在完整的视网膜电生理特性表达GFP的细胞群
November 14th, 2011
本文描绘出单个细胞荧光标记完好的小鼠视网膜神经人口的记录。通过使用双光子红外激发transgenetically标记的细胞是有针对性的膜片钳记录，研究他们的光反应，感受野特性和形态。
该程序的总体目标是通过使用仅在特定细胞类型中表达荧光标记物的小鼠系来研究完整视网膜中单个神经元的光响应和形态。这是通过首先解剖眼睛以获得孤立的视网膜来实现的。第二步是将视网膜置于激光扫描显微镜下，并通过双光子红外激发使细胞可视化。
然后使用微量移液器获得用于记录和染料填充的全细胞膜片钳配置。最终，这种制备允许记录细胞对光刺激的反应，并通过共聚焦显微镜揭示记录的细胞的形态。与现有方法（如来自视网膜的无引导膜片钳记录）相比，该技术的主要优点是，记录可以直观地指向荧光标记的细胞，而无需用激发光刺激视网膜。
这种方法可以帮助回答视网膜研究中的关键问题，例如给定的细胞群对视觉信息处理的贡献是什么？即使细胞群密度低且不携带任何可能有助于识别的明显形态特征。通过在实验前至少将鼠标置于黑暗中三个小时来开始此实验。
同时，按照随附手稿中的描述准备细胞外溶液，并在室温下用 carbogen 鼓泡。接下来，牺牲鼠标并用一把弯曲的虹膜剪刀给眼睛去核。将它们转移到细胞外溶液培养皿中。
然后用弹簧剪刀将其放在解剖显微镜下。沿着 serrata 光环打开眼球，去除角膜和睫状体。取出晶状体，小心地将视网膜与色素上皮分开。
之后，切断视网膜和色素上皮之间的视神经。从眼罩上取下视网膜。请注意，卷曲的视网膜内部是神经节细胞侧。
外面是感光器侧。随后，用木制牙签轻轻拉下玻璃体，从视网膜内表面去除玻璃体。然后沿视网膜周边应用短切口，以促进组织变平。
接下来，将视网膜转移到记录室，感光器面朝下。用细刷将其铺开在玻璃底部，并用不锈钢尼龙串架固定。将记录室置于直立式激光扫描显微镜下的黑暗中。
以不低于每分钟 5 毫升的速度连续超级融合视黄醛制剂。将汽车含氧细胞外溶液加热至 35 摄氏度后，显微镜位于法拉第笼内的减震空气平台上。对于电子屏蔽，用不透明的窗帘盖住笼子，以保持准备和黑暗。
我们还用红色透明薄膜屏蔽电脑显示器的光线。将红外激光器调谐到 850 至 870 纳米或更长的波长。切换到模式锁定条件并使用双光子激发来可视化表达 GFP 的细胞。
对于膜片钳记录，用含有荧光探针的细胞内溶液填充硼硅酸盐玻璃微量移液器，如随附手稿所述。然后将微量移液器插入支架中。确保参比电极与记录室中的细胞外溶液接触。
接下来，对微量移液器目标施加压力 使用 40 倍水浸入 GFP 表达细胞 目标，Omicron 细胞体位于神经节细胞层以及透明层的近端部分，然后微量移液器与目标细胞接触穿透视网膜表面的内限界膜。从微量移液器吸头排出的细胞内溶液以及内界膜与下面的视网膜组织的分离可以识别成功的渗透。细胞内溶液中的荧光染料可以在接近所需细胞时显示双光子图像中的微移液管位置。
然后释放微量移液器的压力并获得全细胞膜片钳配置。在电流钳模式下，可用的记录应提供负 50 至负 55 毫伏的膜电位，并持续至少 20 分钟。之后，呈现在计算机显示器上创建的视觉刺激。
通过将中性密度滤波器插入光束路径来调整刺激强度，并将刺激的空间位置调整到记录的细胞中心。接下来，启动刺激协议并记录光响应。使用激励发生器触发录音软件。
在光路中包括一个光电二极管，以记录刺激时间。缩回微量移液器时，小心不要拉出细胞体。当用于染料填充时，让荧光剂扩散到记录的细胞中 30 到 45 分钟。
这是在其启动子下的视网膜平面安装中表达 GFP 的细胞的示例对于酪氨酸羟化酶，可以通过 GFP 信号的亮度来区分两个群体。位于透明层的 1 型多巴胺能细胞表达弱荧光，如箭头所示。在图 A.中，第二型细胞被强烈标记，并且细胞体要么在层中如图 A 中的箭头所示，要么在神经节细胞层中移动，如图 B 所示，图 C 显示了内丛状层的第三层中 2 型细胞的树突状分层，这里显示的是注射示踪神经生物素的 2 型细胞形态的一个例子。
示踪剂后来通过与荧光标记的链霉亲和素结合来可视化，此处以洋红色显示。以下是位于神经节细胞层的 2 型细胞对白光的不同反应模式。使用三秒的延长刺激以更好地区分刺激、开始和偏移的反应成分 遵循此程序。
可以进行其他方法，如药理学实验、钙成像或免疫化学，以回答其他问题，例如给定细胞类型在视网膜回路中的功能作用。
概述
本文描述了一种使用双光子红外激发在完整的小鼠视网膜中记录单个神经元的光响应和形态的方法。该技术允许对荧光标记的细胞进行有针对性的膜片钳记录，增强了对视网膜功能的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 视网膜研究
背景
- 了解视网膜中的神经元响应对视觉处理研究至关重要。
- 荧光标记物能够识别特定的细胞类型。
- 传统方法可能无法精确地靶向细胞。
- 本研究旨在提高特定神经元群体记录的准确性。
研究目的
- 调查视网膜中单个神经元的光响应。
- 分析记录的神经元的形态。
- 增强对特定细胞群体处理视觉信息的理解。
使用的方法
- 小鼠眼睛的解剖以分离视网膜。
- 使用双光子红外激发对细胞进行可视化。
- 膜片钳记录以获得细胞响应。
- 通过共聚焦显微镜染料填充以显示细胞形态。
主要结果
- 成功记录了靶向荧光标记神经元的光响应。
- 对记录的细胞结构提供了详细的形态学见解。
- 展示了视觉靶向比传统方法的优势。
结论
- 该技术为研究视网膜神经元提供了一个强大的工具。
- 它允许研究人员解决视网膜功能和视觉处理中的关键问题。
- 未来的研究可以在这一方法基础上探索其他神经元群体。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeted electrophysiological recording of specific neuronal populations in intact tissue addresses a key bottleneck in neuroscience drug discovery: linking cellular function to circuit behavior. By enabling precise access to low-abundance or morphologically indistinct cells, this method improves target validation confidence and supports mechanistic de-risking in early discovery. It provides a translational bridge for assessing how modulation of defined neuronal subtypes affects sensory processing, informing portfolio decisions in sensory disorder therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genetically defined neuronal populations to validate therapeutic targets in sensory circuits.
- Operational Value: Reduces false-negative rates in target screening by improving access to rare or poorly characterized cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electrophysiological readouts (e.g., light-evoked currents, membrane potential shifts) for assay standardization.
- Operational Value: Supports reproducible, visually guided patch-clamp workflows compatible with automated microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links cellular phenotypes to retinal output, enabling assessment of how target engagement alters visual signal processing.
- Operational Value: Facilitates longitudinal morphology-function correlation via post-recording dye filling and confocal imaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal subtypes, supporting lead identification through functional screening, and informing preclinical validation via structure-function correlation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct measurement of neuronal light responses in genetically accessible preparations.
- Screening: Delivers reproducible, stimulus-evoked electrophysiological profiles that can be compound-tested in a targeted manner.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables such as spike frequency, current amplitude, and kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects subcellular morphology (via dye filling) to electrophysiological phenotype, supporting biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any GFP-defined neuronal population across retinal layers and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing ambiguity in cellular contribution to circuit function.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized visualization, recording, and morphologic validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional data on targets otherwise inaccessible via blind electrophysiology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of sensory therapeutics based on validated cellular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, electrophysiology, and retinal tissue preparation.
- Dependent on infrared laser systems, patch-clamp amplifiers, and perfusion maintenance at physiological temperature.
- Necessitates standardization across teams for staining, targeting, and stimulus delivery protocols.
- Adaptation to other model systems requires validation of promoter specificity and tissue optical properties.
- Limited by phototoxicity risks at high laser power and viability constraints of prolonged extracellular superfusion.
