完整视网膜中表达GFP的细胞群体的电生理特征分析

本实验的总体目标是利用一种仅在特定细胞类型中表达荧光标记物的小鼠品系，研究完整视网膜中单个神经元的光反应特性及其形态结构。该目标首先通过解剖眼球以获得分离的视网膜来实现；第二步是将视网膜置于激光扫描显微镜下，利用双光子红外激发来观察细胞。

然后使用微移液器获取全细胞膜片钳构型，用于记录和染料填充。最终，该制备方法可记录细胞对光刺激的反应，并通过共聚焦显微镜揭示所记录细胞的形态。该技术相较于现有方法（如对视网膜进行无引导的膜片钳记录）的主要优势在于，可以在不使用激发光刺激视网膜的情况下，将记录过程视觉引导至荧光标记的细胞。

该方法有助于回答视网膜研究中的关键问题，例如特定细胞群体在视觉信息处理中所起的作用是什么？即使该细胞群体密度较低，且不具有任何有助于识别的显著形态学特征。开始实验前，需将小鼠在暗环境中适应至少三小时。

同时，按照随附的实验方案配制细胞外液，并在室温下用碳氧混合气（carbogen）进行鼓泡处理。随后处死小鼠，使用弯头虹膜剪剪开眼球以释放内容物。将眼球转移至盛有细胞外液的培养皿中。

然后将眼球置于解剖显微镜下，使用一对弹簧剪刀，沿锯状缘切开眼杯，去除角膜和睫状体。取出晶状体，并小心地将视网膜从色素上皮层分离。

随后，剪断视网膜与色素上皮之间的视神经。将视网膜从眼杯中取出。注意，卷曲的视网膜内侧为节细胞侧。

外侧为光感受器侧。随后，用木制牙签轻轻牵拉，将玻璃体从视网膜内表面移除。然后沿视网膜周缘进行短切口，以利于组织展平。

接下来，将视网膜转移至记录室，使感光细胞侧朝下。用细刷将其铺展在玻璃底部，并用不锈钢丝网框固定。将记录室置于直立式激光扫描显微镜下的暗环境中。

以不低于每分钟五毫升的速度持续灌注视网膜组织，灌注液为含碳氧的细胞外溶液，加热至35摄氏度。显微镜置于法拉第笼内的防震气浮台上，并用不透明帘布遮盖法拉第笼，以实现电屏蔽并保持组织处于黑暗环境中。

我们还使用红色透明薄膜屏蔽计算机显示器发出的光线。将红外激光器调节至 850 至 870 纳米或更长的波长。切换至锁模状态，并利用双光子激发来观察表达 GFP 的细胞。

进行膜片钳记录时，使用含有荧光探针的细胞内溶液填充硼硅酸盐玻璃微电极，具体成分见随附文稿。然后将微电极插入电极 holder 中。确保参考电极与记录室中的细胞外溶液接触。

接下来，使用40倍水浸物镜对表达GFP的细胞进行微移液管靶向加压，Omicron细胞体位于节细胞层以及内颗粒层近端部分，在微移液管接触靶细胞之前，穿透视网膜表面的内界膜。当微移液管尖端推出细胞内溶液，并且内界膜与下方视网膜组织分离时，即可判断为成功穿透。在接近目标细胞的过程中，细胞内溶液中的荧光染料可在双光子图像中显示微移液管的位置。

然后释放微移液管的压力，获得全细胞膜片钳构型。在电流钳模式下，有效的记录应显示膜电位为负50至负55毫伏，并持续至少20分钟。之后，在计算机显示器上呈现视觉刺激。

通过将中性密度滤光片插入光路来调节刺激强度，并将刺激的空间位置调整至记录细胞的中心。接着，启动刺激程序并记录光反应。使用刺激发生器触发记录软件。

在光路中加入一个光电二极管，以记录刺激的时间。回撤微电极时需小心，避免将细胞体一并拉出。若用于染料填充，应让荧光试剂在记录细胞内扩散 30 至 45 分钟。

以下是视网膜平铺切片中在酪氨酸羟化酶启动子驱动下表达GFP的细胞示例。根据GFP信号的强弱，可区分出两种细胞群体。如图A中箭头所示，位于内核层的第一类多巴胺能细胞表达较弱的荧光。第二类细胞则被强烈标记，其胞体位于内核层（如图A中箭头所示），或异位分布于节细胞层（如图B所示）。图C显示了第二类细胞在内丛状层第三层的树突分层情况，此处展示的是一个被神经生物素示踪剂标记的第二类细胞的形态示例。

通过与荧光标记的链霉亲和素结合来显示示踪剂，此处以品红色显示。以下是位于节细胞层的一种二型细胞对白光的不同反应模式。为更好地区分刺激开始和结束时的反应组分，采用了持续三秒的长时间刺激。按照此步骤进行。

为了回答有关视网膜环路中特定细胞类型的生理功能等进一步问题，还可以开展药理学实验、钙成像或免疫组织化学等其他方法。