使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

本实验的总体目标是利用经过精确校准的稳定光力来操控长度为100纳米的短DNA分子。该目标通过将DNA一端固定在盖玻片上，另一端连接至聚苯乙烯微球来实现。随后，对光镊系统进行对准和校准。

然后，利用作用于微球的梯度力和散射力的共同作用，将DNA从表面拉伸展开。最后，通过将微球捕获在势能的线性区域，使DNA完全伸展。该方案已被用于研究DNA的力学特性及DNA-蛋白质结合动力学，并进一步有助于阐明边界条件对短DNA片段弹性性质的重要影响。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为恒力光镊的对准和校准过程复杂且具有挑战性。光镊系统包含来自1064纳米激光器的光束，该光束被分束为两个正交偏振的光束：其中一个用于操控生物分子，另一个用于校准。

通过声光偏转器（AO optic deflector）或光衰减器（OD）控制操纵光束的强度。随后，光束通过另一个偏振分束器重新合并。这些光束由一个60倍、数值孔径1.4的平场复消色差油浸显微物镜紧密聚焦到样品池上。该光镊系统与一台自制的明场显微镜结合，后者通过聚光镜将卤素灯的照明光聚焦到样品室中，提供照明。

明场图像通过二向色镜与激光分离，随后成像到两个CCD相机上。其中一个CCD作为我们获取数据的主要手段，并通过软件触发以实现精确的采样频率；另一个CCD则用于成像一个固定的参考微球，该微球的位置作为反馈控制系统，用于补偿显微镜的漂移。

通过XY载物台对样品相对于物镜进行粗略定位，然后可通过内置的三维压电陶瓷载物台实现精确位置调节。前向散射和透射的激光由明场聚光镜收集，并聚焦到光电探测器上，用于校准微珠的尺寸。使用磷酸盐缓冲液稀释的直径为800纳米的聚苯乙烯微球分散液加载样品室。静置10至15分钟后，用缓冲液轻轻冲洗。

为去除多余的微球，先找到随机附着在盖玻片上的一个微球，并调节样品腔的高度，直至该微球位于焦点下方约一微米处。为在 LabVIEW 中首先生成离焦图像以测量图像的表观尺寸，需使用几何图案匹配功能确定微球的中心。接着，通过平均360度方向的强度，生成微球的径向强度分布曲线。

在每个横截面的中心处拟合径向轮廓，该轮廓对应于每个明场图像中的白色环，使用二次函数进行拟合。为寻找亮度峰值，可将该峰值与中心之间的距离作为微珠表观尺寸的度量。利用已校准的压电载物台，逐步增加微球的轴向位置，并使用CCD相机在每个轴向位置采集图像。对每幅连续图像重复进行图像分析，以将微球的表观尺寸与其轴向位置相关联。

该方法获得的轴向分辨率约为 1.4 纳米，用于绘制操控光束的光势。首先关闭操控光束，共线对准操控光束与校准光束。将一个自由微球限制在校准光束形成的更刚性的光阱中。现在打开操控光束。

由于其强度远弱于校准光束，微球的轴向位置将受到轻微扰动。由此引起的轴向位置变化可通过离焦的明场图像进行测量，方法如前所述。移动轴向焦平面，重复测量，并将位移量 ΔX 与校准光束的轴向焦位置作图。

微球位移最大的轴向位置决定了光镊线性区域的中心。要拉伸DNA样品，需安装含有表面固定的DNA分子的样品室，同时观察明场图像，通过调节望远镜将操控光束的焦点置于未拉伸微球的稍上方，然后调节载物台的位置，直至其中一个微球被捕获。将微球大致定位在光镊XY平面的中心位置，在LabVIEW中生成一系列方波信号并发送至声光偏转器（AOD），以重复开启和关闭激光束。

观察微球在光阱反复开启和关闭时的运动情况，并注意在迭代调整微球在 X 和 y 方向位置的过程中，激光是否诱导出微球运动的特定方向。通过控制压电样品台，微球的随机运动在 X-Y 平面内应呈现各向同性，尽管在激光开启时其运动将明显受限。

接下来，将微珠在 Z 方向上对齐。再次脉冲式开启和关闭激光束，同时实时测量微球的轴向位移。

将载物台置于线性区域内，该位置对应于拉伸DNA斜坡时Z方向位移最大的点。通过向声光偏转器（AOD）发送电压信号，将电压从0伏逐步增加至0.5伏，每步增量为0.025伏。以每秒100帧的速度采集400帧图像，并对其进行平均以获得轴向位移。最后，绘制力-伸展曲线，并将其拟合到修正的蠕虫状链模型。

图中显示了二维核酸序列的力-延伸曲线，分别为长度 298 个碱基对和 247 个碱基对的短片段 DNA。传统的蠕虫状链（WLC）模型无法完全解释该力-延伸关系，因为在这些尺度下，必须考虑有限尺寸效应以及由边界约束引起的零力延伸。因此，力-延伸测量数据需采用改进的 WLC 模型进行拟合，该模型以有效持久长度和零力延伸作为拟合参数，详见补充材料中的描述。

对于较长的 D-S-D-N-A 轮廓长度，其有效持久长度即为约 50 纳米的名义持久长度，且在修正的 WLC 拟合中可忽略零力下的伸展。在该方法建立后，1,298 碱基对 DNA 的有效持久长度为 35 纳米，247 碱基对 DNA 的有效持久长度为 25 纳米。该方法为一系列 DNA 及 DNA-蛋白质复合物的纳米力学测量奠定了基础，包括对调控蛋白介导的 DNA 成环及其解离动力学的研究。