Name: 旋转的人类细胞培养的细胞培养系统:作为一种模式的滋养细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解旋转细胞培养系统（RCCS）在三维细胞培养中的应用，以低剪切力环境培养人绒毛外滋养层细胞。该方法可增强分化标志物表达，更真实地模拟体内细胞动力学行为，为细胞生物学研究提供可靠的实验模型。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，资助号为 NIH/NICHD #HD051998（授予 C.A.M.）。

1. 胶原蛋白珠制备
<ol>
	<li>在接种 EVT 进行三维细胞培养之前，需要先准备 Cytodex-3 微载体珠：
	<ol>
		<li>称取实验所需适量的 Cytodex-3 珠。本方案适用于 10 mL RCCS 培养器，需使用 0.05 g 珠。对于 50 mL RCCS 培养器，应按比例调整。在 50 mL 可高压灭菌的锥形管中，将 250 mg Cytodex-3 珠与 12 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）混合。此量足以用于 5 个 RCCS 培养器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保锥形管中有足够的液体体积，因为高压灭菌过程会导致蒸发。将管盖松松盖上，于 110°C 高压灭菌 10 分钟。</li>
	<li>高压灭菌程序结束后取出锥形管，使 Cytodex-3 珠溶液冷却。</li>
	<li>待锥形管冷却至室温后，采用无菌操作技术，用 1× DPBS 将总体积补至 12.5 mL。</li>
	<li>盖紧管盖，将制备好的 Cytodex-3 珠于室温下储存。使用前应让珠充分溶胀并恢复至室温。上述制备方法可满足五个 10 mL RCCS 培养器的需要。我们观察到，Cytodex-3 珠在室温下长期储存会导致性能下降，因为胶原在约一个月后会变得不稳定。Cytodex-3 珠的粒径范围为 133–215 μm。</li>
</ol>
2. 培养基制备
<ol>
	<li> 准备1L适用于RCCS的优化GTSF-2培养基（改编自22），其成分为40% MEM alpha加补充剂和60% L-15 Leibovitz培养基（改编自22）。首先，配制总体积为400mL的MEM alpha培养基，并添加以下补充成分： 
	21.2 mM 碳酸氢钠 
	0.06% 蛋白胨 
	0.7 mM 果糖 
	1.4 mM 半乳糖 
	5.6 mM 葡萄糖 
	1% HEPES 
	1% L-谷氨酰胺 
	0.5% ITS 
	10% 胎牛血清（FBS）</li>
	<li>配制ITS储存液时，将试剂溶解于5mL无菌酸化H2O中（通过加入冰醋酸约0.05mL制备），轻轻摇动使其溶解，随后加入45mL无菌水。</li>
	<li>称取足够配制600mL培养基的L-15 Leibovitz粉末，溶于细胞培养级H2O中。</li>
	<li>用L-15 Leibovitz培养基将细胞培养基总体积补至1L。过滤除菌后，避光保存于4°C。每次使用时，向每份培养基分装液中单独添加1%青霉素-链霉素。</li>
	<li>除GTSF-2培养基外，多种其他培养基配方已在RCCS中成功测试。各实验室需根据所进行实验的具体情况自行确定最适培养基。</li>
</ol>
3. 细胞与微珠孵育
<ol>
	<li>按照标准细胞培养操作，将 EVT 细胞扩增至约 80% 融合度，进行胰酶消化并计数。</li>
	<li>将 1×106 个 EVT 细胞重悬于 4 mL 预温的培养基中。</li>
	<li>轻轻混匀已制备的 Cytodex-3 微珠。采用无菌操作技术，使用宽口、10 mL 血清移液管吸取 2.5 mL 已制备的微珠，并转移至新的 15 mL 圆锥管中。注意：由于微珠可能黏附在移液管上，可能会有少量损失。</li>
	<li>让 Cytodex-3 微珠在管底自然沉降。沉降完成后，使用移液器小心吸除上层 DPBS，注意不要扰动底部的 Cytodex-3 微珠。</li>
	<li>将 1×106 个已制备的 EVT 细胞与培养基混合后加入含有 Cytodex-3 微珠的管中。</li>
	<li>将细胞-微珠混合物在室温下孵育 30 分钟，期间定期轻柔混匀；随后在 37°C、5% CO2 条件下继续孵育 30 分钟，期间仍定期轻柔混匀。</li>
</ol>
4. 装载 RWV
<ol>
	<li>在超净工作台中，从包装中取出一个10 mL的RCCS，并将其放入无菌的6孔培养板中以保持稳定。有关RCCS的标注示意图，请参见图1。</li>
	<li>从端口取下大塞子。</li>
	<li>用预热的培养基将正在孵育的细胞-微珠混合物总体积补至10 mL。</li>
	<li>通过大端口将细胞/微珠混合物加载到RCCS中。加载时，应将RCCS倾斜至45°角（大端口朝上），以有助于去除可能存在的气泡。通过缓慢而稳定地填充，防止容器内产生正压。</li>
	<li>将塞子重新插入大端口。</li>
	<li>从3 mL注射器中取出活塞，并将空注射器安装到小端口上。向每个注射器中加入1–3 mL培养基。缓慢打开两个阀门，然后轻柔地将活塞重新装回注射器。从其中一个注射器缓慢推注培养基，直至内腔中所有气泡被排出。</li>
	<li>拿起RCCS，边轻轻敲击其侧面边在面前旋转，检查是否存在气泡。若有任何气泡，必须将其完全清除，因为气泡会干扰细胞聚集体的形成并引入剪切力。清除方法：旋转RCCS，使气泡移动至小端口下方，然后轻压对侧注射器活塞，将气泡推入端口并排出腔室。</li>
	<li>关闭一侧端口。轻压另一侧注射器活塞，向容器内施加少量正压，以防止气泡形成，随后关闭第二个阀门。</li>
	<li>将RCCS装入旋转器。在37°C的CO2培养箱中以19 rpm的转速开始旋转。</li>
</ol>
5. 更换培养基
<ol>
	<li>前3天每隔一天更换一次培养基，之后每天更换一次。</li>
	<li>关闭转子并取下RCCS。拉动活塞产生一定负压，将每个小端口上的注射器取下，并将RCCS倾斜放置，使微珠沉降到与大端口相对的一侧。</li>
	<li>待微珠完全沉降后，打开其中一个小型阀门，使培养基从RCCS流出并进入废液容器。以这种方式移除约2/3的培养基。注意不要扰动微珠，也不要丢弃任何类器官聚集体。</li>
	<li>关闭小型阀门，打开大端口，通过大端口将新鲜培养基重新加入RCCS中。随后将大端口的塞子重新塞好。</li>
	<li>重复步骤4.6至4.9。</li>
	<li>随着类器官聚集体体积增大，需逐步提高旋转速度，以始终使其保持悬浮状态，理想情况下在最佳转速下形成微小的循环流动模式。通常在聚集体开始明显生长后，每次换液时将转速提高0.3–0.7 rpm。</li>
</ol>
6. 收集扩增的细胞
<ol>
	<li>从转子上取下RCCS。从每个小端口取下注射器，并将RCCS倾斜放置，使微珠在大端口的对侧沉降。</li>
	<li>待微珠完全沉降后，打开其中一个小型阀门，使培养基从RCCS中流出并进入废液容器。以此方式移除三分之一的培养基。</li>
	<li>关闭小型阀门，打开大端口。轻轻旋转容器，使聚集体重新分散到溶液中。将液体混合物转移至无菌的50 ml锥形管中。让收集的聚集体在锥形管中沉降，然后用上清液彻底冲洗培养容器，以最大限度回收聚集体。聚集体可立即用于后续分析，如流式细胞术、侵袭实验、免疫荧光等。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在RCCS中使用Cytodex-3微珠培养的EVT样细胞（SGHPL-4滋养层细胞系）示例见图2。该EVT样细胞系显示出从主要细胞簇延伸而出的突起，并与邻近细胞簇发生连接。许多微珠表面已完全被增殖的细胞所覆盖。当这些在RCCS中形成的EVT样三维细胞从旋转细胞培养系统中取出并接种于细胞外基质上后，表现出强烈的侵袭和/或迁移能力（图3）。RT-PCR数据证实，与传统二维单层细胞培养相比，三维细胞聚集体中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达显著上调（图4）。有趣的是，在RCCS中一些与侵袭无关的基因也出现上调表达（表1），这可能有助于阐明侵袭性滋养层细胞与免疫系统相互作用等相关生物学过程。
<img alt="离心机转子示意图，显示端口、鲁尔锁扣和用于分离过程的气体交换膜。" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 旋转细胞培养系统（RCCS）的示意图。
<img alt="显示细胞器的显微镜图像；细胞结构分析；箭头指示特征。" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在RCCS中培养5天后代表性聚集体的相差显微照片。箭头指示侵入的细胞，* 表示Cytodex-3微载体珠。
<img alt="显微镜分析，细胞结构比较，箭头标示纤维区域，A和B图。" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 在RCCS中培养的细胞聚集体被包埋于纤维蛋白凝胶中。细胞侵袭纤维蛋白凝胶的现象最早在包埋后（A）24小时即可观察到，并在（B）48小时持续进展。箭头指示侵袭的细胞，*表示Cytodex-3微载体珠（改编自参考文献7，经许可）。
<img alt="显示单层与3D细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白质分析结果（24-72小时）的Western blot" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 单层培养与RCCS扩增的SGHPL-4 EVT样细胞的明胶酶谱比较分析。RCCS培养的滋养层细胞分泌MMP-2和MMP-9的前体形式及活性形式（改编自参考文献7，经许可）。
<img alt="基因表达表格，测量倍数诱导，科学研究中各种基因的数据。" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 在RCCS中培养的SGHPL-4细胞的微阵列结果摘要（改编自参考文献7，已获许可）。
<ol class="lalpha">
	<li>三维聚集体中的折叠诱导倍数计算方法如下：归一化的三维基因值 / 归一化的单层基因值。</li>
	<li>表示在单层培养中低于检测限的基因。</li>
</ol>

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	 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks">http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks</a> (2005).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

本文介绍的培养技术可为研究人员提供具有高度侵袭性的类似EVT的细胞。目前人们已认识到，由于抑制了细胞对三维环境（顶端、基底和侧向细胞表面）中化学和分子信号的响应，单层培养中会出现细胞分化丧失的现象。10,13该技术反映了所观察到的特征 在子宫内 在侵袭性EVT细胞上。由于该操作模拟了传统的单层组织培养的时间动力学，但可提供差异表达的细胞，因此可采用比较分析实验。细胞簇可在任意时间收获并用于实验，既可直接作为细胞簇使用，也可通过胶原降解获得单细胞悬液。Cytodex-3微载体珠可替换为其他涂有不同细胞外基质（ECMs）的支架或微载体珠，以更好地满足不同实验室的特定研究需求。此外，还有多种其他三维培养平台可能更适用于特定细胞类型的培养条件，例如细胞培养插入物和旋转烧瓶。10,23需要注意的是，在这些条件下，培养动力学可能有所不同，应针对具体情况分别确定。可通过定期从RCCS中取出样品，检测特异性分化标志物的表达、增殖情况及细胞活力，以简便地评估培养动力学。15通过随时间推移与传统单层组织培养技术进行比较，可确定最佳的增殖与分化动力学。以 SGHPL-4 细胞...

<table><tbody><tr><td>细胞微载体珠（Cytodex microcarrier beads）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>旋转式细胞培养系统（Rotating Cell Culture System, RCCS）</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-D</td><td>包含转子底座、电源、4个一次性RCCS单元</td></tr><tr><td>RCCS一次性单元（RCCS Disposable Units）</td><td>Synthecon</td><td>联系Synthecon</td><td></td></tr><tr><td>3 ml鲁尔锁式针筒（3ml Luer-Lock tip syringe）</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>10 ml宽口移液管（10ml wide-tip serological pipette）</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>MEM α培养基（MEM Alpha）</td><td>Invitrogen</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15培养基粉末（Leibovitz’s L-15 medium, powder）</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素水（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, Endotoxin free）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7795</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨（Peptone）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-100</td><td></td></tr><tr><td>果糖（Fructose）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3510-100</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖（Galactose）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388-100</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（Glucose）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲剂（HEPES）</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（L-Glutamine）</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠添加剂（Insulin-Transferrin-Sodium Selenite, ITS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗（Penicillin-Streptomycin）</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

用于人类细胞培养的旋转细胞培养系统：以人类滋养层细胞为模型

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

人类滋养层研究领域有助于理解胎盘形成过程中所建立的复杂环境。由于这些研究的特性，人类 体内 实验无法进行时，可结合使用原代培养、外植体培养和滋养层细胞系1 支持我们对子宫壁侵袭过程的理解2 子宫螺旋动脉的重塑3,4 由滋养层外滋养细胞（EVTs）介导，这对于成功建立妊娠至关重要。尽管从这些模型中已获得大量知识，但人们普遍认为 体外 使用EVT样细胞系的细胞培养模型与其原始细胞相比表现出改变的细胞特性 体内 对应物5,6在旋转细胞培养系统（RCCS）中培养的细胞表现出更接近分化中滋养层样细胞系的形态学、表型和功能特性 在子宫内 EVTs中，介导侵袭（如基质金属蛋白酶（MMPs））和滋养层细胞分化的基因表达上调7,8,9圣乔治医院胎盘细胞系-4（SGHPL-4）（由Guy Whitley博士和Judith Cartwright博士惠赠）是一种类似滋养层外细胞（EVT）的细胞系，用于在RCCS中进行测试。
RCCS 培养容器的设计基于器官和组织在三维（3-D）环境中发挥功能的原理。由于容器内具有动态的培养条件，包括生理相关的剪切力，细胞在三维环境中生长时会依据天然的细胞亲和性形成聚集体，并分化为类器官组织样结构。

关键词：RCCS 培养容器，三维培养，剪切力，细胞聚集体，类器官组织样结构10,11,12 维持流体轨道可提供低剪切力、低湍流的环境，类似于所发现的条件 在体内 通过调节RCCS的旋转速度以抵消培养细胞的沉降，确保细胞持续处于自由下落状态。气体交换通过生物反应器后部的透性疏水膜进行。与其亲本组织相似 在体, 在多孔微载体珠表面培养的细胞能够响应三维空间中的化学和分子梯度（即在其顶面、底面和侧面），因为细胞生长于这种支持结构的表面。当细胞在塑料等不可渗透的表面上以二维单层形式生长时，其底面的重要信号交流受到限制。因此，培养环境施加的空间限制深刻影响细胞感知和解码周围微环境信号的方式，提示三维环境在细胞行为调控中具有重要作用13.
我们已利用RCCS构建了多种人体上皮组织的具有生物学意义的三维模型7,14,15,16。事实上，许多先前的研究已证明，在RCCS中培养的细胞能够呈现出其他模型无法实现的生理相关表型10,17-21。总之，在RCCS中进行培养是一种简便、可重复、高通量的技术平台，可获得大量已分化的细胞，适用于多种实验操作。 
在以下实验方案中，我们以EVTs为例，详细描述了在RCCS中进行贴壁细胞三维培养所需的操作步骤。

传统的二维细胞培养技术通常会导致分化标志物、细胞因子和生长因子等特性的改变。在旋转细胞培养系统（RCCS）中进行三维细胞培养可重建许多此类因子的表达，本文以绒毛外滋养层细胞系为例展示了这一效果。

人类滋养层研究领域有助于理解胎盘形成过程中所建立的复杂环境。由于这些……

该实验步骤采用三维细胞培养系统来模拟体内细胞动力学。首先，将细胞与包被了胶原蛋白ENC的微珠共同孵育。随后，将细胞和微珠加载至旋转式细胞培养系统中，在低剪切力、低湍流的环境中培养并扩增三维细胞聚集体。最后，收获细胞用于后续应用，以与在典型单层培养条件下生长的细胞的基因表达和细胞分化进行比较。所获得的三维培养物表现出的细胞动力学和行为特征与体内情况非常相似。我们已利用RCCS构建了多种人体上皮组织的具有生物学意义的三维模型。杰西卡·Warner博士（Dr. Jessica Warner）曾是我合作者悉尼·Morris博士（Dr. Sydney Morris）实验室的研究生，她接下来将使用EVT细胞演示该实验步骤：在50毫升锥形管中，将250毫克微载体Cytodex 3珠粒与12毫升DPBS混合，进行高压灭菌，然后让制备好的珠粒溶胀并冷却至室温。然后在无菌条件下，将总体积调至12.5毫升。使用DPBS收集一个汇合度为80%的绒毛外滋养层细胞培养物。通过胰蛋白酶消化，轻轻混匀已制备的CytoDex 3珠，并使用宽口尖端的10毫升血清移液管将2.5毫升转移至一个15毫升锥形管中。待Cytodex 3珠沉降到管底后，用移液器小心吸去上层DPBS，避免扰动Cytodex 3珠。将EVT细胞与Cytodex 3珠混合。室温孵育30分钟，期间定期混匀，随后在细胞培养孵箱中孵育30分钟，期间偶尔混匀。将一个10毫升的RCCS放入无菌的六孔培养板中，移除大塞子。加入预热的GTSF2培养基，使细胞微珠混合物总体积达到10毫升，通过大孔将混合物加载至RCCS中。更换大端口的塞子并关闭小端口。接着，将两个三毫升注射器分别连接到两个小端口上。向每个注射器中加入培养基。缓慢打开两个阀门并更换注射器活塞。轻轻从一个注射器中加入培养基，直至内腔中的所有气泡被完全排出。拿起RCCS，一边轻轻敲击侧面一边旋转，检查是否存在气泡。通过旋转RCCS，使残留的气泡移动至小孔端下方。然后轻轻按压对侧的注射器，将气泡压入小孔并排出培养腔。继续关闭一侧端口，同时轻轻按压另一侧注射器活塞，向容器内施加少量正压，并在保持压力的同时关闭第二个阀门。最后将RCCS装载到转子上，在细胞培养孵育箱中以19 RPM的转速开始旋转，以获得最佳培养条件。前3天每隔一天更换一次培养基，之后每天更换一次。首先关闭转子并取下RCCS。拉动活塞以产生一定吸力。将注射器从小端口上取下，将RCCS倾斜放置，使微珠在远离大端口的一侧沉降。现在，打开其中一个小型阀门，将RCCS中三分之二的培养基释放到废液容器中，注意不要扰动微载体珠。关闭小型阀门，然后打开大型端口。向RCCS中添加培养基，重新塞上塞子，排出所有气泡（方法如前所述），并将培养装置置于培养箱内的旋转器上。一旦聚集体开始生长，明显提高转速以确保细胞保持悬浮状态。收集细胞时，将RCCS从转子上取下。丢弃每个小端口的注射器，将RCCS倾斜放置，使小珠移向远离大端口的一侧。待小珠全部沉降后，打开其中一个小型阀门，将三分之一的培养基排入废液容器中。关闭小型阀门，然后打开大端口。 轻轻混匀容器，使聚集体重新分散到溶液中，然后将细胞转移至无菌的50毫升锥形管中。待收集的聚集体在锥形管中沉降后，用上清液再次彻底冲洗培养容器，以最大限度回收聚集体。使用宽口移液器吸头立即分装聚集体，用于后续功能实验。S-G-H-P-L 四种滋养层细胞系是类似于绒毛外滋养层细胞的一个示例。在 RCCS 中的细胞 X 三号上生长的典型聚集体中，许多微珠被增殖的细胞完全覆盖。注意从主簇延伸出去并连接到邻近簇的突起结构。从RCCS中取出并接种于细胞外基质上后，类似EVT的3D培养细胞表现出强烈的侵袭和/或迁移能力。事实上，R-T-P-C-R数据证实，与传统细胞培养单层相比，3D细胞团簇中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达水平升高。有趣的是，在RCCS中，一些与侵袭无关的基因表达也出现上调。观看本视频后，您应能够清楚地了解如何使用RCCS与您的细胞系、原代细胞甚至干细胞共同培养，以获得更接近体内细胞动力学的三维细胞培养模型。

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