Name: 伸展的DNA短序列恒力轴向光镊 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解如何使用恒力轴向光镊技术操控短至100纳米的DNA分子，通过梯度力与散射力拉伸DNA并研究其力学特性。该方法可深入分析DNA弹性及蛋白质结合动力学。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢陈一凡博士在轴向光镊方面的帮助，并感谢他为本论文提供了部分拉伸数据。本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 PHY-0957293 和 FOCUS 资助项目 PHY-0114336 支持。

1. 镊子装置设置
<ol>
	<li>来自1064 nm激光的光束被分成两束正交偏振的光束。其中一束用于操控生物分子，另一束用于校准（见图2）。</li>
	<li>操控光束的强度由声光偏转器（AOD）控制，而每束光的位置和焦点则分别由光束转向镜和光学望远镜独立控制。</li>
	<li>随后，两束光通过另一个偏振分束器重新合并，并经由最后一组伸缩式光学元件进行调节，使其略微超过显微物镜后孔径的填充。校准光束采用50%的过填充可形成紧密的光镊，而操控光束则使用稍小的填充因子（约20%），从而获得较浅的焦点，转化为线性势场中更大的可操作区域。光束由一个PlanApo 60x/1.4油浸显微物镜紧密聚焦到样品池上。</li>
	<li>该光镊系统结合了一个自行搭建的明场显微镜，后者通过聚光镜将卤素灯的照明聚焦到样品室。明场图像由二向色镜与激光光分离，随后成像于两个CCD相机上。其中一个CCD作为主要数据采集手段，可通过软件触发以实现精确的采样率；另一个CCD用于成像一个固定参考微球，其位置作为反馈控制系统，用于补偿显微镜的漂移。</li>
	<li>样品通过XY平台进行粗略定位，随后可通过内置的三维压电平台实现精确位置调节。</li>
	<li>前向散射和透射的激光由明场聚光镜收集，并聚焦到光电探测器上。所得信号经100 kHz的抗混叠滤波器滤波后，放大并通过DAQ卡以200 kHz的频率进行采集。</li>
</ol>
2. 将微珠表观尺寸校准至轴向位置
<ol>
	<li>将直径为 800 nm 的聚苯乙烯微球分散液加入样品腔9中，分散液以磷酸盐缓冲液稀释。静置 10–15 分钟后，用缓冲液轻轻冲洗，以去除多余的微球。</li>
	<li>随机选择一个粘附在盖玻片上的微球，并调节样品腔的高度，使微球位于焦平面下方约 1 μm 处，以生成离焦图像。</li>
	<li>为测量图像的表观尺寸，首先在 LabView 中使用几何模式匹配功能确定微球的中心位置。</li>
	<li>接着，通过围绕每个截面中心对 360° 范围内的强度进行平均，生成微球的径向强度分布曲线。该径向分布曲线对应于明场图像中的白色环状结构，可通过二次函数拟合确定亮度峰值。该峰值与中心之间的距离可作为微球表观尺寸的度量。</li>
	<li>利用已校准的压电位移台，逐步增加微球的轴向位置，并使用 CCD 相机在每个轴向位置采集图像。</li>
	<li>对每幅连续图像重复进行图像分析，以建立微球表观尺寸与其轴向位置之间的关联（见图 3）。该方法获得的轴向分辨率约为 1.4 nm7。</li>
</ol>
3. 绘制操控光束的光势能分布
<ol>
	<li>首先将操纵光束与校准光束进行共线对准。校准光束在物镜后孔径处的功率应约为 50 mW，而操纵光束应弱得多，例如 10 mW。</li>
	<li>关闭操纵光束，利用刚度更高的校准光束捕获一个自由微球。</li>
	<li>现在打开操纵光束。由于操纵光束远弱于校准光束，微球的轴向位置将发生轻微扰动。由此引起的轴向位置变化可通过离焦的明场图像进行测量，方法如前所述。</li>
	<li>关闭操纵光束，同时保持微球被校准光束捕获，通过调节望远镜透镜改变校准光束的轴向焦点位置。重新打开操纵光束，测量微球随后的位移，并重复此过程。</li>
	<li>可将位移量 ΔX 对校准光束焦点的轴向位置作图。对应于微球最大位移的轴向位置即为光阱线性区域的中心（见图 4）。</li>
	<li>获得操纵光束的光力随轴向位置变化关系的最后一步，需要精确测量校准光束的刚度。为此，在关闭操纵光束的情况下，通过调节望远镜透镜，将由校准光束捕获的微球移动至距表面约一微米的位置。</li>
	<li>通过光电探测器测量透射光强度，记录微球的热轴向运动。</li>
	<li>该信号的自相关函数可拟合为单指数衰减函数，从而得到涨落的时间常数 τz。</li>
	<li>微球的流体动力学摩擦系数 ζ 可根据其与表面的接近程度进行校正5,10。校准光阱的刚度由此可表示为 κz = ζ / τz（见补充材料 A 和 B）。</li>
	<li>已知校准光阱的刚度后，即可将先前测得的轴向位移转换为作用力 ƒz = κz ΔX。对该曲线进行积分可得到操纵光束轴向光势的空间分布图（见图 4）。</li>
</ol>
4. 拉伸 DNA 样品
<ol>
	<li>安装培养室9 包含表面固定的DNA分子（&lt; 1 kbp），同时观察明场图像，通过调节望远镜将操纵光束的焦点置于未拉伸的微球上方略高位置。然后调节载物台位置，直至其中一个微球被捕获。</li>
	<li>将微球大致置于光镊的XY平面中心。在LabView中生成一系列方波信号并发送至声光偏转器（AOD），以重复开启和关闭激光束。精确控制激光强度和开启时间，以防止样品腔室过热。通常使用约2 mW的激光功率（在物镜后孔径处测量），发送200 ms（开启）和500 ms（关闭）的脉冲。发送至AOD的方波信号幅度应约为0.5 V。</li>
	<li>观察微球在光阱反复开启和关闭时的运动，注意激光是否诱导微球运动出现特定方向性。通过控制压电平台，在迭代调节微球在 X 和 Y 方向位置的同时，微球的随机运动在 XY 平面上应呈现各向同性，但在激光开启时其运动应明显受限。</li>
	<li>接下来，在 Z 方向上对准微珠。再次脉冲式开启和关闭激光束，同时实时测量微球的轴向位移。将载物台中心调整至线性区域，即 Z 方向位移最大的位置。</li>
	<li>在Z方向进行仔细对准后，必须检查捕获光阱在XY平面上是否仍处于中心位置。如果XY方向的对准已发生变化，则必须重新进行XY和Z方向的对准，直至微球在三个轴向上均被正确居中。</li>
	<li>通过向声光偏转器（AOD）发送电压信号，以0.025 V为步长，将激光强度从0 V ramp至0.5 V，以实现DNA的拉伸。每一步中，以100 fps采集400帧图像，并对图像取平均以获得轴向位移。</li>
	<li>现在可以绘制力-延伸曲线，并将其拟合到修正的WLC模型11 （参见补充材料B）。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
我们展示了两种DNA序列的力-伸展曲线：分别为1298 bp和247 bp的序列，其中后者是我们能够可重复拉伸的最短序列。对于较短的DNA片段，传统的蠕虫状链（Worm-Like Chain, WLC）模型无法完全解释其力-伸展关系，因为在这些长度尺度下，必须考虑由边界约束引起的有限尺寸效应和零力下的伸展。因此，力-伸展测量数据必须使用一种改进的WLC模型进行拟合，该模型以有效持久长度和零力伸展作为拟合参数，详见补充材料。对于长轮廓长度的双链DNA（dsDNA），有效持久长度即为标称持久长度（约50 nm），零力伸展可忽略不计。然而，当轮廓长度变短时，有效持久长度显著降低至远低于50 nm，且DNA即使在零外力下也表现出明显的伸展。
两种序列的力-延伸曲线及其相应的拟合数据如图5所示。根据修正的WLC拟合，我们确定1298 bp DNA的有效持久长度为35 nm，247 bp DNA的有效持久长度为25 nm。为便于说明，我们为每种序列展示了一次单次测量得到的力-延伸曲线。在实际操作中，应多次重复测量，并获得平均结果及相应的标准误差。还需注意的是，每次获得曲线后，必须确保微球仍处于光镊捕获状态，并正确地位于线性区域内；否则，必须按照本方案中先前所述的方法重新调整微球位置。
<img alt="比较传统方法与轴向方法用于粒子操控的光镊示意图。" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1 轴向光镊的原理。（左）传统光镊在焦点附近形成捕获，随后将微珠沿盖玻片侧向移动以施加张力。（右）在轴向光镊中，微球被捕获在远离焦点的位置，即光势的线性区域。在此构型下，聚合物在一定伸展范围内保持恒定张力。此外，增加激光强度可使微球沿轴向移动。
<img alt="Nd:YVO4激光器、二向色镜、光电探测器、CCD组成的光学装置示意图；吸收研究。" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2 轴向光镊的示意图。 激光（1064 nm Nd:YVO4）通过偏振分束器（PBS）被分为两束光。操控光束通过声光偏转器（AOD），而校准光束则可通过望远镜透镜独立调节。随后，两束光通过另一个PBS重新合并，并由高数值孔径（N.A.）物镜聚焦到样品上。同时，用于追踪微球的明场照明光穿过样品，经红外（IR）滤光后，由两个CCD相机成像，其中一个用于采集数据，另一个则作为反馈控制系统的一部分。
<img alt="离焦图像尺寸与轴向位置关系图；用于输出信号分析的显微镜设置。" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3 轴向位置校准。 为校准轴向位置，我们在物镜载物台处于不同轴向位置时，采集固定在样品室盖玻片上的微球的离焦图像。微球的尺寸由其中心与围绕微球图像形成的亮环上光强峰值位置之间的距离确定。插图为径向光强分布，用于确定微球的尺寸。
<img alt="光操控示意图：校准光束设置、力-位移图、线性光势能。" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4 绘制光势能的基本原理。 为了绘制操控光束的光力分布，需测量该光束在较强校准光束中捕获的微球所引起的轴向位移。确定该位移达到最大值时的线性区域中心。通过对光力随轴向位置变化的曲线进行积分，可得到光势能。
<img alt="力-延伸曲线，力学测量的曲线拟合，显示实验数据点。" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5 力-延伸曲线。 显示了由轴向光镊拉伸的随机 dsDNA 片段（1298 bp 和 247 bp，插图）的实验数据。数据点拟合至式 3 的修正 WLC 模型（实线），得到的 1298 bp 和 247 bp 片段的有效持久长度分别为 34 nm 和 25 nm。

<ol><li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li>
<li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loops+in+DNA%3A+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Phys.+J.+E.+Soft.+Matter%22%5BJournal%5D)">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li>
<li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA%3A+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li>
<li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li>
<li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li>
<li>Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Meiners+Lab%22">Meiners Lab</a>. , University of Michigan. (2011).</li>
<li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule%2C+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li>
<li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li>
<li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

传统的光镊依赖模拟或计算机控制的反馈系统，以对折射性物体施加恒定的力。这些主动反馈系统在样品发生突然伸展变化的情况下难以正常工作，例如蛋白质结合到DNA上，或分子马达沿纤维快速步进时。近年来已开发出多种施加恒定力的被动方法。其中一种方法用于实现RNA聚合酶在碱基对分辨率下的步进解析，该方法基于高斯激光束光学势的线性区域进行操作12。我们已将该方法改进，用于短生物分子的操作，构建了恒力轴向光镊系统。
轴向光镊可用于研究传统光学方法难以操控的短片段DNA。该技术已被用于研究长度仅数百个碱基对的短DNA分子的弹性8，并探测弹性张力对蛋白质介导的DNA成环过程的影响13,14。在较短的尺度上，由氢键和堆叠能差异引起的序列依赖性效应可能显著影响DNA的弹性特性。轴向光镊是揭示这些序列依赖性对DNA弹性影响的理想工具15。此外，轴向光镊还将成为研究DNA在单个组蛋白周围缠绕行为的灵敏工具，并可用于探测任何快速行进的分子马达的活性，有望成为单分子研究工具箱中一种有价值的新型技术。

<table><tbody><tr><td>试剂/设备</td><td>公司</td><td>货号</td><td>评论 </td></tr><tr><td>Nd:YVO4 激光器</td><td>Spectra Physics</td><td>T40-Z-106C</td><td></td></tr><tr><td>声光偏转器</td><td>IntraAction</td><td>DTD-274HA6</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Olympus</td><td>PlanApo</td><td>60X，数值孔径 1.4</td></tr><tr><td>压电平台</td><td>Mad City Labs</td><td>Nano-LP100</td><td>XYZ 轴平台</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>PixeLink</td><td>PL-A741</td><td></td></tr><tr><td>光电探测器</td><td>电光技术</td><td>ET-3020</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Spherotech</td><td>SVP-08-10</td><td>800 nm，链霉亲和素包被</td></tr><tr><td>抗地高辛</td><td>罗氏</td><td>11333089001</td><td>来自绵羊</td></tr><tr><td>引物</td><td>MWG操纵子</td><td>定制寡核苷酸</td><td>一条引物：生物素，另一条：地高辛 </td></tr><tr><td>PCR试剂</td><td>New England Biolabs</td><td>TAQ 聚合酶，dNTPs</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缓冲液用其他化学品</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title&quot;&gt;补充材料&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;A. 流体动力摩擦系数&amp;#8211;高效&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;用于测定流体动力学摩擦系数 c&amp;#8211;微球在表面附近的系数可采用以下展开式&lt;sup&gt;5,10&lt;/sup&gt;: &lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg&quot; alt=&quot;公式 1&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;其中引入了以下简写形式： &lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg&quot; alt=&quot;公式 2&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;摩擦系数&amp;#8211;效率根据流体黏度定义 &amp;#951; 以及微球的半径，微球中心位于某一距离处 &amp;#951; 表面之上。当展开至约十项时，该级数和收敛性良好。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;B. 轴向位置对刚度标定的影响&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;捕获阱刚度的校准需在标定精度与捕获阱实际使用的轴向位置之间进行权衡。标定精度随距表面距离的增加而提高，因此通常在距表面约800-1000 nm处进行校准，该位置高于实际实验条件下的使用位置。&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;C. 修正的蠕虫状链（WLC）模型&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;力-延伸曲线可拟合到一个修正的WLC模型，该模型考虑了在零光力条件下的体积排斥效应，具体如下： &lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg&quot; alt=&quot;公式 3&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;其中 &lt;em&gt;F&lt;sub&gt;opt&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; 是光力， &lt;em&gt;x&lt;sub&gt;o&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; 是一个用于零力伸长的拟合参数，&lt;em&gt;x&lt;sub&gt;opt&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; 是在受力下的延伸， &lt;em&gt;l&lt;/em&gt; 是DNA的轮廓长度，以及l*&lt;sub&gt;p&lt;/sub&gt; 是用于拟合的第二个参数 &quot;有效&quot; 持久长度 &lt;em&gt;F&lt;sub&gt;wlc&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; 由通常的WLC模型给出&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; &lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg&quot; alt=&quot;公式 4&quot;/&gt; 其中 &lt;em&gt;&amp;#949;&lt;/em&gt; 是DNA的相对延伸率。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

使用恒定力轴向光镊拉伸短dna序列

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

对于拉伸轮廓长度小于一千碱基对的DNA，单分子技术存在诸多实验困难。然而，许多重要的生物学事件（如组蛋白结合以及蛋白质介导的DNA成环1,2）正是发生在此长度尺度上。近年来研究表明，DNA的力学特性在DNA压缩包装形成核小体和染色质纤维等基本细胞过程中起着重要作用3,4。因此，深入理解短片段DNA的力学性质显得尤为重要。本文中，我们提供了一种实用的单分子光镊技术操作指南，该技术由我们实验室开发，可用于研究轮廓长度短至数百个碱基对的DNA的力学行为。
拉伸短片段DNA的主要难点在于，传统的光镊通常被设计为在垂直于载物台的方向上施加力5,6, （见图1）。在此几何构型中，当DNA长度为亚微米级时，微珠与DNA锚定的盖玻片之间的夹角变得非常陡峭。此时必须考虑轴向位置的影响，这可能带来技术上的挑战；并且由于延伸会使微球更靠近盖玻片，空间位阻效应随之增强。此外，由于微球具有不对称性，在光镊中微球旋转时，侧向延伸会在延伸过程中因反作用力方向的改变而产生不同程度的扭矩。
用于拉伸亚微米级DNA的替代方法面临着各自独特的障碍。例如，双光束光镊仅能拉伸长度接近光波波长的DNA，此时两个光镊之间以及微球间光散射引起的干涉效应会带来显著问题。若将其中一个光镊替换为微移液管，很可能也会遇到类似的挑战。虽然可以直接利用轴向势阱来拉伸DNA，但需要采用主动反馈系统以施加恒定的力，而该系统的带宽将非常有限，尤其是在低力条件下。
我们通过使用恒力轴向光镊直接将DNA从盖玻片表面拉开，从而规避了这些基本问题7,8。该方法通过将微球捕获在光势场的线性区域实现，在此区域内光力保持恒定，其大小可通过调节激光功率进行调控。将微球限制在线性区域内，还可作为对DNA的全光学力钳，其在轴向上可延伸近350 nm。同时，我们通过精细调节载物台的位置，补偿热漂移和机械漂移，使粘附在盖玻片上的参考微球始终保持在同一位置和焦平面上，从而实现近乎无限长的观察时间。

我们展示了使用恒力轴向光镊来研究短DNA分子的力学特性。通过轴向拉伸DNA，我们最大限度地减少了传统侧向操作中产生的空间位阻和人为假象，从而能够研究长度短至约100 nm的DNA分子。

使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

单分子技术在拉伸轮廓长度小于一千碱基对的DNA时面临诸多实验困难。然而，许多……

本实验的总体目标是利用经过精确校准的稳定光力来操控长度为100纳米的短DNA分子。该目标通过将DNA一端固定在盖玻片上，另一端连接至聚苯乙烯微球来实现。随后，对光镊系统进行对准和校准。然后，利用作用于微球的梯度力和散射力的共同作用，将DNA从表面拉伸展开。最后，通过将微球捕获在势能的线性区域，使DNA完全伸展。该方案已被用于研究DNA的力学特性及DNA-蛋白质结合动力学，并进一步有助于阐明边界条件对短DNA片段弹性性质的重要影响。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为恒力光镊的对准和校准过程复杂且具有挑战性。光镊系统包含来自1064纳米激光器的光束，该光束被分束为两个正交偏振的光束：其中一个用于操控生物分子，另一个用于校准。通过声光偏转器（AO optic deflector）或光衰减器（OD）控制操纵光束的强度。随后，光束通过另一个偏振分束器重新合并。这些光束由一个60倍、数值孔径1.4的平场复消色差油浸显微物镜紧密聚焦到样品池上。该光镊系统与一台自制的明场显微镜结合，后者通过聚光镜将卤素灯的照明光聚焦到样品室中，提供照明。明场图像通过二向色镜与激光分离，随后成像到两个CCD相机上。其中一个CCD作为我们获取数据的主要手段，并通过软件触发以实现精确的采样频率；另一个CCD则用于成像一个固定的参考微球，该微球的位置作为反馈控制系统，用于补偿显微镜的漂移。通过XY载物台对样品相对于物镜进行粗略定位，然后可通过内置的三维压电陶瓷载物台实现精确位置调节。前向散射和透射的激光由明场聚光镜收集，并聚焦到光电探测器上，用于校准微珠的尺寸。使用磷酸盐缓冲液稀释的直径为800纳米的聚苯乙烯微球分散液加载样品室。静置10至15分钟后，用缓冲液轻轻冲洗。为去除多余的微球，先找到随机附着在盖玻片上的一个微球，并调节样品腔的高度，直至该微球位于焦点下方约一微米处。为在 LabVIEW 中首先生成离焦图像以测量图像的表观尺寸，需使用几何图案匹配功能确定微球的中心。接着，通过平均360度方向的强度，生成微球的径向强度分布曲线。在每个横截面的中心处拟合径向轮廓，该轮廓对应于每个明场图像中的白色环，使用二次函数进行拟合。为寻找亮度峰值，可将该峰值与中心之间的距离作为微珠表观尺寸的度量。利用已校准的压电载物台，逐步增加微球的轴向位置，并使用CCD相机在每个轴向位置采集图像。对每幅连续图像重复进行图像分析，以将微球的表观尺寸与其轴向位置相关联。该方法获得的轴向分辨率约为 1.4 纳米，用于绘制操控光束的光势。首先关闭操控光束，共线对准操控光束与校准光束。将一个自由微球限制在校准光束形成的更刚性的光阱中。现在打开操控光束。由于其强度远弱于校准光束，微球的轴向位置将受到轻微扰动。由此引起的轴向位置变化可通过离焦的明场图像进行测量，方法如前所述。移动轴向焦平面，重复测量，并将位移量 ΔX 与校准光束的轴向焦位置作图。微球位移最大的轴向位置决定了光镊线性区域的中心。要拉伸DNA样品，需安装含有表面固定的DNA分子的样品室，同时观察明场图像，通过调节望远镜将操控光束的焦点置于未拉伸微球的稍上方，然后调节载物台的位置，直至其中一个微球被捕获。将微球大致定位在光镊XY平面的中心位置，在LabVIEW中生成一系列方波信号并发送至声光偏转器（AOD），以重复开启和关闭激光束。观察微球在光阱反复开启和关闭时的运动情况，并注意在迭代调整微球在 X 和 y 方向位置的过程中，激光是否诱导出微球运动的特定方向。通过控制压电样品台，微球的随机运动在 X-Y 平面内应呈现各向同性，尽管在激光开启时其运动将明显受限。接下来，将微珠在 Z 方向上对齐。再次脉冲式开启和关闭激光束，同时实时测量微球的轴向位移。将载物台置于线性区域内，该位置对应于拉伸DNA斜坡时Z方向位移最大的点。通过向声光偏转器（AOD）发送电压信号，将电压从0伏逐步增加至0.5伏，每步增量为0.025伏。以每秒100帧的速度采集400帧图像，并对其进行平均以获得轴向位移。最后，绘制力-伸展曲线，并将其拟合到修正的蠕虫状链模型。图中显示了二维核酸序列的力-延伸曲线，分别为长度 298 个碱基对和 247 个碱基对的短片段 DNA。传统的蠕虫状链（WLC）模型无法完全解释该力-延伸关系，因为在这些尺度下，必须考虑有限尺寸效应以及由边界约束引起的零力延伸。因此，力-延伸测量数据需采用改进的 WLC 模型进行拟合，该模型以有效持久长度和零力延伸作为拟合参数，详见补充材料中的描述。对于较长的 D-S-D-N-A 轮廓长度，其有效持久长度即为约 50 纳米的名义持久长度，且在修正的 WLC 拟合中可忽略零力下的伸展。在该方法建立后，1,298 碱基对 DNA 的有效持久长度为 35 纳米，247 碱基对 DNA 的有效持久长度为 25 纳米。该方法为一系列 DNA 及 DNA-蛋白质复合物的纳米力学测量奠定了基础，包括对调控蛋白介导的 DNA 成环及其解离动力学的研究。

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

伸展的DNA短序列恒力轴向光镊

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。...

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。...

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

本文介绍了检测单个荧光标记的蛋白质分子与悬浮在两个光镊微球之间的单个DNA分子相互作用的仪器设备和方法。...

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

磁镊是一种强大的单分子操控技术，可通过自由旋转磁镊配置直接测量生物大分子的扭转，或通过磁扭矩镊配置直接测量其扭矩。本文提供了进行此类测量的指导，包括在DNA及相关核蛋白丝研究中的应用。...

用于测量扭转与扭矩的磁力镊子

光镊技术已被用于通过从单个RNA分子的5’和3’端进行拉伸来研究RNA折叠。本文描述了用于光镊实验的RNA分子合成、仪器校准以及操纵单个分子的常用方法。...

利用光镊对单个RNA分子进行纳米操控

本方案展示了一种简单、可靠且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维（1D）扩散。...

一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿DNA的运输

本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。...

利用磁镊对G-四链体进行单分子操控

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本文介绍了一种高速磁镊装置，可在最高达 1.2 kHz 的采样速率下对受力敏感的生物分子进行纳米力学测量。我们以 DNA 发夹结构和 SNARE...

高速磁镊技术用于力敏感元件的纳米力学测量

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和...

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

了解如何使用恒力轴向光镊技术操控短至100纳米的DNA分子，通过梯度力与散射力拉伸DNA并研究其力学特性。该方法可深入分析DNA弹性及蛋白质结合动力学。

使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

探索更多视频