选择和隔离殖民地的人类诱导多能干细胞重新编程成年成纤维细胞

在本视频文章中，使用逆转录病毒载体对人类成纤维细胞进行重编程以生成多能干细胞。首先，用编码转录因子的逆转录病毒载体转导人成纤维细胞。T 3 4、SOX 2、KLF 4 和 cmic。

感染的成纤维细胞在小鼠胚胎饲养层细胞上培养 14 至 28 天。用 TRA 180 1 抗体对所得培养物进行染色，以鉴定重编程细胞的集落。然后将阳性菌落转移到含有 MEF 的平板上进行扩增。

免疫细胞化学染色证实了多能性标志物的表达和多能干细胞系的建立。然后应进行其他研究以进一步表征这些线条。一般来说，刚接触体细胞细胞编程和人诱导多能干细胞培养的个体会很困难，因为很难识别正确的 IPSC 集落。

演示该程序的将是我实验室的博士后 O 研究员 Sula Pollak 博士。通过以每 10 厘米板约 7 至 800 万个细胞的密度接种 Phoenix AM FO 细胞来开始此过程，将 10 毫升高葡萄糖 DMEM 置于培养箱中并培养过夜。第二天，制备由 12 微克载体组成的转染混合物，编码 T 3 4 SOX、2 klf、4 cmic 或 GFP 基因以及 35 μL 少数基因 6，总体积为 500 μL 血清游离高葡萄糖 DMEM，含 L 谷氨酰胺。

将混合物孵育 20 分钟。然后，为了转染 phoenix 细胞，轻轻地将 DNA 复合物移液到含有 phoenix 细胞的板中，phoenix 细胞应达到 70% 至 80% 汇合度。6 到 8 小时后，在 37 摄氏度下孵育细胞。

吸出培养基，并用 8 毫升含抗生素的高葡萄糖 DMEM 替换。然后在孵育后将板放回培养箱中 12 小时。使用移液器吸出并收集含有病毒的培养基。

然后更换培养基，每 12 小时重复一次此过程，直到培养基收集 4 次。将培养基储存在 4 摄氏度。收集完所有培养基后，将所有部分混合，然后通过 0.45 微米的管顶过滤器倒入 50 毫升锥形管中，以去除分离的细胞和碎片。

含有病毒颗粒的过滤培养基可以在冰箱中保存两周而不会失去感染活性。不建议冻结。在转导程序的前一天，解冻成人成纤维细胞的冷冻原液，并在 6 个孔明胶包被板的每个孔中向第五个细胞中加入 1 乘以 10 的样品。

第二天，在 50 毫升锥形管中，混合 T 4、SOX 2、klf 4 和 cmic 病毒培养基各 3.5 毫升，并加入多脑至终浓度为 6 微克/升作为对照。制备 1 毫升 GFP 病毒培养基、3 毫升培养物、培养基和终浓度为 6 μg/mL 的 poly Brain。从含有人成纤维细胞的板中吸出培养基。

然后加入 4 mL 混合病毒培养基或对照培养基，离心后在 20 摄氏度下以 1600 G 离心板 1 小时。将板孵育约 12 小时。然后用成纤维细胞培养基替换病毒培养基，再孵育 12 小时。

从感染到在成纤维细胞培养基中培养，重复此过程，最后一次感染后再重复两次。在 DMEM 中培养成纤维细胞 48 小时。然后用 GFP 逆转录病毒培养基检查平行转导的感染效率。

接下来开始从体细胞到多能细胞的重编程。将感染的成纤维细胞在人胚胎干细胞培养基或 HES 培养基种子小鼠胚胎、成纤维细胞或 MEF 中培养，密度约为每孔明胶处理的 10 至 5 个细胞的两倍。第二天在成纤维细胞生长培养基中进行六孔板。

使用 0.05% tripsin EDTA 分裂感染的人成纤维细胞，并以大约 1.2 倍的密度将它们接种到成纤维细胞生长培养基中每孔 10 至第四个。第二天。在重编程的最初 7 天内，用含有 0.5 毫摩尔丁酸钠的 HES 培养基替换培养基。

每天更换培养基。用不含丁酸钠的 HES 培养基替换培养基，并继续重编程 7 至 21 天。每天更换培养基。

检查转导的细胞的形态学变化。在将转导的成纤维细胞转移到饲养层细胞上后约 10 天，细胞集落将开始出现。包含重编程细胞的集落现在称为人诱导多能干细胞或人 IPS 细胞。

人 IPS 细胞集落接种在 MEF 饲养层细胞上后 14 至 28 天内即可分离。在此阶段，人 IPS 细胞集落可以转移到含有 MEF 或基质胶覆盖的平板上。在挑选人 IPS 细胞集落前一天证明转移到含有 MEF 的板上：在成纤维细胞生长培养基中接种含有 γ 射线 MEF 饲养层细胞的 24 孔板。

37 摄氏度下用 5% CO2 孵育，采摘人 IPS 细胞集落的那一天。从 ME Fs 中吸出成纤维细胞生长培养基，并用 PBS 冲洗以去除任何痕量的 FBS。随后，向每个孔中加入 0.5 毫升含有 10 微摩尔岩石抑制剂 Y 2 7 6 3 2 的人胚胎干细胞或 HES 培养基，接下来使用安装在层流罩中的显微镜，检查重编程板是否形成人 IPS 细胞集落。

如有必要，用 21 号针头去除人 IPS 细胞集落周围的成纤维细胞。用 PBS 冲洗板，并加入含有 TRA 180 1 染色活体特异性抗体的新鲜 HES 培养基。将细胞放回 37 摄氏度和 5% CO 2 的培养箱中。

30 分钟后，用补充有 10 微摩尔岩石抑制剂的新鲜 HES 培养基替换培养基。然后在荧光显微镜下观察菌落。标记 TRA 1 至 81 个阳性菌落。

使用 21 号针头的物镜标记。将 TRA 180 1 阳性人 IPS 细胞集落切成几个小块。接下来，使用自动移液器将人 IPS 细胞集落的片段转移到带有 ME Fs 的 24 孔板的各个孔中，避免转移非 IPS 细胞。

将板放入培养箱中，让人 IPS 细胞集落附着 24 至 36 小时，每天更换培养基。在初次转移到 24 孔板上后 48 小时，可以看到具有正确 HE 样形态的人 IPS 细胞集落，每 6 到 8 天用 21 号针板切割一次人 IPS 细胞集落。将培养物扩增到 12 孔板上，然后在克隆扩增后在 6 孔板上扩增。

建立人 IPS 细胞系后，使用免疫化学分析多能性标志物 TRA 1、60、SSEA 4、T 3、4、SOX 2 和 nanog 的表达。详细的表征可能需要体外和体内。分化分析、核型分析、转基因沉默分析、甲基化研究和基因表达研究。

使用含逆转录病毒的培养基进行高效转导对于成功重编程以确定病毒转导的功效至关重要。在连续两次感染 GFP 逆转录病毒培养基后，观察到源自 Friedrichs 共济失调患者的人成人成纤维细胞，当成纤维细胞通过与病毒培养基的简单孵育感染时，只有不到 20% 的细胞被转导。然而，当立即添加 GFP 逆转录病毒培养基时，转导效率显着提高。

在这里，超过 80% 的细胞被转导以对分离的人 IPS 细胞集落进行初步表征。通过免疫化学评估人 ES 细胞特征性多能性标志物的表达，如图所示。分离的人 IPS 细胞集落多能性标志物呈阳性。

T 三四 SOX 二纳米 SSEA 四和 TRA 一 60 DNA。在人 IPS 细胞集落和饲养层细胞中均可检测到上图所示的 DPI Cos 染色。这些结果表明，使用该重编程方案获得的人 IPS 细胞表达未分化人多能干细胞的适当多能性标志物特征。

观看此视频后，您应该很好地了解如何使用逆转录病毒交易成功地将人成纤维细胞重编程为多能干细胞，确定正确的人诱导多能干细胞集落，并对 HI PC 进行初步表征。