Name: 选择和隔离殖民地的人类诱导多能干细胞重新编程成年成纤维细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: 了解如何使用逆转录病毒载体将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，并通过TRA-1-81抗体染色识别阳性克隆进行扩增。该方法为干细胞生物学研究提供了高效的技术方案。

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本工作由弗里德赖希共济失调研究联盟、阿诺德家族基金会的试点资助以及位于安德森癌症中心的干细胞与发育生物学中心共同资助。

1. 病毒制备与转导
<ol>
	<li>将Phoenix Ampho细胞以约7-8×106个/10 cm培养皿的密度接种于10 ml DMEM培养基中（DMEM高糖培养基，含10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺，不含抗生素），放入37°C、5% CO2的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日，使用12 μg编码Oct3/4、Sox2、Klf4、c-myc或GFP基因的质粒（Addgene质粒编号分别为17217、17218、17219、17220）和35 μl Fugene 6试剂对Phoenix细胞进行转染。将转染混合物配制于500 μl DMEM培养基中（DMEM高糖培养基，含2 mM L-谷氨酰胺，不含胎牛血清和抗生素），室温孵育20分钟。随后轻柔地将DNA复合物滴加至含有70–80%融合度Phoenix细胞的10 cm培养皿中。</li>
	<li>转染后6–8小时更换培养基，加入含青霉素和链霉素的DMEM培养基（DMEM高糖培养基，含10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺）。</li>
	<li>之后每隔12小时收集含病毒的培养上清共4次，合并所有收集液，并用0.45 μm滤器过滤以去除脱落细胞和碎片（含病毒颗粒的培养基可在冰箱中保存2周而不丧失感染活性，但不建议冷冻）。</li>
	<li>进行逆转录病毒转导前24小时，将冻存的人成体成纤维细胞（第10代，Coriell Laboratories）从冻存库中取出并接种。将细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板（预先包被明胶）中，培养基为DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素及非必需氨基酸。</li>
	<li>次日，将成纤维细胞培养基更换为来自Phoenix细胞的含病毒颗粒的培养基。向6孔板每孔加入含病毒的培养基（Oct4、Sox2、Klf4和c-myc各1 ml，共4 ml），并补充6 μg/ml多聚素（polybrene），随后在20°C下以1600×g离心1小时。转导约12小时后，将病毒培养基更换为成纤维细胞常规培养基。每隔24小时重复一次病毒感染和离心操作，共进行3次。</li>
	<li>末次感染后继续用DMEM培养基培养成纤维细胞48小时。通过平行转导表达GFP的逆转录病毒培养基来检测感染效率。图1展示了离心辅助的逆转录病毒感染人成纤维细胞的效率。</li>
</ol>
2. 重编程
<ol>
	<li>在明胶处理的6孔板中，以约2×105个细胞/孔的密度接种经γ射线照射的MEF饲养层细胞，使用成纤维细胞生长培养基进行培养。次日，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化感染的人成纤维细胞，并以约1.2×104个细胞/孔的密度接种至成纤维细胞生长培养基中。</li>
	<li>次日将培养基更换为hES培养基（DMEM/F12，20% Knockout血清替代物，非必需氨基酸，青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，0.1 mM β-巯基乙醇，20 ng/ml基础成纤维细胞生长因子（bFGF）），重编程最初7天额外添加0.5 mM丁酸钠。每日更换培养基。</li>
	<li>每日观察转导细胞的形态学变化。转导后的成纤维细胞接种至饲养层细胞后约5–10天，将开始出现类似hiPS细胞的克隆。接种至MEF饲养层细胞后约14–28天，hiPSC克隆即可进行分离。</li>
</ol>
3. 人诱导多能干细胞克隆的分离
<ol>
	<li>在挑取hiPSC克隆前一天，用γ射线照射的MEF饲养层细胞（约每孔4×104个细胞）接种于24孔板中，并加入成纤维细胞生长培养基。在此阶段，也可将hiPSC克隆转移至无饲养层体系，使用Matrigel包被的培养板和mTeSR1培养基进行培养。</li>
	<li>在分离hiPSC克隆前，移除MEF培养板中的成纤维细胞生长培养基，并用PBS洗涤MEF以去除残留的FBS。随后，每孔加入0.5 ml hES培养基（若为Matrigel包被的孔，则使用mTeSR1培养基），并添加10 μM ROCK抑制剂Y276327,8。</li>
	<li>如有必要，在超净台内的显微镜下使用21号针头去除hiPSC克隆周围的成纤维细胞（见图2A-C）。用PBS冲洗培养板，然后加入含有Tra-1-81 StainAlive特异性抗体（1:200，Stemgent）的新鲜hES培养基。30分钟后，更换为含10 μM ROCK抑制剂的新鲜hES培养基。在荧光显微镜下观察培养板，并使用物镜标记Tra-1-81阳性克隆（见图2D）。</li>
	<li>在超净台内的显微镜下，使用21号针头将Tra-1-81阳性的hiPSC克隆切割成若干小块（见图2E和F）。</li>
	<li>使用移液器（P200）将hiPSC克隆片段转移至含有MEF或Matrigel的24孔板的各个孔中。避免转移非hiPS细胞。将培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中，使hiPSC克隆贴壁24–36小时。</li>
	<li>每天更换hES培养基或mTeSR1培养基（适用于在Matrigel上生长的克隆）。在初次转移至24孔板后48小时，可观察到具有正确hES样形态的hiPSC克隆。</li>
	<li>每6–8天手动传代一次hiPSC克隆，依次转移至12孔板，随后转移至6孔板。</li>
	<li>在完成克隆扩增并建立hiPSC细胞系后，通过免疫细胞化学方法检测多能性标志物TRA-1-60、SSEA-4、Oct3/4、Sox2和Nanog的表达情况（见图3）。通过核型分析和畸胎瘤形成实验评估所获细胞系的基因组完整性和分化潜能6,9。</li>
</ol>
4. 代表性结果
使用含逆转录病毒的培养基进行高效转导对于成功重编程至关重要。建议在每次重编程实验中，全程采用表达GFP的病毒进行转染/感染操作，以监测转导效率，如图1所示。根据文献10所述方法，通过非浓缩病毒培养基转导人成纤维细胞所测定的表达GFP病毒的滴度，通常在每毫升0.5–5 × 107 病毒颗粒（vp/ml）范围内。
成纤维细胞在末次感染后仅2天即可出现形态变化。在将人成纤维细胞接种至MEF饲养层细胞之前，应小心地对其进行计数。建议以三种不同密度接种细胞（每孔6×103、1.2×104、2.5×104，接种于6孔板的单个孔中），因为不同细胞系具有不同的生长特性，而接种密度对重编程效率至关重要。在重编程初期使用丁酸钠处理7至14天，可使hiPSC形成效率提高约5倍。通常情况下，尤其是当感染后的成纤维细胞以较高密度接种时，成纤维样细胞可能过度生长，覆盖整个培养皿并遮盖hiPSC克隆，如图2A所示。此时，可小心地将成纤维细胞层剥离并移除，以暴露hiPSC克隆（图2B）。随后，应使用hES培养基冲洗hiPSC克隆，并用Tra-1-81抗体进行染色。根据所用成纤维细胞的不同，约有20%–40%呈现iPSC样形态的克隆无法被Tra-1-81抗体染色。已鉴定的hiPSC克隆可在接下来的12–24小时内从培养板中转移。长时间孵育将导致hiPSC迅速分化。克隆可通过手动传代方式接种至MEF饲养层细胞或Matrigel包被的培养板上。扩增后建立的hiPSC克隆应通过免疫细胞化学（ICC）检测多能性标志物的表达，如图3所示。此外，对所获得的iPS细胞系进行详细的分子表征还应包括：利用RT-PCR分析多能性基因的表达、检测多能性基因启动子区域的DNA去甲基化状态，以及分析转基因沉默情况9。
 
<img alt="培养细胞的荧光显微镜观察；图像显示细胞形态及GFP表达分析。" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 利用表达GFP的逆转录病毒测定病毒转导效率。 （A, B）来源于弗里德赖希共济失调症患者（GM03665，Coriell 仓库）的人成体成纤维细胞，在连续两次感染GFP逆转录病毒培养基后进行观察。（C, D）人成纤维细胞使用同一批GFP逆转录病毒培养基感染，随后将6孔板直接离心1小时（1600g）。感染后48小时拍摄图像。
<img alt="显微镜下的细胞培养；六张图像显示形态和荧光，比例尺为20-100μm。" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. hiPSC克隆的鉴定与分离。 （A）含有hiPSC并被成纤维细胞包围的培养板的相差显微图像。细胞在hES培养基中培养21天。（B, C）去除周围成纤维细胞层后的同一hiPSC克隆。（D）通过Tra-1-81表面标志物抗体进行活细胞染色，鉴定正确重编程的hiPSC克隆，随后用无菌针切割（E, F），并转移至24孔板的不同孔中。
<img alt="免疫荧光检测，干细胞标志物；Oct3/4、Sox、Nanog、SSEA4、Tra-1-60、DAPI染色。" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 通过免疫细胞化学检测确定hiPSCs中多能性特异性标志物Oct3/4、Nanog、Sox2、SSEA4和Tra-1-60的表达。

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28, 713-720 (2011).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
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<li>Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friedreich%27s+ataxia+induced+pluripotent+stem+cells+model+intergenerational+GAATTC+triplet+repeat+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability.</a> Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).</li>
<li>Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
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<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+deconstructing+stem+cell+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease.</a> Neuron. 70, 626-644 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

研究人类疾病，特别是神经系统疾病和神经退行性疾病，一直面临巨大挑战，其主要原因在于难以获得合适的人源细胞模型。将易于获取的体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），并进一步将其分化为多种细胞类型的技术，为构建遗传性疾病的细胞模型提供了可能。此外，iPSCs 在再生医学的未来发展中具有广阔前景。因此，建立并优化可靠、高效且安全的体细胞重编程至多能性的方法至关重要。
从治疗应用的角度来看，开发不引起宿主基因组足迹突变的安全诱导多能干细胞（iPSC）生成方法至关重要。目前已有多种不向重编程细胞基因组引入永久性改变的体细胞重编程方法，例如转染附加体型载体、使用可切除转座子、腺病毒感染以及直接递送mRNA或蛋白质11-15。然而，这些无转基因方法的重编程效率较低，且依赖于被重编程体细胞的特性、类型和年龄。因此，这些方案并不适用于常存于细胞库中的高代次、成年体细胞的重编程。此外，为了能够对多个iPSC系进行详细表征，建立人类疾病的新模型，并开展高通量药物筛选，采用病毒载体递送转录因子的体细胞重编程是一种可行的策略。迄今为止，已有超过20项研究报道了利用患者特异性iPS...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-81 抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-8628</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>4903S</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-60 抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3579S</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>CF1 小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6201G</td><td></td></tr><tr><td>客观指标</td><td>尼康仪器公司</td><td>MBW10010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel </td><td>BD 生物科学</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>干细胞技术</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>罗氏集团</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>物体标记</td><td>尼康仪器公司</td><td>MBW10010</td><td></td></tr></tbody></table>

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

本文介绍一种利用编码 Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，并在丁酸钠存在条件下，将人类成体成纤维细胞重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC）的实验方案1-3。我们采用该方法对来自弗里德赖希共济失调患者（Friedreich's ataxia patient，GM03665，Coriell 仓库）的晚期传代（&gt;p10）人类成体成纤维细胞进行了重编程。该重编程方法包括一种高效转导流程，即在含有病毒的培养基中，通过反复离心促进成纤维细胞的病毒感染。重编程后产生的 hiPSC 克隆通过活细胞免疫染色检测多能细胞表面标志物 Tra-1-81 进行鉴定，随后从未重编程的成纤维细胞中分离，并进行手动传代4,5。这些 hiPSC 直接从重编程培养板转移至 Matrigel 包被的培养板中，在无饲养层条件下继续培养。自第一次传代起，hiPSC 克隆即表现出典型的人胚胎干细胞（hES）样形态。采用本方案，超过 70% 被筛选出的克隆可成功扩增并建立稳定的细胞系。所建立的 hiPSC 细胞系表达典型的多能性标志物，包括表面标志物 TRA-1-60 和 SSEA-4，以及核内标志物 Oct3/4、Sox2 和 Nanog。 
本方案已使用来自弗里德赖希共济失调患者及健康对照个体6的人类成体成纤维细胞、人类新生儿成纤维细胞以及人类角质形成细胞进行建立和验证。

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。

本文介绍了一种利用编码...的逆转录病毒载体将人类成体成纤维细胞重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC）的实验方案。

在本视频文章中，利用逆转录病毒载体将人类成体成纤维细胞重编程为多能干细胞。首先，使用编码转录因子 T three four、SOX two、KLF four 和 cmic 的逆转录病毒载体转导人类成纤维细胞。感染的成纤维细胞在小鼠胚胎饲养细胞上培养14至28天。随后用TRA 180 1抗体对获得的细胞培养物进行染色，以鉴定重编程细胞形成的克隆。阳性克隆随后被转移至含有MEF的培养板中进行扩增。免疫细胞化学染色可确认多能性标志物的表达及多能干细胞系的建立。随后应进行额外研究以进一步表征这些细胞系。通常，刚接触体细胞重编程和人诱导性多能干细胞培养的研究人员会面临困难，因为难以准确识别正确的iPSC克隆集落。本实验操作将由我实验室的博士后苏拉·波拉克博士（Dr. Sula Pollak）进行演示。首先，在10厘米培养皿中以每皿约700万至800万个细胞的密度接种Phoenix AMFO细胞，加入10毫升含高糖的DMEM培养基，放入培养箱中过夜培养。次日，配制转染混合液：在500微升无血清、含L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基中，加入12微克编码T34-SOX2、Klf4、c-Myc或GFP基因的载体质粒，以及35微升Fugene 6转染试剂。将混合物孵育20分钟。然后，轻轻将DNA复合物用移液器加入含有Phoenix细胞的培养板中，细胞融合度应为70%至80%。在37摄氏度下孵育细胞6至8小时后。吸去培养基，并加入8 mL含抗生素的高糖DMEM培养基。随后将培养板放回培养箱中继续培养12小时。使用移液器吸取并收集含有病毒的培养基。然后更换培养基，并每12小时重复此过程，直至收集培养基四次。将收集的培养基置于4摄氏度保存。待所有培养基收集完毕后，合并所有部分，再通过0.45微米的管顶滤器倒入50毫升锥形管中，以去除脱落的细胞和碎片。含有病毒颗粒的过滤培养基可在冰箱中保存两周而不丧失感染活性。不建议冷冻保存。在转导实验前一天，将冻存的成人人类成纤维细胞解冻，并向每孔六孔明胶包被板中加入1×10⁵个细胞。第二天，在一个50毫升的锥形管中，分别加入3.5毫升的T4 SOX2、KLF4和c-Myc病毒培养基，并加入Polybrene，使其终浓度为6微克/升，作为对照。准备1毫升GFP病毒培养基、3毫升培养基以及Polybrene，使其终浓度为6微克/毫升。吸去含有人类成纤维细胞的培养板中的培养基。然后加入 4 毫升混合病毒培养基或对照培养基，将培养板在 20 摄氏度下以 1600 ×g 离心 1 小时。离心后，将培养板孵育约 12 小时。随后将病毒培养基更换为成纤维细胞培养基，继续孵育 12 小时。在最后一次感染后，再重复此过程两次，即从感染到在成纤维细胞培养基中培养。将成纤维细胞在DMEM中培养48小时。然后使用GFP逆转录病毒培养基检测平行转导的感染效率。接下来，启动体细胞向多能细胞的重编程。将感染后的成纤维细胞接种于人胚胎干细胞培养基（HES培养基）中，或以每孔约2×10⁵个细胞的密度接种于经明胶处理的六孔板中，该六孔板预先以小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层，并使用成纤维细胞生长培养基进行培养，次日更换培养基。使用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 分散感染的人类成纤维细胞，并在成纤维细胞生长培养基中以每孔约 1.2 × 10⁴ 的密度接种。次日，将培养基更换为含有 0.5 mmol/L 丁酸钠的 HES 培养基，用于重编程的最初七天。每天更换培养基。更换为不含丁酸钠的HES培养基，并继续重编程7至21天。每天均需更换培养基。观察转导细胞的形态学变化。将转导的成纤维细胞接种到饲养细胞上约10天后，细胞克隆将开始出现。含有重编程细胞的克隆现在被称为人诱导性多能干细胞或人iPS细胞。人iPS细胞集落在接种于MEF饲养细胞后14至28天即可准备进行分离。在此阶段，人iPS细胞集落可转移至含MEF或包被Matrigel的培养板中。以下演示在挑取人iPS细胞集落前一天，将经γ射线照射的MEF饲养细胞以成纤维细胞生长培养基接种于24孔板中的操作。在拟挑选人iPS细胞克隆的当天，将培养物置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育。吸除MEFs上的成纤维细胞生长培养基，并用PBS洗涤以去除残留的胎牛血清（FBS）。随后，向每孔加入0.5毫升含10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632的人胚胎干细胞（hESC）或HES培养基。接着，在超净台内使用显微镜观察重编程培养板中人iPS细胞克隆的形成情况。如有必要，使用21号针头去除人iPS细胞集落周围的成纤维细胞。用PBS洗涤培养板，加入含有TRA-1-80活细胞特异性抗体的新鲜HES培养基。将细胞放回37摄氏度、5% CO2的培养箱中继续培养。30分钟后，将培养基更换为新鲜的HES培养基，其中添加10 µM的ROCK抑制剂。然后在荧光显微镜下观察集落，标记TRA-1-81阳性的集落。使用21号针头作为客观标记。将TRA 180 1阳性人类iPS细胞集落切割成若干小块。接着，使用自动移液器将人类iPS细胞集落的片段转移至含有MEFs的24孔板的各个孔中。避免转移非iPS细胞。将培养板放入培养箱中，使人类诱导多能干细胞（iPS细胞）集落贴壁生长24至36小时，每天更换培养基。在初次转移至24孔板后48小时，可观察到具有正确拟胚体样形态的人类iPS细胞集落。每六至八天通过21号针头切割法对人类iPS细胞集落进行人工传代，并在克隆扩增后将培养物逐步扩增至12孔板，随后转移至6孔板。在建立人诱导多能干细胞（iPS）系后，通过免疫化学方法分析其多能性标志物的表达，包括TRA-1-60、SSEA-4、T3-4、SOX2和Nanog。详细的表征可能包括体外和体内分化分析、核型分析、转基因沉默分析、甲基化研究以及基因表达研究。含有逆转录病毒的培养基进行高效转导对于成功重编程及确定病毒转导效率至关重要。来源于弗里德赖希共济失调症患者的成人成纤维细胞，在连续两次感染表达GFP的逆转录病毒培养基后进行观察：当成纤维细胞仅通过与病毒培养基简单孵育感染时，转导的细胞比例不到20%。然而，当在加入GFP逆转录病毒培养基后立即进行后续操作，转导效率显著提高。此处超过80%的细胞被转导，以对分离的人诱导多能干细胞（iPS细胞）克隆进行初步表征。通过免疫化学方法检测了人胚胎干细胞特征性的多能性标志物的表达，结果如图所示。分离的人iPS细胞克隆对多能性标志物呈阳性。T三、四、SOX2纳米、SSEA-4和TRA-1-60 DNA。上图面板中通过DPI共染色显示，在人iPS细胞克隆和饲养层细胞中均可检测到。这些结果表明，采用该重编程方案获得的人iPS细胞表达了未分化人多能干细胞特征性的多能性标志物。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用逆转录病毒转导技术成功地将人类成纤维细胞重编程为多能干细胞，正确识别人类诱导性多能干细胞克隆，并对hiPSCs进行初步表征。

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选择和隔离殖民地的人类诱导多能干细胞重新编程成年成纤维细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。...

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。...

分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。...

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

了解如何使用逆转录病毒载体将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，并通过TRA-1-81抗体染色识别阳性克隆进行扩增。该方法为干细胞生物学研究提供了高效的技术方案。

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

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