雌性螺口接头，再将另一段两英寸的软管连接至一个八分之一英寸的雄性螺口接头。

将带有雌性鲁尔接头的两英寸软管连接至进液口，将带有雄性鲁尔接头的两英寸软管连接至出液口。在这两个鲁尔接头上均连接四通旋塞阀。用无菌镊子将另一段两英寸软管连接至气泡捕集器侧端接口，并安装一个单向旋塞阀。

从细胞培养容器中取出接种有细胞的载玻片，将其放入流室底板的凹槽内。确保载玻片的细胞面朝上，并使用注射器或移液器在载玻片上加入10毫升预热的EPC培养基。使培养基覆盖流室内的载玻片，但避免培养基溢出至底板的O型密封圈上。

将流动室的上板放置在下板上，对准螺丝孔。保持两块板平行，以免在拧紧螺丝时将气泡引入腔室内。使用自动电池驱动螺丝刀，通过打开连接在进液侧气泡捕集口的单向止流阀，排除进液气泡捕集器中的空气。

使用一个10毫升注射器，用EPC培养基轻柔地冲洗流入管路，然后关闭并盖上此旋塞。现在打开流出端四通旋塞，通过流室用EPC培养基轻柔冲洗，以排除腔室通道中的空气。再次使用10毫升注射器，将所有四通旋塞的连接口盖上并关闭。

将流室转移至带有组装好流路系统的加湿培养箱中。暂停流路系统泵，关闭流路系统。将旋塞转向流动方向，以防止泄漏。

将流室连接至流路系统。连接完成后，打开流向方向的旋塞阀。重启流泵，并确保 PERFUSE eight 按正确方向流动。调节流速至所需的剪切应力。

进行流式实验时，可将流室从管路中移除，以便通过明场或荧光显微镜观察细胞。操作时，需在旋塞至旋塞连接处断开流室与流路的连接。为收集灌流液，需采集八份样品用于分析。

首先，暂停泵的运行，关闭靠近脉动阻尼器的旋塞阀。取下其保护帽，并将其倒置放置，以确保不被污染。将一个小注射器插入取样口。

关闭朝向流室方向的旋塞阀，保持样品口和管路朝向脉冲阻尼器的方向打开。从管路中抽取所需量的样品，在移除注射器前，关闭朝向样品口的旋塞阀。将采集的八份样品存入标记好的小瓶中，并在负80摄氏度下冷冻保存。

盖好样品端口，并在开始流动前确保所有旋塞阀均处于打开状态。采用该方法，可在15分钟内将人源血液内皮祖细胞接种至钛片表面，并在生理剪切力条件下实现黏附。如图所示，在15达因/平方厘米的流体剪切应力作用下，内皮祖细胞在接种后立即的铺展面积约为210平方微米，3小时后增至约657平方微米，经过48小时后进一步扩展至约1,152平方微米。

这张光学显微镜图像展示了人源EPCs的随机排列方向。在以每平方厘米100达因的流体剪切力作用3小时后，静置6小时，细胞虽已铺展，但仍保持随机排列。在每平方厘米100达因的流体剪切应力持续作用48小时后，EPCs沿流动方向排列并定向整齐。

此处，EPCs 用 CTO 标记，细胞核在流式处理后用 herx 染色。作为对比，本图像显示了在钛片上沿流动方向排列的猪 EPCs。在经受 48 小时流动和每平方厘米 15 达因的剪切应力暴露后，细胞边界用抗 pcam 染色剂染色，细胞核用 cytoxin 核酸染色剂染色。

该方法还允许在预定的时间点获取 PERFUSE 八的样品，用于分析和/或定量分泌的细胞代谢物。此处展示的是猪 EPCs 在 48 小时灌流实验过程中亚硝酸盐的生成情况。在进行该操作时，必须始终保持无菌环境。

此外，在开始持续流动之前，必须采取必要措施以减少流动室中气泡的数量，因为气泡可能会将细胞撕脱。我们还建议在灌注前检查流动室和管路中的每一个连接处，以防止实验过程中 PERFUSE 八发生泄漏。该腔室设计有内置的 O 型圈，可使顶板和底板完全贴合，无需使用真空泵即可实现密封防漏。

该功能还可确保不同实验之间腔室高度恒定，并消除了对橡胶垫圈或调整的需要。我们的流动腔室采用标准化的显微镜载玻片，因此可提供大量细胞用于后续实验。

例如，可以对流体作用后的细胞中的 RNA 和 DNA 进行分析，以评估蛋白质合成或基因表达情况。我们的电路设计可收集灌注的八个样本，用于分析和定量细胞代谢物（如亚硝酸盐），亚硝酸盐是一氧化氮的主要氧化代谢产物，由细胞在流体剪切应力作用下分泌。观看本视频后，您应能够充分理解如何组装我们的流动室及无菌流动回路，以对贴壁细胞施加流体剪切应力。