Name: 在完整的视网膜电生理特性表达GFP的细胞群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 了解双光子红外激发结合膜片钳技术，用于完整小鼠视网膜中表达GFP的神经元光反应与形态学研究。该方法可实现靶向记录，助力视觉信息处理机制探索。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目号 WE849/16 1/2，授予 K.D. 和 R.W.）资助。我们感谢德国图宾根大学的 Thomas Euler 提供光刺激软件 QDS。

以下描述假设实验人员已具备视网膜结构、膜片钳记录和双光子显微镜技术的基本知识。有关建立和运行膜片钳装置及双光子成像系统的实用信息，请参见参考文献[7-12]。
1. 动物与组织准备
<ol>
	<li>将小鼠在暗环境中适应至少 3 小时。在此期间，准备 1-2 升细胞外液，其成分为（单位：mM）125 NaCl、2.5 KCl、1 CaCl2、1.6 MgCl2、25 NaHCO3、10 D-葡萄糖，并在室温下用含氧混合气（5 % CO2 与 O2）持续通气，使溶液 pH 值平衡至 7.4。</li>
	<li>将小鼠置于密闭容器中，通过过量 CO2 麻醉处死，随后进行颈椎脱位。该操作及后续步骤均应在黑暗中进行。可使用长波长弱光照明（我们通过 690 nm 长通滤光片阻断冷光源中的短波长光）以辅助操作者视觉，同时保持动物眼睛处于暗适应状态（小鼠在红光区域视觉能力较差）。若需在完全黑暗中操作，应使用红外照明（>800 nm）并佩戴夜视镜。</li>
	<li>使用弯头虹膜剪将眼球摘除，并将其转移至盛有细胞外液的培养皿中，置于解剖显微镜下。</li>
	<li>使用弹簧剪沿锯齿缘（视网膜与睫状体的边界）剪开眼球，去除角膜和睫状体（我们先用采血针刺穿作为剪切起点）。取出晶状体，并小心地将视网膜从色素上皮层分离。若视网膜的方向对您的研究至关重要，请参照文献 [12] 的方法进行标记。剪断视网膜与色素上皮之间的视神经，将视网膜从巩膜杯中取出。注意辨识视网膜两面的方向：卷曲视网膜的内侧为节细胞侧，外侧为光感受器侧。</li>
	<li>用木制牙签轻轻刮除视网膜内表面的玻璃体。操作时使用少量细胞外液，刚好覆盖视网膜即可。玻璃体会黏附在牙签上，可自中轴向外周方向拉出。随后，在视网膜边缘处做数个短切口，以利于组织展平。</li>
	<li>将视网膜光感受器侧朝下转移至记录室，用细毛刷将其在玻璃底面上展平，并用不锈钢丝网框固定。以相同方式处理第二片视网膜，并将其保存于通有含氧混合气的细胞外液中，保持暗适应状态，以备后续使用。</li>
</ol>
2. 记录
<ol>
	<li>在黑暗环境中将记录室安装于直立式激光扫描显微镜下，并持续灌流以含碳混合气体饱和的细胞外液（灌流速度不低于 5 ml/min），温度维持在 35 °C。显微镜配备红外敏感 CCD 相机，置于法拉第笼内的防震气浮台上，以实现电子屏蔽。用不透明帘布覆盖法拉第笼，确保视网膜制备物处于黑暗中。我们还使用红色透明薄膜遮蔽计算机显示器发出的光线。</li>
	<li>将红外激光调至 850–870 nm 或更长波长，切换至锁模模式，利用双光子激发观察表达 GFP 的细胞。通过激光扫描软件控制中性密度滤光片，衰减激光输出功率至刚好能够清晰识别荧光细胞的水平。</li>
	<li>进行电流钳模式下的膜片钳记录时，使用玻璃微电极（我们采用外径 1.5 mm、壁厚 0.225 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细管），内充细胞内液，其成分为（单位：mM）125 K-葡糖酸盐、10 KCl、0.5 EGTA、10 HEPES，用 KOH 调节 pH 至 7.4（电极电阻约为 5 MΩ）。需注意，其他实验条件如电压钳记录需使用不同的溶液。若需进行染料注射，可加入荧光探针（我们使用 10 mM Alexa Fluor 594）或示踪分子（3 % Neurobiotin）。将微电极插入电极夹持器，并确保参比电极（氯化银丝）与记录室中的细胞外液接触。</li>
	<li>对微电极施加正压，靶向定位表达 GFP 的细胞（我们使用 40 倍水浸物镜，NA 1.25）。无长突细胞的胞体位于节细胞层（在当前视网膜取向中紧贴表面）以及内核层近端部分（约在制备物内部 55–75 μm 深处）。在微电极接触靶细胞前，需穿透视网膜表面的内界膜（由胶质细胞终足构成的鞘状结构）。成功穿透可通过微电极尖端排出的细胞内液将内界膜与下方视网膜组织分离来判断，该现象可在红外透射图像中由 IR-CCD 相机观察到。</li>
	<li>通过比对双光子图像中细胞胞体的位置与 IR-CCD 相机所显示的记录电极位置，接近目标细胞。需注意，此步骤较难实现，需一定练习，因为必须在红外透射图像中识别出表达 GFP 的细胞，才能引导微电极准确接近。当微电极尖端引起细胞表面出现凹陷时（可在双光子图像中观察到），即表示正确靶向。作为替代方法，可在细胞内液中加入荧光染料（如 Alexa Fluor 594，100 μM），以在双光子图像中显示微电极位置。双光子红外激发可使该染料产生足够荧光，从而清晰辨识微电极。为此，需在激光扫描软件中调整检测范围，以覆盖红色荧光信号。</li>
	<li>释放微电极内的正压，形成全细胞膜片钳构型，进行电流钳记录。理想的记录应获得 -50 至 -55 mV 的膜电位，并持续至少 20 分钟。</li>
	<li>通过刺激软件（我们使用德国图宾根大学 Thomas Euler 开发的 QDS 软件）11 在计算机显示器上呈现视觉刺激。调整刺激的空间位置，使其以记录细胞为中心：在显示 IR-CCD 相机透射图像的显示器上标记细胞位置，并将点状刺激居中对准该点。通过在光路中插入中性密度滤光片调节刺激强度。有关显示器光谱与强度的校准，请参见参考文献 [14]。选择较长的刺激间歇（例如 15 秒），以避免适应效应。在光路中加入光电二极管，用于记录刺激时序。</li>
	<li>启动刺激程序并记录光反应（对于非放电细胞，我们采用 10 kHz 采样率，5 kHz 滤波；对于记录动作电位，建议使用更高采样率，如 20 kHz）。使用光刺激软件触发记录软件。</li>
	<li>进行染料填充时，让荧光剂在细胞内扩散 30–45 分钟后，再小心地将微电极从细胞中撤出。注意避免拉出细胞胞体。若使用非荧光示踪剂 Neurobiotin，需通过与荧光素偶联的链霉亲和素进行显色（我们采用 streptavidin-Cy3，1:400，4 °C 过夜孵育，在视网膜经 20 分钟多聚甲醛固定后；对于染料偶联研究，链霉亲和素孵育时间可延长至 3 天）。也可使用尖锐电极（>100 MΩ）进行注射，通过离子电泳将染料注入穿刺细胞（矩形脉冲：0.25–1 nA，100 ms，间隔 100 ms，总时长 3–6 分钟）。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
以下结果来源于一项针对在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（TH::GFP 小鼠）的研究13,14，该酶是儿茶酚胺合成限速步骤的催化酶。根据 GFP 信号的亮度，可区分出两个不同的细胞群体（图 2A）。表达较高 GFP 水平的细胞，其胞体位于内核层（INL，图 2A）或异位分布于节细胞层（GCL，图 2B），并在内丛状层（IPL）中部形成突触分层（图 2C）。这些细胞被鉴定为 2 型细胞14-16，尽管其细胞密度仅为 250 个细胞/mm2，仍可对其形态学特征（图 3）和电生理活动（图 4）进行系统性研究。
<img alt="红外激光、二向色镜、PMT、数据处理的光刺激装置示意图" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 实验装置示意图。双光子激发（红色虚线光路）完整视网膜中表达荧光蛋白的细胞，可通过显微移液管进行视觉定位（绿色发射光路）。视网膜接受通过显微镜聚光镜投射的光学刺激（黄色光路），并记录细胞的光反应。
<img alt="显示细胞结构和蛋白质网络分析的荧光显微镜图像，比例尺为 50 μm。" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. TH::GFP 小鼠视网膜平铺片中表达 GFP 的细胞。根据 GFP 信号的强度可区分出两个细胞群：位于内核层（INL）的 1 型细胞（DA 细胞），其荧光较弱（A，见箭头头所示）；以及强标记的 2 型细胞，其胞体位于内核层（INL）（A，见箭头所示）或移位至神经节细胞层（GCL）（B），并在内丛状层（IPL）的 S3 层具有树突分层（C）。比例尺：50 μm。
<img alt="EGFP和神经生物素标记的神经元荧光显微图像、分支可视化图，50 µm比例尺。" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3．注入示踪剂神经生物素的2型细胞的形态学特征。示踪剂随后通过链霉亲和素-Cy3结合（紫红色）进行可视化。该显微图像同时显示了GFP信号（绿色），为覆盖颗粒细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）的图像堆栈的投影。比例尺，50 μm。
<img alt="视网膜反应图；光强度与时间关系；电生理数据；光感受器活性。" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4。位于内核层（GCL）的2型细胞对光的反应。在暗视觉范围内，给予强度递增的全视野白光刺激所引发的反应模式。刺激强度以每秒每视杆细胞的光异构化事件数（Rh*/rod/s）表示。采用持续3秒的长时间刺激，以便更清晰地区分刺激开始（ON反应）和刺激结束（OFF反应）时的反应成分。

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<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
<li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li>
</ol>

小鼠的饲养和处死均遵循德国政府发布的动物实验相关法律以及机构制定的动物福利指南。

该方法可在视觉引导下研究完整视网膜中特定神经元的电学特性，同时不干扰视网膜的适应状态。该方法特别适用于目前因细胞密度较低而研究较少的细胞类型，例如大多数无长突细胞群体。双光子激发能够对组织深层区域实现高分辨率和高对比度成像17，这是精确定位并成功对内核层（INL）等细胞体密集区域中的细胞进行膜片钳记录的前提条件。
在实验条件下，分离的小鼠视网膜可保持活性3-4小时。如果将第二只视网膜在持续通入碳氧混合气（carbogen）的条件下完全避光保存，则其未漂白的感光色素可维持紫色状态，并可在完成第一只视网膜的实验后继续使用。起初，在视网膜铺片中用微电极靶向选定细胞具有一定挑战性，需要一定练习，尤其是在暗环境中操作时。在微电极内加入荧光染料可简化操作过程，因为细胞和微电极可在双光子激发下同时可见。然而，在细胞内溶液中添加成分可能会影响吉欧封接（gigaseal）的形成，或导致记录质量下降。一旦成功建立记录，良好的电生理记录可持续约1小时。
尽管红外激发光本身被视网膜感光细胞吸收的程度很低，但表达GFP的被激发细胞会发射出可见光谱范围内的光。然而，荧光分子仅在很小的焦体积内被激发，这种激发不太可能改变视网膜的适应状态。更重要的是，激发光仅用于定位，在记录光反应时可以关闭。
该方法的有效性已在特定类型的无长突细胞研究中得到证实14,18，若无此技术，对这些细胞进行电生理记录几乎只能偶然实现12。最后，该强大技术还可进一步拓展，例如结合药理学方法14、Ca2+成像19，或利用注射标记的细胞开展免疫细胞化学研究及电子显微镜分析。通过这些方式，可揭示特定细胞类型在视网膜神经环路中的功能定位。

<table><tbody><tr><td>夜视护目镜</td><td>Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany</td><td>Xtron F1</td><td>包含 800 nm 光源</td></tr><tr><td>光学滤光片</td><td>Schott AG</td><td>RG9</td><td>长通滤光片，截止波长为 690 nm</td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>弯曲型，刀片长 22 mm</td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>直型，刀片长 3 mm</td></tr><tr><td>记录室</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>200-100 500 0180 type A(TC)</td><td>聚四氟乙烯材质室体，底部安装玻璃盖玻片（约 0.15 mm；编号 200-100 500 0182）</td></tr><tr><td>灌流加热器</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>PH01, TC01</td><td>可加热灌流套管，配有温度传感器和温度控制器</td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LFS</td><td>由 Leica 共聚焦软件控制</td></tr><tr><td>防震光学平台</td><td>Newport Corp.</td><td>VH 3036W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>激光器</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td>Tsunami 锁模钛宝石激光器</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>pco AG, Kelheim, Germany</td><td>PixelFly QE</td><td>含控制软件</td></tr><tr><td>微电极玻璃毛细管</td><td>Hilgenberg, Malsfeld, Germany</td><td>1408411</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>神经生物素</td><td>Axxora</td><td>VC-SP-1120-M050</td><td>非荧光示踪剂</td></tr><tr><td>链霉亲和素-Cy3</td><td>Dianova</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>210-100 000 0010</td><td>电动 Mini25 操作单元，配有 SM-5 显示器</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>npi electronic</td><td>SEC-05LX npi</td><td></td></tr><tr><td>数据采集卡</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件 WinWCP</td><td>John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK</td><td></td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm</td></tr><tr><td>视觉刺激发生器 QDS</td><td>Thomas Euler, University of T&amp;#252;bingen, Germany</td><td></td><td>需在独立计算机上运行，控制两台显示器（用户界面显示器和刺激显示器）</td></tr><tr><td>中性密度滤光片</td><td>ITOS, Mainz, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

完整视网膜中表达gfp的细胞群体的电生理特征分析

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

在完整组织中研究特定神经元的生理特性和突触连接是一项挑战，尤其对于那些缺乏显著形态特征或细胞密度较低的细胞。这尤其适用于视网膜无长突细胞，这是一类高度多样化的中间神经元，在哺乳动物中包含约30种亚型1。尽管这类细胞通过调控视网膜输出在视觉信息处理中起着关键作用2，但由于用记录电极捕获这些细胞的概率极低，迄今为止大多数亚型尚未在功能层面上得到研究。
近年来，已有大量转基因小鼠品系可供使用，这些小鼠在特定细胞膜受体或酶的启动子调控下表达荧光标记物，例如绿色荧光蛋白（GFP），且这些启动子仅在特定组织中的一小部分神经元中具有活性3,4。因此，这些预先标记的细胞可在显微镜控制下通过定向微电极进行靶向定位，从而能够在原位系统性地研究其生理特性。in situ。然而，激发荧光标记物的同时会带来光毒性对活体组织造成损伤的风险。在视网膜组织中，该方法还面临另一个问题：激发光会有效刺激光感受器，导致视色素漂白，并使视网膜环路转入光适应状态。这些问题可通过使用锁模激光器发出的飞秒级短脉冲红外激发光得以克服。双光子激发能够提供足够的能量以激发荧光分子，同时将激发区域限制在微小的组织体积内，从而最大限度地降低光损伤风险5。此外，由于红外光（&gt;850 nm）被视色素吸收的程度极低，因此视网膜仍能对视觉刺激保持响应6。
本文中，我们展示了利用转基因小鼠视网膜获取电生理学数据的方法 原位 使用双光子激发对表达GFP的细胞进行视觉定位记录。视网膜样本在暗室中制备并保存，并可通过显微镜聚光镜投射光学刺激（图1）。光反应的膜片钳记录可结合染料填充，以揭示细胞形态，并检测是否存在通过缝隙连接介导的邻近细胞间染料耦合，从而可在多个实验层面对目标细胞进行研究。

本文描述了从小鼠完整视网膜中荧光标记的神经元群体记录单个细胞的方法。通过使用双光子红外激发，对转基因标记的细胞进行膜片钳记录，以研究其光反应、感受野特性及形态学特征。

完整视网膜中表达GFP的细胞群体的电生理特征分析

研究完整组织中特定神经元的生理特性和突触连接，对于缺乏……的细胞而言仍是一项挑战

本实验的总体目标是利用一种仅在特定细胞类型中表达荧光标记物的小鼠品系，研究完整视网膜中单个神经元的光反应特性及其形态结构。该目标首先通过解剖眼球以获得分离的视网膜来实现；第二步是将视网膜置于激光扫描显微镜下，利用双光子红外激发来观察细胞。然后使用微移液器获取全细胞膜片钳构型，用于记录和染料填充。最终，该制备方法可记录细胞对光刺激的反应，并通过共聚焦显微镜揭示所记录细胞的形态。该技术相较于现有方法（如对视网膜进行无引导的膜片钳记录）的主要优势在于，可以在不使用激发光刺激视网膜的情况下，将记录过程视觉引导至荧光标记的细胞。该方法有助于回答视网膜研究中的关键问题，例如特定细胞群体在视觉信息处理中所起的作用是什么？即使该细胞群体密度较低，且不具有任何有助于识别的显著形态学特征。开始实验前，需将小鼠在暗环境中适应至少三小时。同时，按照随附的实验方案配制细胞外液，并在室温下用碳氧混合气（carbogen）进行鼓泡处理。随后处死小鼠，使用弯头虹膜剪剪开眼球以释放内容物。将眼球转移至盛有细胞外液的培养皿中。然后将眼球置于解剖显微镜下，使用一对弹簧剪刀，沿锯状缘切开眼杯，去除角膜和睫状体。取出晶状体，并小心地将视网膜从色素上皮层分离。随后，剪断视网膜与色素上皮之间的视神经。将视网膜从眼杯中取出。注意，卷曲的视网膜内侧为节细胞侧。外侧为光感受器侧。随后，用木制牙签轻轻牵拉，将玻璃体从视网膜内表面移除。然后沿视网膜周缘进行短切口，以利于组织展平。接下来，将视网膜转移至记录室，使感光细胞侧朝下。用细刷将其铺展在玻璃底部，并用不锈钢丝网框固定。将记录室置于直立式激光扫描显微镜下的暗环境中。以不低于每分钟五毫升的速度持续灌注视网膜组织，灌注液为含碳氧的细胞外溶液，加热至35摄氏度。显微镜置于法拉第笼内的防震气浮台上，并用不透明帘布遮盖法拉第笼，以实现电屏蔽并保持组织处于黑暗环境中。我们还使用红色透明薄膜屏蔽计算机显示器发出的光线。将红外激光器调节至 850 至 870 纳米或更长的波长。切换至锁模状态，并利用双光子激发来观察表达 GFP 的细胞。进行膜片钳记录时，使用含有荧光探针的细胞内溶液填充硼硅酸盐玻璃微电极，具体成分见随附文稿。然后将微电极插入电极 holder 中。确保参考电极与记录室中的细胞外溶液接触。接下来，使用40倍水浸物镜对表达GFP的细胞进行微移液管靶向加压，Omicron细胞体位于节细胞层以及内颗粒层近端部分，在微移液管接触靶细胞之前，穿透视网膜表面的内界膜。当微移液管尖端推出细胞内溶液，并且内界膜与下方视网膜组织分离时，即可判断为成功穿透。在接近目标细胞的过程中，细胞内溶液中的荧光染料可在双光子图像中显示微移液管的位置。然后释放微移液管的压力，获得全细胞膜片钳构型。在电流钳模式下，有效的记录应显示膜电位为负50至负55毫伏，并持续至少20分钟。之后，在计算机显示器上呈现视觉刺激。通过将中性密度滤光片插入光路来调节刺激强度，并将刺激的空间位置调整至记录细胞的中心。接着，启动刺激程序并记录光反应。使用刺激发生器触发记录软件。在光路中加入一个光电二极管，以记录刺激的时间。回撤微电极时需小心，避免将细胞体一并拉出。若用于染料填充，应让荧光试剂在记录细胞内扩散 30 至 45 分钟。以下是视网膜平铺切片中在酪氨酸羟化酶启动子驱动下表达GFP的细胞示例。根据GFP信号的强弱，可区分出两种细胞群体。如图A中箭头所示，位于内核层的第一类多巴胺能细胞表达较弱的荧光。第二类细胞则被强烈标记，其胞体位于内核层（如图A中箭头所示），或异位分布于节细胞层（如图B所示）。图C显示了第二类细胞在内丛状层第三层的树突分层情况，此处展示的是一个被神经生物素示踪剂标记的第二类细胞的形态示例。通过与荧光标记的链霉亲和素结合来显示示踪剂，此处以品红色显示。以下是位于节细胞层的一种二型细胞对白光的不同反应模式。为更好地区分刺激开始和结束时的反应组分，采用了持续三秒的长时间刺激。按照此步骤进行。为了回答有关视网膜环路中特定细胞类型的生理功能等进一步问题，还可以开展药理学实验、钙成像或免疫组织化学等其他方法。

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