Name: 在犁鼻器官的切片准备工作表示一个基因编码的钙传感器成像神经元的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学习在犁鼻器官（VNO）神经元中利用表达G-CaMP2的转基因小鼠进行信息素反应的钙成像技术。该方法可保留细胞完整形态，用于分析神经元对不同信息素刺激的反应模式，为哺乳动物化学通讯研究提供重要框架。

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感谢安德里亚·莫兰（Andrea Moran）以及霍华德·休斯医学研究所斯托尔斯研究所实验动物服务设施（Lab Animal Service Facility, LASF）成员在动物饲养和技术服务方面提供的出色支持。本研究由斯托尔斯研究所和美国国立卫生研究院（NIH，项目编号NIDCD 008003）为CRY提供的经费资助。本内容完全由作者负责，不代表耳聋及其他沟通障碍国家研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。斯托尔斯研究所、CRY和LM已就tetO-G-CaMP2小鼠向美国专利商标局提交专利申请。

1. 溶液配制
<ol>
 <li>根据下表配制 10X R1、10X R2 和 10X R3 溶液。 
 R1 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化学物质</td>
 <td>分子量 (g/mol)</td>
 <td>毫摩尔浓度 (1X, mM)</td>
 <td>10X 储液 (g/L)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>58.44</td>
 <td>125</td>
 <td>73.05</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>74.55</td>
 <td>2.5</td>
 <td>1.86</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>1 M 储液</td>
 <td>1</td>
 <td>10 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2·2H2O</td>
 <td>147.02</td>
 <td>2</td>
 <td>2.94</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4·H2O</td>
 <td>137.99</td>
 <td>1.25</td>
 <td>1.72</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 R2 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化学物质</td>
 <td>分子量 (g/mol)</td>
 <td>毫摩尔浓度 (1X, mM)</td>
 <td>10X 储液 (g/L)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>84.01</td>
 <td>25</td>
 <td>21</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 R3 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化学物质</td>
 <td>分子量 (g/mol)</td>
 <td>毫摩尔浓度 (1X, mM)</td>
 <td>10X 储液 (g/L)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>58.44</td>
 <td>125</td>
 <td>73.05</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>74.55</td>
 <td>2.5</td>
 <td>1.86</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>1 M 储液</td>
 <td>2</td>
 <td>20 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2·2H2O</td>
 <td>147.02</td>
 <td>2</td>
 <td>2.94</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>1 M 储液</td>
 <td>5</td>
 <td>50 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>在实验当天，将 100 ml 10X R1 与 100 ml 10X R2 混合于双蒸水（DDW）中，配制成 1 升小鼠人工脑脊液（mACSF），并加入 1.8 g 葡萄糖（终浓度 10 mM）。该配制方法可防止在高 pH 条件下形成碳酸钙沉淀。mACSF 的渗透压约为 310–315 mOsm/L。必要时可用葡萄糖或水调节渗透压。使用 Carboxygen 气体（95% 氧气和 5% 二氧化碳）对溶液充气至少 30 分钟，然后将溶液 pH 调整至 7.2–7.4。</li>
 <li>在实验当天，将 100 ml 10X R2 与 100 ml 10X R3 混合于双蒸水（DDW）中，配制成 1 升任氏液（Ringer's solution），并加入 1.8 g 葡萄糖（10 mM）。任氏液的渗透压和 pH 应与 mACSF 相近。使用 Carboxygen 气体对溶液进行充气。</li>
 <li>在 mACSF 或任氏液中配制 4% 低熔点琼脂糖（LMA）。将熔化的琼脂糖分装至微量离心管中，4°C 保存备用。LMA 由纯化的多糖组成，在 37°C 下保持液态，并在低于 25°C 时迅速凝固。这些特性使其非常适合用于犁鼻器（VNO）包埋及活体组织生理实验。其他不纯材料（如普通琼脂）不适用于活体组织实验，因其未明确成分可能干扰神经元反应。</li>
 <li>在任氏液中配制信息素刺激物。对于小鼠尿液，1:100 的稀释比例可产生显著的反应。</li>
</ol>
2. VNO 切片的制备
<ol>
 <li>在处死动物前，将两管LMA置于加热块上，设置温度至&gt;60°C以融化琼脂糖。待凝胶完全液化后，将试管转移至37°C加热块中。</li>
 <li>对G-CaMP2小鼠实施CO2安乐死后进行断头操作。用剪刀剪开下颌骨以移除下颌。剥离有皱褶的上腭组织，暴露鼻腔（图1A）。将手术刀插入两颗前门齿之间，分离下颌骨，小心移除下颌骨以暴露犁鼻器（VNO）。此时可通过夹住尾骨将整个VNO从鼻腔中抬起（图1B）。立即将VNO转移至冰冷的含氧mACSF溶液中。</li>
 <li>在解剖显微镜下，使用#5镊子的尖端沿鼻中隔骨壁轻轻滑动，分离两侧VNO（图1C）。剥离包裹VNO组织的犁骨，从骨腔中轻柔地抬起整个VNO组织。此步骤需格外小心，避免损伤神经上皮。组织表面残留的微小骨碎片必须彻底清除后再进行包埋；若残留碎片可能在切片时被刀片挂住，导致组织从琼脂糖块中脱出。</li>
 <li>用镊子夹住VNO组织的后端，轻轻将其浸入融化的琼脂糖中（图1D）。迅速将试管置于冰上冷却，使琼脂糖凝固。包埋与冷却过程应不超过2分钟。</li>
 <li>使用VF300组织切片机（Precisionary Instruments, Greenville, NC）进行切片。将含有VNO的琼脂糖块修整成合适形状，并将其粘附于组织固定座上（图1E和F）。将组织固定座插入金属圆筒中，并在剩余空间内填充额外的LMA。待LMA在冰上凝固后，立即开始切片。向切片室持续供给冰冷的含氧mACSF，并以每片180–200 μm的厚度开始切割。调节前进速度和振动频率，确保切片过程中组织不受压，且VNO不会从琼脂糖块中脱落。收集切好的脑片并转移至mACSF孵育室中（图2A）。在室温下，含氧mACSF中的脑片可保持活性6–8小时。图2B和C分别为G-CaMP2 VNO脑片的微分干涉差（DIC）图像和双光子图像。</li>
</ol>
3. 成像室设置
<ol>
 <li>将VNO切片置于灌流室（Siskiyou，Grants Pass，OR）中央，并用切片固定锚（Warner Instruments，Hamden，CT）压住切片（图3A）。固定锚的螺纹应仅压在切片的LMA部分，不得接触VNO组织。通过入口以约100 μl/sec的速度向灌流室输送含氧mACSF，液体经出口处的吸引针排出，从而实现新鲜mACSF的持续流动（图3A和B）。</li>
 <li>用30 ml注射器抽取任氏液，并将其固定在注射泵（New Era Pump Systems，Farmingdale，NY）上。将泵速设定为300–600 μl/min，以实现任氏液对切片的持续灌流（图3C）。</li>
 <li>将任氏液的出口连接至高效液相色谱进样环（HPLC injection loop，Chromtech，Apple Valley，MN）（图3D）。可根据需要选择不同体积的进样环，以精确控制递送液体的体积。本实验中使用20 μl的进样环。进样环控制装置具有两条流路（图3E）。在“加载”（load）位置时，可通过Hamilton精密注射器将样品注入进样环，过量样品经废液出口排出。同时，注射泵推动的任氏液绕过进样环，直接流向与灌流尖端相连的出口（图3A和E）。在“进样”（injection）位置时，泵液流经进样环，将样品推入出口（图3E）。在成像实验开始前，应排除所有气泡，以确保灌流液体流动平稳。也可使用其他商用或自制的进样系统进行刺激递送。</li>
 <li>在5X或10X物镜下调节灌流尖端，使其距离VNO切片约1 mm。</li>
 <li>当搭建新的灌流系统时，建议使用荧光染料测量样品递送的延迟时间和持续时间。将0.1%的罗丹明6G染料注入进样环，并在图像采集开始后5秒切换阀门至进样位置（图3F）。荧光信号在10–30秒之间被检测到。荧光信号的平滑曲线也表明浸入式物镜下无明显湍流，且含氧mACSF对切片实现了充分灌流。</li>
</ol>
4. 时间序列成像
<ol>
 <li>我们使用蔡司AxioSkope FS2显微镜配合10X或20X浸水物镜进行延时成像。G-CaMP2信号采用标准GFP带通滤光片（450-490 nm）。通过CCD相机（Zeiss HRM）以1×1或2×2 binning模式采集落射荧光图像，具体模式根据G-CaMP2的表达水平而定。</li>
 <li>将采集速度设置为每秒1帧。调节光照强度，以最小化G-CaMP2信号的光漂白及对细胞的光损伤。每次实验通常采集60帧图像（约60-70秒）。在特定时间点（例如图3F中的5秒）将阀门切换至注射位置，以确保所有实验组之间的时间延迟一致。</li>
 <li>使用任氏液作为刺激物进行预实验。若在样品注入过程中引入运动伪影，需重新调整灌流装置。</li>
 <li>使用以任氏液按1:100稀释的小鼠尿液进行阳性对照实验。G-CaMP2对小鼠尿液反应的典型最大ΔF/F值约为20-40%。如有需要，可在实验结束时向组织施加含10 mM KCl的任氏液，以验证组织切片的活性。</li>
 <li>每次加载一种刺激物后，需用任氏液至少清洗Hamilton注射器三次。不同刺激物之间需用任氏液至少清洗样品环三次。这些步骤可防止不同样品间的交叉污染。</li>
 <li>在施加下一个刺激前，等待4-10分钟，使VSNs恢复。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
 <li>对从一个切片获取的所有图像进行图像配准。我们使用在 AxioVision（Carl Zeiss，North America）中自定义编写的 VBA 脚本自动化此过程。同一实验中的所有图像帧均通过弹性配准与一个共同选定的参考帧对齐（图 4A）。弹性配准，也称为非线性配准，是一类强调将目标图像以非刚性方式变换至参考图像的图像配准技术。此处我们采用 AxioVision 中提供的实现方法。 
 
 该参考帧从图像堆栈中任意选择。</li>
 <li>执行图像相减以识别响应细胞。我们使用 ImageJ v1.42 中自定义编写的宏（<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>，NIH，Bethesda，MD）自动化此过程。为每个堆栈生成最小投影图像。将最小投影图像从原始堆栈中减去后，响应细胞即显现出来（图 4B）。</li>
 <li>从相减后的堆栈中确定感兴趣区域（ROI），并使用 ImageJ 的 Multi-Measure 插件获取 ROI 坐标。处理一个实验中的所有堆栈，并将所有 ROI 坐标保存至一个 ROI 主列表中（图 4C）。</li>
 <li>利用 ROI 主列表，通过 ImageJ 中自定义编写的宏和 Multi-Measure 插件，从原始图像堆栈中测量细胞响应（图 4D）。在 Matlab（Mathworks Inc.，Natick，MA）中绘制响应曲线和热图。</li>
</ol>
6. 典型结果
使用从四只不同小鼠收集的尿液样本进行犁鼻器成像实验的示例如图5所示。组织切片对尿液刺激产生多样化的激活模式。共鉴定出约80个细胞对至少一种尿液刺激产生反应，其反应的ΔF/F值在热图中展示（图5A）。细胞1、2和3的反应轨迹在图5B中绘制，显示了尿液刺激引起的时间过程激活。细胞1对两种雌性尿液样本均有反应，但对雄性样本无反应；而细胞2则表现出相反的激活模式，仅对两种雄性样本有反应。细胞3则对个体雄性和雌性样本均产生激活。细胞1和2对尿液中性别特异性信号表现出特征性反应15。
<img alt="犁鼻器（VNO）解剖、解剖示意图、感觉分析设备设置。" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1 犁鼻器（VNO）解剖过程的示意图。A. 小鼠头部中VNO的解剖位置。一只G-CaMP2小鼠的头部已被解剖，并倒置放置，腭部软组织已被去除，以暴露VNO。插图显示同一图像的荧光照片，其中VNO的神经上皮呈亮绿色。B. 分离后的VNO侧视图，其包裹于犁骨内（上方），以及同一VNO的荧光图像（下方）。C. VNO的冠状面视图及解剖过程。一侧VNO从鼻中隔分离后，可移除犁骨以取出神经上皮。D. 将VNO包埋于LMA中。E. 将包埋好的组织块粘附至切片组织固定器上。组织固定器以每片180–200 μm的速度推进，将琼脂糖块从金属套筒中推出进行切片。切割刀片紧贴金属套筒放置。F. VF300组织切片系统的侧视图。B.V.，血管；N.E.，神经上皮。
<img alt="A. 用于成像的显微镜装置及其光学调整；B, C. 生物样品的显微图像。" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2 VNO 切片。A. VNO 切片在室温下保存于充氧的 mACSF 溶液中。B. VNO 切片的微分干涉差（DIC）图像。C. 来自 G-CaMP2 小鼠 VNO 的双光子图像。比例尺，50 μm。
<img alt="VNO灌流装置、注射泵和色谱方法示意图及数据结果图" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3 灌流系统装置示意图。A. 典型的灌流 chamber，带有进液口和出液口。VNO切片置于chamber中央，并用组织固定锚压住。组织固定锚的中部丝线已被移除，以避免对VNO组织施加压力。B. 将灌流chamber放置于显微镜载物台上，浸没式物镜下方。图中示出mACSF进液口、吸出出口和灌流尖端。C. 单通道注射泵通过灌流尖端持续输送Ringer's溶液。D. 采用HPLC进样环系统，便于刺激样品的加载与注入。E. 加载与注入位置下流体流向的示意图。Ringer's溶液以绿色表示，刺激样品以品红色表示。箭头指示流动方向。F. 灌流系统的延迟时间与洗脱时间测定。将罗丹明6G荧光染料加载至样品环中，并在第5秒时切换阀门至注入位置（以箭头指示）。在10–30秒之间检测到荧光信号变化，随后信号逐渐减弱。
<img alt="显微成像中的图像配准与感兴趣区域处理，结合刺激响应分析及数据集概览。" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4 图像处理流程。A. 对同一切片的所有图像帧均相对于一个参考帧进行图像配准。B. 将图像栈的原始帧减去其最小投影图像，响应细胞在相减后更加显著。C. 选取感兴趣区域（ROI），并将其坐标汇总生成主列表。D. 利用来自原始图像栈的 ROI 主列表对响应细胞进行测量。
<img alt="显示 ΔF/F 分析的热图和折线图；FVB、CBA、BL6 神经活动数据比较。" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5 一项典型的G-CaMP2 VNO成像实验。A. 使用单只雄性和雌性小鼠尿液刺激后获得的ΔF/F反应热图。尿液样本来自单只雄性和雌性小鼠。X轴表示从切片中鉴定出的反应细胞，Y轴表示实验中使用的尿液样本。颜色条表示ΔF/F值。B. A图中标记的3个代表性细胞的反应时间进程。箭头表示刺激施加的时间。F-FVB，雌性FVB；F-CBA，雌性CBA；M-FVB，雄性FVB；M-BL6，雄性C57BL/6。
特异性试剂与仪器列表：
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>
 试剂名称</td>
 <td>
 公司</td>
 <td>
 目录号</td>
 <td>
 备注（可选）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>灌流室</td>
 <td>Siskiyou</td>
 <td>PC-H</td>
 <td>水平式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>切片固定装置</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>SHD-22CL</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>灌流口固定架</td>
 <td>ALA scientific, Inc.</td>
 <td>MPIOH-S</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>注射泵</td>
 <td>New Era Pump Systems, Inc.</td>
 <td>NE-300</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>低压注射阀</td>
 <td>Chromtech</td>
 <td>V-451</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEEK管路</td>
 <td>Chromtech</td>
 <td>1531</td>
 <td>1/16" OD, 0.25mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEEK样品环</td>
 <td>Chromtech</td>
 <td>1803</td>
 <td>20 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hamilton注射器</td>
 <td>Chromtech</td>
 <td>80630</td>
 <td>100 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirch%2C+MC+%22Pheromones%22">Pheromones</a>. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).</li>
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<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
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<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

自Dulac和Axel5发现以来，大多数犁鼻器受体（VRs）仍为孤儿受体。这些化学感受受体的信息素配体及其在介导动物行为中的作用尚不明确。迄今为止，仅有一对配体/受体——ESP1肽及其对应受体Vmn2r116（V2Rp5）——被鉴定出来，并被证明可传递特定的社会信息19,23。另一个受体V1rb2已被证实可响应2-庚酮，该物质推测在雌性小鼠尿液中富集24。然而，该配体所传递的具体信息仍不清楚。我们在此开发的方法能够表征犁鼻器（VNO）神经元对大量刺激物的反应，并分析其激活模式。利用该方法，我们发现细胞对雄性或雌性尿液表现出特异性反应，且可能存在专门用于识别性别特异性信息素线索的细胞15。这些细胞上表达的犁鼻器受体仍有待鉴定。本文所述的成像方法不仅可用于筛选尿液中存在的信息素配体，还有助于鉴定响应信息素线索的特异性受体。
G-CaMP 钙离子传感器家族已被应用于多种动物系统，其信号已被证明与钙瞬变具有良好的相关性25-28。使用基因编码的传感器可灵敏地读取神经元反应，并能够...

在表达基因编码钙传感器的犁鼻器组织切片中成像神经元反应

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

犁鼻器（VNO）能够检测化学感应信号，这些信号携带有关同种个体社会状态、性状态和生殖状态的信息1,2。这些种内信号（即信息素）以及某些捕食者发出的信号3，均可高度特异性和敏感地激活犁鼻器感觉神经元（VSNs）4。至少有三个不同的G蛋白偶联受体家族——V1R、V2R和FPR5–14——在VNO神经元中表达，介导对化学感应线索的识别。要理解信息素信息如何被VNO编码，关键在于分析单个VSNs对各种刺激的反应特征，并鉴定介导这些反应的特异性受体。
VNO 的神经上皮被一对犁鼻骨包裹。VNO 呈半盲管状结构，一端开口（即犁鼻管）与鼻腔相通。VSNs 将其树突延伸至 VNO 的管腔部分，在此处信息素信号与树突末梢表达的受体接触。VSNs 的胞体形成假复层结构，其中 V1R 和 V2R 分别在顶端层和基底层表达6-8。已有多种技术被用于监测 VSNs 对感觉刺激的反应4,12,15-19。在这些技术中，急性脑片制备具有多项优势。首先，与离体分离的 VSNs 相比3,17，脑片制备能保持神经元原有的形态结构，使细胞的树突相对完整。其次，与完整的上皮组织或整体装片制备相比，在 VNO 的冠状切片中 VSNs 的胞体更易于接近，便于进行电生理研究和成像实验12,20。第三，该方法可与分子克隆技术结合，用于受体的鉴定。
感觉刺激会引发VSN中强烈的Ca2+内流，表明受体被激活4,21。因此，我们构建了在嗅觉感觉神经元（包括VSNs）中表达G-CaMP2的转基因小鼠15,22。该探针具有高灵敏度和遗传可操作性，极大地方便了Ca2+成像实验。该方法省去了以往研究中使用的染料加载步骤4,21。我们还采用了一种配体递送系统，可向VNO切片施加多种刺激。这两种技术的结合使我们能够同时监测大量神经元对多种刺激的反应。最后，我们建立了一套半自动化的分析流程，以辅助图像处理。

犁鼻器（VNO）可检测种内化学信号，这些信号传递社会和生殖信息。我们利用在犁鼻器组织中表达G-CaMP2的转基因小鼠进行了Ca2+成像实验。该方法使我们能够分析犁鼻神经元对大量信息素刺激所产生的复杂反应模式。

犁鼻器（VNO）可检测化学感觉信号，这些信号携带有关个体间社会、性及生殖状态的信息……

本实验的总体目标是演示如何制备活体组织切片，以对MRO鼻器官神经元中的信息素反应进行成像。首先，从表达遗传编码钙指示剂GCaMP2的小鼠中制备活体MRO鼻器官或VNO组织切片；接下来，在显微镜载物台上搭建灌流系统，用于维持组织切片、施加刺激并进行成像。反应。随后，使用不同的信息素刺激进行延时成像实验，并对成像结果进行数据分析。最终获得犁鼻器神经元对不同信息素刺激的反应模式。该技术相较于现有的方法（如钙离子D负载或离体细胞成像）的主要优势在于，我们能够保持细胞完整的形态结构，更好地维持脑片的生理状态，并获得更强的信号。该方法有助于解答关于线虫鼻感系统研究中的一些关键问题，例如鉴定配体及其受体，以及分析单个线虫鼻感神经元的反应特性。此外，该方法还可应用于其他系统的研究，如嗅觉系统、血清系统或脑部银屑病模型。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因难以获得良好的银屑病模型以及建立灌流系统而遇到困难。在开始此操作之前，应根据随附的手稿准备好所需的溶液，包括小鼠人工脑脊液林格氏溶液、4%低熔点琼脂糖以及信息素刺激物。然后将两管低熔点琼脂糖置于加热块上。 将温度设置为高于 60 摄氏度以熔化 aros。待凝胶液化后，将试管转移至 37 摄氏度的加热块中。以制备 VNO 切片。在处死表达GCaMP的两只小鼠并断头后，用剪刀剪断下颌骨以移除下颌。接着，剥离有皱褶的上腭组织，暴露鼻腔。然后，将手术刀片插入两颗门齿之间，分离上下颌骨。小心移除下颌骨以暴露犁鼻器。此时，抓住尾骨将整个犁鼻器从鼻腔中抬起。将犁鼻器转移至冰冷的含氧小鼠人工脑脊液（A CSF）溶液中。在解剖镜下立即用镊子尖端沿鼻中隔骨壁轻轻滑动，将两个 vomeronasal organ（VNO）分开。剥离包裹 VNO 组织的筛骨，然后从骨腔中轻轻提起整个 vomeronasal organ（VNO）组织。在此步骤中应格外小心，以避免损伤神经上皮。接下来，彻底清除组织表面残留的小块骨组织。在包埋前，确保清除残留的碎片。组织可能会被切割刀片钩住，从而将组织从琼脂糖块中拉出。随后，用镊子夹住犁鼻器组织的后端，轻轻将其浸入融化的琼脂糖中。迅速将离心管置于冰上冷却。为了固化琼脂糖，包埋和冷却过程应少于两分钟。然后修整含有犁鼻器（VNO）的琼脂糖块，并将其粘附到组织固定器上。随后，将组织固定器插入金属圆筒中，并用额外的低熔点琼脂糖填充剩余空间。当低熔点琼脂糖在冰上凝固后，立即向组织切片机的切片室供应冰冷且含氧的小鼠A型人工脑脊液，并将组织切成每片180至200微米厚度。随后收集切片并转移至孵育室。这些切片在室温下、含氧的小鼠A型人工脑脊液中可保持活性6至8小时。在此步骤中，首先将一个VNO切片置于灌流室中央，并用切片固定器压住切片。固定器的丝线应仅压住切片的低熔点琼脂糖部分，而不能接触VNO组织。然后通过进液口以大约每秒100 µL的速度向灌流室中灌注含氧的小鼠人工脑脊液（aCSF）。通过出口端口使用吸液针排出液体，以提供持续流动的新鲜小鼠脑脊液。接下来，用30毫升注射器抽取林格液，并将其固定在注射泵上。将泵速设置为每分钟300至600微升。为了在切片上持续灌注林格液，将林格液的出口连接至A-H-P-L-C进样环。进样环控制装置具有两条流路。在进样位置，使用汉密尔顿精密注射器将小鼠尿液样品注入样品环中。过量的样品通过废液出口从样品环中排出。注射泵注入的林格氏液绕过样品环，直接流向出口，该出口在注射位置与灌注尖端相连。泵溶液流经样品环，将信息素刺激物推入出口。成像实验之前，去除气泡以确保灌注液流动顺畅。然后在5倍或10倍物镜下调节灌注针尖，使其距离脑片约一毫米。为了测量样品延迟时间和持续时间，将0.1%罗丹明6G染料加入样品环中进行荧光染料负载。然后将阀门切换至进样位置。在图像采集开始5秒后，于10至30秒之间检测荧光信号。荧光信号的平滑曲线还表明，在浸入式物镜下产生的湍流极少，并且含氧的小鼠脑脊液能够充分灌注到脑片。在我们实验室中，使用蔡司Axio Scope FS2显微镜配备10倍或20倍水浸物镜进行时间推移成像，以检测GAMP2信号。采用标准的GFP带通滤光片，波长范围为450至490纳米。通过CCD相机获取epi荧光图像，具体采用1×1或2×2扫描模式取决于GCaMP2的表达水平。首先，将采集速度设置为每秒一帧。调节光照强度，以最小化GCaMP2信号的漂白以及对细胞的光损伤。然后在特定时间点将阀门切换至注射位置，以确保在一组实验中所有试验的时间延迟保持一致。接下来，使用林格氏液作为刺激物进行一次测试运行，如果在样品注射过程中引入了运动伪影，则需重新调整灌注装置。之后，用溶液将小鼠尿液稀释至1:100进行阳性对照实验，以防止不同样品之间的交叉污染。每加载一种刺激物后，用任氏液至少清洗Hamilton注射器三次。同样，在施加不同刺激物之前，用任氏液至少清洗样品环三次。下一次刺激前，需等待4至10分钟，使MRO鼻感觉神经元恢复，以便对从同一脑片获取的所有图像进行图像配准。在Avision中使用自定义编写的VBA脚本以实现该过程的自动化。在此情况下，同一实验中的所有图像帧均通过弹性配准与一个共同选定的参考帧对齐，从而进行图像相减以识别响应细胞。在ImageJ 1.42版本中使用自定义编写的宏来自动执行此过程。为每个图像序列生成最小投影图像，通过从原始图像序列中减去最小投影图像，目标细胞得以显现。接下来，从相减后的图像序列中确定感兴趣区域，并使用 ImageJ 的多测量插件获取该区域的坐标。随后，对一个实验中的所有图像序列进行处理，并将所有感兴趣区域的坐标保存至一个主列表（ROI 主列表）中。然后，利用该 ROI 主列表，结合自定义编写的宏和 ImageJ 的多测量插件，测量原始图像序列中细胞的响应信号。最后，在 MATLAB 中绘制响应曲线和热图。此处展示的是使用来自四只不同小鼠的尿液样本进行犁鼻器（VNO）成像实验的示例。约有80个细胞对至少一种尿液刺激产生反应，其反应的荧光变化率（ΔF/F）值在热图中显示。以下是细胞一、二和三的反应轨迹，显示了尿液刺激引起的时间过程激活情况：细胞一对两种雌性小鼠尿液样本均有反应，但对雄性小鼠尿液样本无反应。而细胞二表现出相反的激活模式，且对两种雄性样本均有反应。只有细胞三可被单独的雄性和雌性样本激活。一旦掌握操作技巧，切片可在30分钟内完成制备，且只要操作得当，脑片神经元可保持存活六至八小时。在尝试该方法时，重要的是要记住使用组织培养级试剂，并避免让组织固定试剂接触组织样本。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备活体银屑病组织，以利用表达G-CaMP的小鼠来成像维也纳神经元的热反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在犁鼻器官的切片准备工作表示一个基因编码的钙传感器成像神经元的反应

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

在小鼠中，检测信息素的能力主要由犁鼻器（VNO）介导。本文介绍了一种用于进行钙成像的VNO急性组织切片制备方法。这种生理学方法可实现对活体组织中神经元亚群和/或单个神经元的观测，且便于进行受体-配体的鉴定。...

小鼠副嗅觉系统急性组织切片中信息素感知的成像研究

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。...

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

该实验方案视频介绍了在小鼠犁鼻器（VNO）感觉神经元上建立全细胞膜片钳技术以进行电生理记录的方法。将带有荧光标记感觉神经元的冠状VNO脑片置于记录装置中，用记录电极对其中一个标记的神经元进行全细胞模式膜片钳，以记录其对化学刺激产生的电生理反应。...

建立用于犁鼻感觉神经元电生理记录的全细胞膜片钳技术

本文介绍了一种生理学方法，该方法利用全细胞膜片钳记录技术，在小鼠犁鼻器急性冠状组织切片中对特定感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。...

小鼠犁鼻器急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析

本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis...

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。...

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。...

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

我们介绍一种从腹侧暴露成年小鼠脑干的实验方案。通过使用梯度折射率透镜与微型显微镜，可利用钙成像技术在活体中检测下橄榄核神经元胞体的活动。...

in vivo 小鼠下橄榄核钙成像

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

学习在犁鼻器官（VNO）神经元中利用表达G-CaMP2的转基因小鼠进行信息素反应的钙成像技术。该方法可保留细胞完整形态，用于分析神经元对不同信息素刺激的反应模式，为哺乳动物化学通讯研究提供重要框架。

在表达基因编码钙传感器的犁鼻器组织切片中成像神经元反应

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